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Biology

Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Este protocolo descreve metodologias para estabelecer organoides epiteliais endometriais de camundongos para expressão gênica e análises histológicas.

Abstract

O tecido endometrial reveste a cavidade interna do útero e está sob o controle cíclico do estrogênio e da progesterona. É um tecido composto por epitélio luminal e glandular, um compartimento estromal, uma rede vascular e uma população complexa de células imunes. Modelos de camundongos têm sido uma ferramenta poderosa para estudar o endométrio, revelando mecanismos críticos que controlam a implantação, a placentação e o câncer. O recente desenvolvimento de culturas organoides endometriais 3D apresenta um modelo de última geração para dissecar as vias de sinalização subjacentes à biologia endometrial. Estabelecer organoides endometriais a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados, analisar seus transcriptomas e visualizar sua morfologia em uma resolução de célula única são ferramentas cruciais para o estudo de doenças endometriais. Este artigo descreve métodos para estabelecer culturas 3D de epitélio endometrial de camundongos e descreve técnicas para quantificar a expressão gênica e analisar a histologia dos organoides. O objetivo é fornecer um recurso que possa ser usado para estabelecer, cultivar e estudar a expressão gênica e as características morfológicas dos organoides epiteliais endometriais.

Introduction

O endométrio - o tecido mucoso do revestimento interno da cavidade uterina - é um tecido único e altamente dinâmico que desempenha papéis críticos na saúde reprodutiva de uma mulher. Durante a vida reprodutiva, o endométrio tem o potencial de sofrer centenas de ciclos de proliferação, diferenciação e quebra, coordenados pela ação concertada dos hormônios ovarianos - estrogênio e progesterona. Estudos de camundongos geneticamente modificados descobriram mecanismos biológicos básicos que sustentam a resposta endometrial aos hormônios e o controle da implantação embrionária, a decidualização das células estromais e a gravidez1. Estudos in vitro, no entanto, têm sido limitados devido a dificuldades na manutenção de tecidos endometriais primários de camundongos não transformados em culturas tradicionais de células 2D 2,3. Avanços recentes na cultura de tecidos endometriais como sistemas de órgãos 3D, ou organoides, apresentam uma nova oportunidade para investigar vias biológicas que controlam a regeneração e diferenciação de células endometriais. Sistemas organoides endometriais de camundongos e humanos têm sido desenvolvidos a partir de epitélio endometrial puro encapsulado em várias matrizes4,5, enquanto o endométrio humano tem sido cultivado como coculturas epiteliais/estromais livres de andaimes 6,7 e, mais recentemente, como assembloides epiteliais/estromais encapsulados em colágeno8 . O crescimento e o potencial regenerativo das culturas organoides epiteliais são apoiados por um coquetel definido de fatores de crescimento e inibidores de pequenas moléculas que foram determinados empiricamente para maximizar o crescimento e a regeneração dos organoides 4,5,9. Além disso, a capacidade de congelar e descongelar organoides endometriais permite o banco a longo prazo de organoides endometriais de camundongos e humanos para estudos futuros.

Camundongos geneticamente modificados revelaram as complexas vias de sinalização que controlam a gravidez precoce e a decidualização, e têm sido usados como modelos de perda de gravidez, câncer de endométrio e endometriose. Esses estudos genéticos foram amplamente alcançados com a deleção específica de células de alelos ladeados por loxP ("floxed") usando cre recombinases que são especificamente ativas em tecidos reprodutivos femininos. Esses modelos de camundongos incluem o amplamente utilizado receptor de progesterona-cre 10, que tem forte atividade de recombinase nos tecidos epiteliais e estromais endometriais, a lactoferrina i-cre, que induz a recombinação epitelial endometrial em camundongos adultos11, ou Wnt7a-cre, que desencadeia deleção epitelial-específica em tecidos derivados de Müller12 . A cultura de tecidos endometriais a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados como organoides 3D tem proporcionado uma excelente oportunidade para investigar a biologia endometrial e facilitar a identificação de fatores de crescimento e vias de sinalização que controlam a renovação e diferenciação celular endometrial13,14. Métodos para o isolamento e cultura de tecido endometrial de camundongos são descritos na literatura e relatam o uso de várias estratégias enzimáticas para o isolamento do epitélio uterino para posterior cultura de organoides epiteliais endometriais4. Embora a literatura anterior forneça uma estrutura crítica para protocolos de cultura de organoides epiteliais endometriais 4,5,6, este artigo fornece um método claro e abrangente para gerar, manter, processar e analisar esses organoides. A padronização dessas técnicas é importante para acelerar os avanços no campo da biologia reprodutiva das mulheres. Aqui, relatamos uma metodologia detalhada para a purificação enzimática e mecânica do tecido epitelial endometrial de camundongos para a subsequente cultura de organoides endometriais em um andaime de matriz de gel. Também descrevemos as metodologias para análises histológicas e moleculares a jusante dos organoides epiteliais endometriais de camundongos encapsulados em matriz de gel.

