Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Etablering av 3D Endometrial Organoids fra Mouse Uterus

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver metoder for å etablere endometrielle organoider for museepitelorganer for genuttrykk og histologiske analyser.

Abstract

Endometrial vev linjer det indre hulrommet i livmoren og er under syklisk kontroll av østrogen og progesteron. Det er et vev som består av luminal- og kjertelepitel, et stromalt rom, et vaskulært nettverk og en kompleks immuncellepopulasjon. Musemodeller har vært et kraftig verktøy for å studere endometrium, og avslører kritiske mekanismer som styrer implantasjon, placentasjon og kreft. Den nylige utviklingen av 3D endometrial organoid kulturer presenterer en state-of-the-art modell for å dissekere signalveiene som ligger til grunn for endometrisk biologi. Etablering av endometrieorganoider fra genetisk utviklede musemodeller, analyse av transkriptomer og visualisering av morfologi ved encellet oppløsning er avgjørende verktøy for studiet av endometriesykdommer. Dette papiret skisserer metoder for å etablere 3D-kulturer av endometrisk epitel fra mus og beskriver teknikker for å kvantifisere genuttrykk og analysere organoidens histologi. Målet er å gi en ressurs som kan brukes til å etablere, dyrke og studere genuttrykk og morfologiske egenskaper av endometrielle epitelorganoider.

Introduction

Endometrium - det indre slimhinnen i livmorhulen - er et unikt og svært dynamisk vev som spiller kritiske roller i en kvinnes reproduktive helse. Under reproduktiv levetid har endometrium potensialet til å gjennomgå hundrevis av sykluser av spredning, differensiering og sammenbrudd, koordinert av den samordnede virkningen av eggstokkhormonene - østrogen og progesteron. Studier av genmodifiserte mus har avdekket grunnleggende biologiske mekanismer som ligger til grunn for endometrieresponsen på hormoner og kontroll av embryoimplantasjon, stromalcelledecidualisering og graviditet1. In vitro-studier har imidlertid vært begrenset på grunn av vanskeligheter med å opprettholde ikke-transformert primært museendometrievev i tradisjonelle 2D-cellekulturer 2,3. Nylige fremskritt i kulturen av endometrievev som 3D-organsystemer, eller organoider, presenterer en ny mulighet til å undersøke biologiske veier som styrer endometriecelleregenerering og differensiering. Mus og humane endometriske organoidsystemer er utviklet fra rent endometrieepitel innkapslet i forskjellige matriser4,5, mens humant endometrium har blitt dyrket som stillasfrie epitel-/stromale kokulturer6,7, og mer nylig som kollageninnkapslede epitelial/stromale assembloider8 . Veksten og det regenerative potensialet til epitelorganoidkulturer støttes av en definert cocktail av vekstfaktorer og små molekylhemmere som er empirisk bestemt for å maksimere vekst og regenerering av organoidene 4,5,9. Videre tillater evnen til å fryse og tine endometrieorganoider den langsiktige banken av endometrieorganoider fra mus og mennesker for fremtidige studier.

Genmodifiserte mus har avslørt de komplekse signalveiene som styrer tidlig graviditet og decidualisering, og har blitt brukt som modeller for graviditetstap, endometriekreft og endometriose. Disse genetiske studiene er i stor grad oppnådd med cellespesifikk delesjon av loxP-flankerte alleler ("floxed") ved bruk av cre recombinaser som er spesielt aktive i kvinnelig reproduktivt vev. Disse musemodellene inkluderer den mye brukte progesteronreseptor-cre10, som har sterk rekombinaseaktivitet i endometrieepitel- og stromalvevet, laktoferrin i-cre, som induserer endometrisk epitelrekombinasjon hos voksne mus11, eller Wnt7a-cre, som utløser epitelspesifikk delesjon i Müllerian-avledet vev12 . Dyrking av endometrievev fra genetisk utviklede musemodeller som 3D-organoider har gitt en utmerket mulighet til å undersøke endometrisk biologi og lette identifisering av vekstfaktorer og signalveier som styrer endometriecellefornyelse og differensiering13,14. Metoder for isolering og kultur av mus endometrievev er beskrevet i litteraturen og rapporterer bruken av ulike enzymatiske strategier for isolering av livmorepitel for etterfølgende dyrking av endometriske epitelorganoider4. Mens tidligere litteratur gir et kritisk rammeverk for endometrieepitelorganoidkulturprotokoller 4,5,6, gir dette papiret en klar, omfattende metode for å generere, vedlikeholde, behandle og analysere disse organoider. Standardisering av disse teknikkene er viktig for å akselerere fremskritt innen kvinners reproduktive biologi. Her rapporterer vi en detaljert metodikk for enzymatisk og mekanisk rensing av mus endometrial epitelvev for den etterfølgende kulturen av endometrieorganoider i et gelmatrisestillas. Vi beskriver også metodene for nedstrøms histologiske og molekylære analyser av gelmatrise-innkapslede mus endometrial epitelorganoider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Musehåndtering og eksperimentelle studier ble utført under protokoller godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Baylor College of Medicine og retningslinjer fastsatt av NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals.