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Protocol

O manejo de camundongos e estudos experimentais foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine e diretrizes estabelecidas pelo NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Isolamento do epitélio uterino de camundongos usando métodos enzimáticos e mecânicos

NOTA: Esta seção descreve as etapas necessárias para estabelecer, passar, congelar e descongelar organoides endometriais epiteliais de camundongos usando um andaime de matriz de gel. Estudos anteriores determinaram que culturas ótimas de organoides endometriais de camundongos são estabelecidas a partir de camundongos durante a fase4 do cio, o que pode ser determinado pelo exame citológico de um swab vaginal15. Camundongos WT fêmeas adultas (6-8 semanas de idade, híbrido C57BL/6J e 129S5/SvEvBrd) foram utilizados para todos os experimentos. Os camundongos foram humanamente eutanasiados de acordo com as diretrizes aprovadas pela IACUC usando sedação de isoflurano seguida de desarticulação cervical. Uma vez que os ratos são sacrificados, os seguintes passos devem ser seguidos. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados aos materiais e soluções utilizados neste protocolo.

  1. Deixe a matriz de gel descongelar no gelo por aproximadamente 1-2 h antes do uso.
  2. Para dissecar o rato, use uma tesoura para fazer uma incisão de linha média no abdômen e descasque suavemente a pele para expor a camada peritoneal subjacente. Use fórceps para segurar a camada peritoneal e fazer incisões laterais com a tesoura para expor o conteúdo abdominal.
    1. Localize os chifres uterinos movendo suavemente as almofadas de gordura abdominal para o lado. Disseque-os primeiro segurando-os na junção cervical e usando uma tesoura para cortar ao longo da gordura mesentérica. Após a dissecção do útero do rato, remova completamente o tecido adiposo do chifre uterino com uma pequena tesoura.
      NOTA: Mantenha a esterilidade durante o isolamento celular, esterilizando todas as ferramentas de cirurgia antes do uso, pulverize o abdômen do rato com etanol a 70% e execute todas as etapas após a dissecção sob um capuz de cultura de tecido estéril.
  3. Corte cada chifre uterino em pequenos fragmentos, cada um medindo aproximadamente 4-5 mm.
  4. Coloque todos os fragmentos uterinos de um útero em um poço de uma placa de 24 poços contendo 0,5 mL de tripsina a 1%. Permita que a solução enzimática entre no lúmen uterino, causando separação enzimática do epitélio endometrial do estroma subjacente.
  5. Incubar a placa de 24 poços em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 °C por aproximadamente 1 h.
  6. Após a incubação de 1 h, transferir os fragmentos uterinos para uma placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 1 mL de solução tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco.
  7. Sob um microscópio de dissecção, use pinça fina e uma pipeta de 1 mL para separar mecanicamente o epitélio uterino do tubo uterino. Enquanto segura uma extremidade de um fragmento uterino com a pinça, passe suavemente a ponta da pipeta longitudinalmente através do fragmento, espremendo o epitélio para fora da outra extremidade do tubo uterino. Observe as folhas epiteliais separadas do fragmento uterino sob o microscópio de dissecção.
  8. Use a pipeta de 1 mL para coletar e transferir suavemente as folhas epiteliais para um tubo de 1,5 mL.
  9. Repita o processo para os fragmentos uterinos restantes, transferindo todas as folhas epiteliais para o mesmo tubo de coleta.
  10. Pellet as folhas epiteliais dissociadas por centrifugação por 5 min a 375 × g.
  11. Remova cuidadosamente o sobrenadante para evitar perturbar a pastilha celular.
  12. Ressuscite o pellet celular em 0,5 mL de 2,5 mg/mL de colagenase + 2 mg/mL de solução de DNase. Pipetar para cima e para baixo aproximadamente 10x, ou até que uma suspensão de célula única seja alcançada.
  13. Adicionar 0,5 mL de DMEM/F12 + 10% de soro fetal bovino (FBS) + antibióticos e centrifugar as células por 5 min a 375 × g.
    NOTA: Para obter informações adicionais sobre o antibiótico de amplo espectro utilizado para a cultura de células, consulte a Tabela de Materiais.
  14. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos. Centrifugar as células durante 5 minutos a 375 × g.