1. Isolering av livmorepitel fra mus ved hjelp av enzymatiske og mekaniske metoder

MERK: Denne delen beskriver trinnene som kreves for å etablere, passere, fryse og tine epiteliale endometrieorganoider fra mus ved hjelp av et gelmatrisestillas. Tidligere studier har fastslått at optimale kulturer av mus endometrial organoider er etablert fra mus under østrus fase4, som kan bestemmes ved cytologisk undersøkelse av en vaginal vattpinne15. Voksne kvinnelige WT-mus (6-8 uker gamle, hybrid C57BL / 6J og 129S5 / SvEvBrd) ble brukt til alle eksperimenter. Musene ble humant avlivet i henhold til IACUC-godkjente retningslinjer ved bruk av isofluransedasjon etterfulgt av cervikal disartikulasjon. Når musene er avlivet, bør følgende trinn følges. Se materialtabellen for detaljer knyttet til materialer og løsninger som brukes i denne protokollen.

  1. La gelmatrisen tine på is i ca. 1-2 timer før bruk.
  2. For å dissekere musen, bruk saks for å lage et midtlinjesnitt på magen og skrell forsiktig av huden for å eksponere det underliggende peritoneale laget. Bruk tang til å holde opp bukhinnen og lage laterale snitt med saksen for å eksponere bukinnholdet.
    1. Finn livmorhornene ved å forsiktig flytte magefettputene til side. Disseker dem ved først å holde dem i livmorhalskrysset og bruke saks til å kutte langs det mesenteriske fettet. Etter disseksjon av musens livmor, fjern grundig fettvev fra livmorhornet med liten saks.
      MERK: Oppretthold steriliteten under celleisolasjonen ved å sterilisere alle operasjonsverktøy før bruk, spray musens mage med 70% etanol, og utfør alle trinnene etter disseksjon under en steril vevskulturhette.
  3. Skjær hvert livmorhorn i små fragmenter, hver måler ca 4-5 mm.
  4. Plasser alle livmorfragmentene fra en livmor i en brønn på en 24-brønns plate som inneholder 0,5 ml 1% trypsin. Tillat den enzymatiske løsningen å komme inn i livmorlumen, noe som forårsaker enzymatisk separasjon av endometrieepitelet fra den underliggende stroma.
  5. Inkuber platen med 24 brønner i en 37 °C inkubator for fuktet vevskultur i ca. 1 time.
  6. Etter 1 times inkubasjon, overfør livmorfragmentene til en 35 mm vevskulturplate som inneholder 1 ml Dulbeccos fosfatbufrede løsning (DPBS).
  7. Under et disseksjonsmikroskop, bruk fine tang og en 1 ml pipette for å mekanisk skille livmorepitelet fra livmorrøret. Mens du holder nede den ene enden av et livmorfragment med tangen, kjører du forsiktig pipettespissen i lengderetningen over fragmentet og klemmer epitelet ut av den andre enden av livmorrøret. Vær oppmerksom på de separerte epitelarkene fra livmorfragmentet under disseksjonsmikroskopet.
  8. Bruk 1 ml pipetten til å samle opp og forsiktig overføre epitelplatene til et 1,5 ml rør.
  9. Gjenta prosessen for de resterende livmorfragmentene, og overfør alle epitelarkene til samme oppsamlingsrør.
  10. Pellet de dissosierte epitelplatene ved sentrifugering i 5 minutter ved 375 × g.
  11. Fjern supernatanten forsiktig for å unngå å forstyrre cellepelleten.
  12. Resuspendere cellepelleten i 0,5 ml 2,5 mg/ml kollagenase + 2 mg/ml DNase-oppløsning. Pipette opp og ned ca. 10x, eller til en encellet suspensjon er oppnådd.
  13. Tilsett 0,5 ml DMEM / F12 + 10% føtalt bovint serum (FBS) + antibiotika, og sentrifuger cellene i 5 minutter ved 375 × g.
    MERK: For ytterligere informasjon om bredspektret antibiotika som brukes til cellekultur, se materialtabellen.
  14. Fjern supernatanten forsiktig og resuspend cellene i 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotika. Sentrifuger cellene i 5 minutter ved 375 × g.