2. Processamento do compartimento estromal

NOTA: Esta seção descreve os protocolos necessários para isolar o compartimento estromal do endométrio de camundongos. Dado o crescente interesse em experimentos de co-cultura epitelial/estromal, é importante ser capaz de processar as populações de células estromais, além das células epiteliais que gerarão organoides.

  1. Uma vez que todo o epitélio tenha sido separado enzimática e mecanicamente dos fragmentos uterinos, as estruturas remanescentes semelhantes a tubos são os compartimentos "estromais/miometriais". Recolher este tecido numa colagenase de 2,5 mg/ml + DNase de 2 mg/ml em solução de HBSS.
  2. Incubar a amostra estromal/miometrial num agitador de 37 °C durante 15 min.
  3. Após a incubação, adicione 500 μL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos por rato e filtre os fragmentos não dissociados através de um filtro de células de 40 μm.
  4. Pellet as células por centrifugação durante 5 min a 375 × g.
  5. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos. Adicione a mistura gota a gota a 10 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos em uma placa de cultura celular de 10 cm. Incubar a placa a 37 °C numa incubadora de cultura de células humidificadas.
  6. Para gerar coculturas de células epiteliais e estromais endometriais de camundongos, seguir os métodos descritos para organoides endometriais humanos utilizando sistemas de matriz de colágeno ou livres de andaimes 6,8.
    NOTA: Embora essas técnicas ainda não tenham sido publicadas para camundongos, elas podem ser adaptadas com base nos protocolos publicados com endométrio humano.

3. Encapsulamento do epitélio uterino em matriz de gel para estabelecer organoides

NOTA: Mantenha a matriz de gel no gelo até que esteja pronta para ser usada.

  1. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um volume de matriz de gel que seja 20x maior que o do pellet celular (ou seja, se o pellet celular for de 20 μL, ressuspenda as células com 400 μL de matriz de gel). Ressuspenda o pellet com cuidado para evitar a introdução de bolhas.
  2. Deixe a matriz de gel/suspensão celular assentar à temperatura ambiente por ~10 min.
  3. Uma vez que a matriz de gel/suspensão celular se torne um gel semissólido, use uma micropipeta P200 com uma ponta larga de 200 μL para aspirar suavemente 25 μL da matriz de gel/suspensão celular. Dispense três cúpulas separadas de 25 μL por poço de uma placa de 12 poços e permita que a matriz de gel cure por 15 minutos em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 °C.
  4. Após a cura da matriz de gel, adicione 750 μL de meio organoide a cada poço contendo cúpulas de matriz de gel. Incubar a 37 °C numa incubadora de cultura de tecidos humidificada.
    NOTA: A formulação do meio organoide é anotada na Tabela de Materiais. Os organoides geralmente se formam dentro de 4 dias após a cultura inicial.

4. Análise da expressão gênica de organoides endometriais após tratamento com estradiol

NOTA: Esta secção descreve os métodos utilizados para traçar o perfil da expressão génica de organoides epiteliais endometriais utilizando qPCR em tempo real após o tratamento com estradiol (E2; ver Tabela 1). Como o endométrio está sob o controle cíclico do hormônio ovariano E2, testar a capacidade de resposta dos organoides ao E2 é uma medida importante da função fisiológica. Obtivemos RNA de alta qualidade e geramos mRNA suficiente para traçar o perfil da expressão gênica usando qPCR e/ou sequenciamento de RNA de nossos organoides epiteliais endometriais. Esta seção descreve como coletar organoides e processá-los para análise a jusante da expressão gênica. O meio de tratamento selecionado reflete o utilizado para tratar células endometriais cultivadas. No entanto, deve-se ressaltar que esse meio de tratamento pode ser otimizado de acordo, como é feito para o tratamento de culturas 3D endometriais humanas com hormônios 8,16,17.

  1. Cultive os organoides endometriais conforme descrito acima.
  2. Remova o meio organoide e substitua-o por 750 μL de meio de fome quatro dias após a semeadura. Incubar durante a noite.
  3. Na manhã seguinte, remova o meio de fome. Adicionar 750 μL de meio de tratamento contendo um veículo ou 10 nM E2. Incubar por 48 h.
  4. Prossiga com o isolamento de RNA seguindo o protocolo do fabricante do kit.

5. Análise histológica dos organoides endometriais

NOTA: A imagem das características morfológicas dos organoides endometriais é fundamental para avaliar o efeito celular de fatores de crescimento, manipulações genéticas ou inibidores de pequenas moléculas. Esta seção descreve as técnicas utilizadas para fixar, processar e visualizar organoides epiteliais endometriais usando corantes histológicas e coloração imunofluorescente de anticorpos.

  1. Preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de paraformaldeído a 4% em 1x PBS. Coloque-os no gelo.
  2. Aspirar o meio dos poços da placa de 12 poços que contém os organoides.
  3. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL com uma ponta de corte, transfira 500 μL de paraformaldeído a 4% para cada poço e desprenda suavemente as cúpulas da matriz de gel do fundo da placa.
  4. Aspirar suavemente todas as cúpulas da matriz de gel para a ponta da pipeta e transferir para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  5. Fixar os organoides colocando-os num rotador a 4 °C durante a noite.
  6. Na manhã seguinte, centrifugar o tubo a 600 × g por 5 min para peletizar os organoides. Remova suavemente a solução de paraformaldeído a 4% com uma pipeta e descarte o produto. Lave os organoides 2x com etanol a 70%.
  7. Após a última lavagem, remova todos, exceto 50-100 μL de etanol do tubo. Deixe o tubo de lado.
  8. Coloque um tubo de gel de processamento de amostra em banho-maria e micro-ondas por ~ 30 s para derreter o gel. Certifique-se de que o gel de processamento da amostra não ferva monitorando a consistência do gel.
    NOTA: Uma vez que o gel de processamento da amostra é derretido, mas não fervendo quente, trabalhe rapidamente para encapsular os organoides.
  9. Transfira gel de processamento de amostra suficiente para cobrir toda a superfície do molde (aproximadamente 250 μL).
  10. Enquanto o gel de processamento da amostra ainda está fundido, transfira rapidamente os 50 μL de solução de etanol a 70% contendo os organoides. Certifique-se de que os organoides sejam afundados ou empurrados para a parte inferior do molde.
  11. Coloque o molde de histologia em um balde de gelo e permita que o gel de processamento da amostra esfrie e solidifique.
  12. Uma vez que o gel de processamento da amostra esteja completamente seco, transfira cuidadosamente o quadrado do gel de processamento da amostra para um saco de amostra, mantendo o controle do plano onde os organoides estão localizados.
  13. Colocar a bolsa em um histológico e processá-la utilizando métodos padronizados utilizados para fixação de formalina e incorporação de tecidos de parafina18.
  14. Após a fixação e incorporação em parafina, seção em seções de 5 μm usando um micrótomo19. Prossiga com os procedimentos padrão de coloração de hematoxilina e eosina (H & E) ou imunocoloração, conforme descrito abaixo.

6. Coloração de hematoxilina e eosina

  1. Desparafinizar as seções da seguinte forma: xileno, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% de etanol, 3 min; 60% etanol, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min em hematoxilina; água da torneira (3 x 5 s); 1 min em eosina.
  2. Desidratar os cortes da seguinte forma: 60% de etanol, 3 min; 80% de etanol, 3 min; 95% de etanol, 3 min; 100% etanol, 2 x 3 min; xileno, 2 x 15 min.
  3. Monte usando o meio de montagem.

7. Coloração por imunofluorescência

  1. Desparafinizar as seções conforme descrito na etapa 6.1.
  2. Realizar a recuperação de antígenos
    1. Submerja as lâminas em solução de recuperação de antígeno em um recipiente seguro para micro-ondas.
    2. Micro-ondas em fogo alto por 20 min, usando intervalos de 5 min para garantir que a solução não ferva.
  3. Após a conclusão da etapa de recuperação de antígeno de 20 minutos, permita que as lâminas esfriem no gelo por 40 minutos enquanto ainda estão submersas no tampão de recuperação de antígenos.
  4. Lave as lâminas com 1x TBST por 3 min
  5. Bloquear as lâminas incubando em BSA a 3% em TBST por 1 h à temperatura ambiente.
  6. Incubação de anticorpos primários
    1. Diluir o anticorpo em BSA a 3% em TBST (1:50-1:1.000, dependendo de Ab).
    2. Incubar durante a noite a 4 °C numa câmara humidificada.
    3. Lave 3 x 5 min com TBST.
  7. Incubação secundária de anticorpos
    1. Diluir o anticorpo em 3% de BSA (em TBST) (1:250) ou em soro de burro normal a 5%.
    2. Incubar por 1 h à temperatura ambiente (RT) no escuro, uma vez que o anticorpo é conjugado a um fluoróforo.
  8. Coloração nuclear
    1. Diluir 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:1.000 em TBST.
    2. Incubar por 5 min no RT.
    3. Lave 2 x 5 min com TBST.
  9. Montagem
    1. Use uma gota de meio de montagem para montar a tampa.
    2. Sele a tampa usando esmalte no dia seguinte.

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Representative Results

Imagens de contraste de fase de organoides endometriais de camundongos
Estabelecemos organoides do epitélio endometrial de camundongos WT, conforme descrito no protocolo anexado (ver diagrama na Figura 1). Após a dissociação enzimática do epitélio endometrial do rato, as folhas epiteliais foram separadas mecanicamente das células estromais uterinas e posteriormente dissociadas com colagenase para gerar uma suspensão unicelular. Se realizado corretamente, este método de separação de células epiteliais e estromais deve produzir amostras com contaminação não superior a 10%-15% do tipo de célula oposta (ver imagens de imunofluorescência na Figura 2). O pellet de células epiteliais foi então ressuspenso em matriz de gel, deixado gelificar à temperatura ambiente e banhado em cúpulas de 25 μL em placas de cultura de tecidos. Depois que as cúpulas da matriz de gel se solidificaram, elas foram revestidas com meio organoide e deixadas crescer. Observamos tipicamente que as células epiteliais endometriais se reuniram em organoides dentro de 3-4 dias, como ilustrado na Figura 3. Os organoides foram mantidos em cultura, com alterações da mídia ocorrendo a cada 3 dias, e passando a cada 5-7 dias.

Imagem de organoides endometriais de camundongos utilizando coloração histológica e imunofluorescente
Para analisar a morfologia dos organoides epiteliais de camundongos, adaptamos métodos utilizados para o encapsulamento de aspirados celulares de agulha fina utilizando gel de processamento de espécime20. Isso permite a preservação da morfologia organoide endometrial e o encapsulamento em uma matriz que pode ser submetida a processamento em preparação para a incorporação de parafina. O gel de processamento de espécimes é um ágar modificado que é amplamente utilizado em laboratórios de patologia clínica para a análise de aspirados de agulha fina e tem sido utilizado para encapsular organoides vaginais21,22. Depois que a mistura gel/organoide de processamento da amostra se solidifica, ela pode ser processada, corada e fotografada com técnicas normalmente usadas para analisar tecidos. Na Figura 4A,B, mostramos que os organoides endometriais seccionados em parafina fixada em formalina podem ser visualizados por coloração de hematoxilina e eosina, que exibem a camada única de epitélio e centros ocos - os lúmens - dos organoides. Certos organoides também contêm secreções no lúmen, indicando que os organoides adquirem as propriedades funcionais das células epiteliais glandulares. Também descrevemos técnicas para visualização dos organoides utilizando imunocoloração (Figura 4C,D); organoides endometriais seccionados foram incubados com um anticorpo primário de citoqueratina 8 (TROMA-1) e um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anti-rato secundário-594). Os núcleos foram então visualizados com DAPI, e as lâminas foram fotografadas usando um microscópio de fluorescência. Observamos que todas as células dos organoides eram positivas para citoqueratina 8 e continham DAPI, indicando que a fixação, incorporação e processamento dos organoides endometriais é compatível com a imunocoloração baseada em anticorpos.

Extração de RNA e análise da expressão gênica
Para determinar a resposta de expressão gênica de organoides endometriais, permitimos que organoides endometriais de camundongos WT crescessem por 4 dias após a primeira passagem. Na noite anterior ao tratamento, o meio organoide endometrial foi alterado para meio de fome. Os organoides foram então tratados em poços triplicados (cada poço contendo três cúpulas) com veículo (etanol; igual volume em solução utilizado para estradiol) ou estradiol 10 nM (E2) por um total de 48 h. Após 48 h, o meio foi removido e os organoides foram processados para extração de RNA. Aproximadamente 4 μg de RNA podem ser obtidos de um total de duas cúpulas de cada poço, e 1 μg de RNA foi usado para transcrever cDNA. A amplificação dos genes que codificam a lipocalina 2 (Lcn2), a lactoferrina (Ltf) e o receptor de progesterona (Pgr) foi realizada por meio de PCR quantitativa em tempo real (Figura 5 e Tabela 1)23,24,25. Como esperado, observou-se que a expressão de Lcn2, Ltf e Pgr aumentou nos organoides epiteliais após estimulação com 10 nM E2 (Figura 5). Assim, esses resultados mostram que os organoides epiteliais endometriais podem ser usados com sucesso para medir as alterações na expressão gênica em resposta ao E2.

Figure 1
Figura 1: Procedimentos utilizados para estabelecer organoides endometriais. O diagrama descreve os principais passos que foram seguidos para (A) estabelecer e (B) passar organoides epiteliais do endométrio de camundongos. (A) Os métodos incluem a dissociação enzimática e mecânica do epitélio endometrial do útero de camundongo, seguida de dispersão unicelular e encapsulamento do epitélio em uma matriz de gel. Para obter os tecidos uterinos para dissociação enzimática, os ovários e ovidutos são removidos dos chifres uterinos com tesouras finas, cortados lateralmente em fragmentos de 4-5 mm e, em seguida, colocados na solução enzimática. Após a incubação enzimática, o epitélio endometrial é mecanicamente separado do estroma subjacente sob um microscópio usando pinça e uma pipeta para "espremer" o epitélio do tubo uterino. O epitélio é ainda digerido em células epiteliais usando uma curta incubação em colagenase, seguida de encapsulamento em uma matriz de gel. (B) A passagem dos organoides endometriais requer dissociação mecânica em meio frio e centrifugação para liberar os organoides da matriz e gerar fragmentos organoides menores. Uma vez que os organoides foram liberados da matriz e dissociados mecanicamente em fragmentos menores, eles são encapsulados na matriz e rechapeados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imunocoloração de populações isoladas de epitélio endometrial e células estromais. Imagens de imunofluorescência mostram populações de células epiteliais e estromais das frações de células epiteliais (A,B) e (C,D) de células estromais após separação enzimática e mecânica do útero. A citoqueratina 8 (um marcador de células epiteliais) é mostrada em vermelho, a vimentina (um marcador de células estromais) é mostrada em verde e o DAPI (um marcador nuclear) é mostrado em azul. Barras de escala = 100 μm (A,C), 20 μm (B,D). Abreviaturas: CK8 = citoqueratina 8; VIM = vimentina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Formação de organoides endometriais de camundongos WT ao longo de 4 dias. O epitélio endometrial foi isolado de um camundongo WT e usado para gerar organoides. (A) Imagem de contraste de fase das células epiteliais encapsuladas na matriz de gel imediatamente após a digestão (dia 0). (B,C) Alguns pequenos organoides podem ser observados no dia 1 (B) e no dia 2 (C) da cultura. (D) Organoides epiteliais maiores e maduros podem ser observados no 3º dia de cultura. As imagens foram capturadas com objetiva 5x; barras de escala = 200 μm. Abreviação: WT = tipo selvagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise histológica dos organoides endometriais . (A,B) Os organoides epiteliais endometriais FFPE foram seccionados e corados com H&E. (C,D) Os organoides epiteliais FFPE foram imunocorados com o marcador de células epiteliais citoqueratina 8 (vermelho). Os núcleos celulares foram corados com DAPI (azul). Barras de escala = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B,D). Abreviaturas: FFPE = parafina fixada em formalina incorporada; H&E = hematoxilina e eosina; CK8 = citoqueratina 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise da expressão gênica de organoides endometriais de camundongos. Organoides epiteliais endometriais de camundongos WT foram cultivados por 4 dias em meio de crescimento organoide, seguidos de tratamento com veículo ou 10 nM E2 por 48 h em DMEM/F12 suplementado com FBS despojado de carvão a 2%. (A,B) Imagens de contraste de fase dos organoides WT de camundongos após tratamento com veículo (A) ou 10 nM E2 (B). (C-E) Análise qPCR em tempo real de organoides endometriais epiteliais tratados com veículo ou 10 nM E2. Expressão de genes regulados por E2, lipocalina 2 (Lnc2), lactoferrina (Ltf) e receptor de progesterona (Pgr). As barras representam a média ± EPM, analisada pelo teste t bicaudal; *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Repetido com organoides derivados de n = 3 camundongos WT por condição. Barras de escala = 200 μm (A,B). Abreviaturas: WT = tipo selvagem; E2 = estradiol; qPCR = PCR quantitativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sequência do Primer Avançado (5'-3') Reverso (5'-3')
Lipocalina 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrina (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterona (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT
A mistura de PCR contém:
2x SYBR Verde
Primer Fwd de 0,5 μM
Primer Rev de 0,5 μM
cDNA
RNAse/DNAse-Free H2O
Condições do Cycler:
Temperatura Hora Ciclos
Segurar 95 °C 10 min 1
Desnaturar 95 °C 15 s 40
Estender 60 °C 60 anos

Tabela 1: Sequências de primer e condições de PCR.

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Discussion

Aqui, descrevemos métodos para gerar organoides epiteliais endometriais a partir do endométrio de camundongos e os protocolos rotineiramente utilizados para sua análise a jusante. Os organoides endometriais são uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos que controlam doenças relacionadas ao endométrio, como endometriose, câncer de endométrio e falha de implantação. Estudos de referência publicados em 2017 relataram as condições para a cultura de culturas de longo prazo e renováveis de organoides endometriais de epitélio de camundongos e humanos 4,5. Embora os organoides tenham sido amplamente utilizados para estudar vias biológicas em outros sistemas, o estudo do tecido endometrial in vitro tem sido limitado pela ausência de um modelo adequado para estudar o epitélio primário não transformado em cultura26. Organoides endometriais derivados do endométrio humano e de camundongo foram estabelecidos com sucesso usando condições tipicamente usadas para cultivar organoides de outros tecidos de órgãos, como intestino, rim e pulmão, e incorporando-os em um andaime de matriz extracelular composto de matriz de gel4. Desde esses relatos iniciais, o uso de organoides endometriais para estudar a biologia do endométrio aumentou significativamente na comunidade científica.

Ao modificar um método previamente publicado de isolamento epitelial do útero de camundongo27,28, este protocolo destaca exclusivamente os principais passos para isolar o útero de camundongo, colocando diretamente o tecido em uma solução enzimática, ignorando a necessidade de transecter o útero ou usar filtração. Utilizando este método, obtivemos epitélio com ~85%-90% de pureza, determinado pela citoqueratina 8 e imunocoloração de vimentina (Figura 2). Este protocolo também descreve claramente os principais detalhes para o encapsulamento das células epiteliais isoladas na matriz de crescimento para geração, manutenção e passagem dos organoides. As imagens da Figura 4 e nossos estudos inéditos identificaram a presença de mucinas e células glandulares (ou seja, FOXA2-positivas) em nossas culturas organoides29. Estes indicam que o método aqui apresentado é eficaz para o isolamento de populações de células glandulares e luminal-epiteliais do endométrio de camundongos.

As principais limitações para o crescimento desses organoides incluem o uso da matriz comercial (ou seja, Matrigel), que pode resultar em variações de lote para lote e contém fatores de crescimento que podem afetar o crescimento organoide. Além disso, embora esses organoides contenham epitélio uterino puro, o uso de tipos adicionais de células endometriais (isto é, imunes, estromais) tem sido recentemente descrito em sistemas organoides humanos do endométrio 8,30. Outros grupos demonstraram a capacidade de isolar células epiteliais luminais e glandulares para culturas organoides do útero de camundongos14.

Esta abordagem usa tecidos de um pequeno modelo animal que é relativamente comum e disponível para a maioria dos pesquisadores; a geração de organoides endometriais a partir de modelos animais maiores, ou humanos, pode representar desafios éticos ou técnicos, que podem ser superados usando técnicas baseadas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Tais tecnologias foram previamente descritas para tecidos endometriais31, outros tecidos do trato reprodutivo 32 e têm sido efetivamente utilizadas para estudar as interações endometrial/placentária in vitro33. Assim, o uso de iPSCs como fonte de células estromais e epiteliais endometriais do endométrio de humanos e outros modelos de animais de grande porte representa uma fonte renovável e acessível para a geração de organoides endometriais.

Embora o rato seja um modelo amplamente utilizado para o estudo da implantação, existem diferenças evolutivas fundamentais no mecanismo de implantação entre camundongos e humanos que devem ser observadas. Por exemplo, enquanto o implante intersticial é caracterizado por invasão trofoblástica profunda através do epitélio luminal para o estroma subjacente, o mecanismo do processo de invasão difere entre camundongos e primatas34. Em camundongos, a invasão de trofoblastos através do epitélio luminal envolve apoptose ou entose 35,36, enquanto os trofoblastos migram entre o epitélio luminal para o estroma subjacente em primatas 34,35.

Fornecer aos organoides endometriais os fatores de crescimento necessários para apoiar a automontagem e a renovação a longo prazo é essencial para obter culturas organoides endometriais que recapitulem o tecido nativo. A composição complexa do meio para os organoides endometriais indica as múltiplas vias de sinalização que contribuem para as características das células epiteliais e surgiriam de fontes parácrinas e autócrinas. O compartimento estromal do endométrio é um conjunto complexo de numerosos tipos de células, incluindo células estromais semelhantes a fibroblastos, endotélio, macrófagos e outras células imunes especializadas que estão em constante mudança em resposta ao estrogênio e à progesterona37.

Por exemplo, o meio de cultura organoide contém fatores que ativam a sinalização WNT/β-catenina nos organoides, como WNT3a e R-Spondin. Estudos em camundongos demonstraram que os ligantes WNT são críticos para o desenvolvimento uterino e função glandular; portanto, a ativação dessa via de sinalização é fundamental para o desenvolvimento e manutenção dos organoides38,39. R-Spondin amplifica a sinalização WNT e é o ligante do receptor acoplado à proteína G contendo repetição rico em leucina (LGR5)40. As culturas organoides endometriais também requerem inibição das vias de sinalização do fator transformador de crescimento β (TGFβ) e da proteína morfogenética óssea (BMP). Por exemplo, o meio de cultura organoide endometrial contém o inibidor de BMP, Noggin, uma proteína secretada que se liga e inativa BMP2, BMP4 e BMP741. O inibidor farmacológico, A83-01, também está presente no meio organoide endometrial. A83-01 é um inibidor de moléculas pequenas com alta especificidade para os receptores ALK4, ALK5 e ALK742. ALK4/5/7 são receptores tipo 1 da família de sinalização TGFβ que se ligam e transmitem sinais provocados por ligantes como TGFβ, activina ou nodal. Os sinais de BMP são críticos para a manutenção de células-tronco em tecidos como o intestino43 e folículos pilosos44. A inibição da sinalização do TGFβ contribui para a capacidade proliferativa e a eficiência de formação de colônias de células-tronco mesenquimais endometriais45, o que ocorre pelo remodelamento de regiões-chave na cromatina46. Assim, a modulação dessas duas principais vias de sinalização, BMP e TGFβ, é necessária para manter as culturas organoides com capacidade de autorrenovação.

Embora não seja exibido aqui, descobrimos que a cultura a longo prazo dos organoides de camundongos com o inibidor de ALK4/5/7, A83-01, levou a alterações morfológicas nos organoides epiteliais após três ou quatro passagens contínuas (Kriseman et al., em revisão). As alterações morfológicas nos organoides epiteliais lembraram os organoides epiteliais "densos" descritos por Boretto et al.4, onde o desenvolvimento de células mais secretoras ocorreu devido à diminuição da secreção parácrina de ligantes WNT. Assim, é provável que as vias de sinalização TGFβ e WNT se cruzem para controlar a regeneração e diferenciação dos organoides epiteliais endometriais.

Estudos recentes têm gerado sistemas de cocultura epitelial/estromal endometrial 3D a partir de tecidos humanos 7,8,16. Um método de co-cultura utiliza um sistema livre de andaimes, no qual as células epiteliais e estromais endometriais são combinadas e podem se reunir em estruturas 3D em um poço livre de andaimes usando um meio de cultura definido. Esses organoides epiteliais/estromais endometriais 3D não apenas expressam receptores de estrogênio, progesterona e andrógeno, mas também recapitulam fielmente a resposta aos hormônios ovarianos - estrogênio e progesterona 6,7. Em outro método de co-cultura, utilizado em um estudo de Rawlings et al., organoides epiteliais endometriais são combinados com células estromais em uma matriz de colágeno e cultivados em um meio organoide modificado8. Esses organoides co-cultivados epitelial/estromais, ou assemblóides, se organizam em um sistema 3D suspenso, onde as células estromais cercam estruturas semelhantes à glândula epitelial.

A maioria dos organoides endometriais é cultivada em matriz de gel reduzida do fator de crescimento; no entanto, a presença de compostos ativos na matriz pode exercer respostas celulares indesejadas dentro dos organoides. Para superar essa limitação, organoides foram estabelecidos em andaimes livres de matriz de gel, como moldes de agarose impressos em 3D, nos quais organoides individuais podem se auto-montar6. Outros grupos desenvolveram hidrogéis sintéticos para servir como matrizes 3D para a cultura de organoides endometriais47. Esses organoides se reúnem em estruturas 3D com polaridade apicobasal e também podem ser combinados com células estromais do endométrio para formar organoides complexos48. Como os organoides podem ser usados com sucesso para cultivar tecidos endometriais primários humanos e de camundongos não transformados de maneiras que as culturas de células 2D não podem, não há dúvida de que os organoides endometriais avançarão no campo da saúde reprodutiva das mulheres e serão uma ferramenta incrível para estudar patologias reprodutivas, como perda recorrente de gravidez, endometriose e câncer de endométrio16, 49,50.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos à Dra. Stephanie Pangas e ao Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) pela leitura crítica e edição do nosso manuscrito. Os estudos foram apoiados pelas bolsas R00-HD00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) e R01-HD110038 (M.M.M.), e pelo NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. possui um Prêmio de Gravidez de Próxima Geração do Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

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Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

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