2. Behandling av stromalrommet

MERK: Denne delen skisserer protokollene som er nødvendige for å isolere stromalrommet til musens endometrium. Gitt den økende interessen for epithelial / stromal co-kultur eksperimenter, er det viktig å kunne behandle stromale cellepopulasjoner i tillegg til epitelceller som vil generere organoider.

  1. Når alt epitelet er enzymatisk og mekanisk separert fra livmorfragmentene, er de resterende rørlignende strukturer de "stromale / myometriske" rommene. Samle dette vevet i en 2,5 mg / ml kollagenase + 2 mg / ml DNase i HBSS-løsning.
  2. Inkuber stromal/myometrisk prøve på en 37 °C shaker i 15 minutter.
  3. Etter inkubasjon, tilsett 500 μL DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotika per mus, og filtrer de ikke-dissosierte fragmentene gjennom et 40 μm cellefilter.
  4. Pellet cellene ved sentrifugering i 5 minutter ved 375 × g.
  5. Fjern supernatanten forsiktig og resuspend cellepelleten i 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotika. Tilsett blandingen dråpevis til 10 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotika i en 10 cm cellekulturplate. Inkuber platen ved 37 °C i en inkubator for fuktet cellekultur.
  6. For å generere samkulturer av mus endometrial epitel- og stromale celler, følg metodene beskrevet for humane endometriske organoider ved bruk av stillasfrie eller kollagenmatrisesystemer 6,8.
    MERK: Selv om disse teknikkene ennå ikke er publisert for mus, kan de tilpasses basert på de publiserte protokollene med humant endometrium.

3. Innkapsling av livmorepitel i gelmatrise for å etablere organoider

NOTAT: Hold gelmatrisen på is til den er klar til bruk.

  1. Fjern supernatanten og resuspendere cellepelleten i et volum gelmatrise som er 20 ganger det av cellepelleten (dvs. hvis cellepelleten er 20 μL, resuspendere cellene med 400 μL gelmatrise). Resuspend pelleten forsiktig for å unngå å introdusere bobler.
  2. La gelmatrisen/cellesuspensjonen sette seg ved romtemperatur i ~10 minutter.
  3. Når gelmatrisen / cellesuspensjonen blir en halvfast gel, bruk en P200 mikropipette med en bred boring 200 μL spiss for å forsiktig aspirere 25 μL av gelmatrisen / cellesuspensjonen. Dispenser tre separate 25 μL kupler per brønn på en 12-brønns plate, og la gelmatrisen herde i 15 minutter i en 37 ° C fuktet vevskulturinkubator.
  4. Etter at gelmatrisen har herdet, tilsett 750 μL organoidmedium til hver brønn som inneholder gelmatrisekupler. Inkuber ved 37 °C i en inkubator for fuktet vevskultur.
    MERK: Organoid medieformulering er notert i materialtabellen. Organoider dannes vanligvis innen 4 dager etter innledende kultur.

4. Genuttrykksanalyse av endometrieorganoider etter behandling med østradiol

MERK: Denne delen beskriver metodene som brukes til å profilere genuttrykket til endometrieepitelorganoider ved bruk av sanntids qPCR etter behandling med østradiol (E2; se tabell 1). Fordi endometrium er under syklisk kontroll av ovariehormonet E2, er testing av organoidens respons på E2 et viktig mål for fysiologisk funksjon. Vi har oppnådd RNA av høy kvalitet og generert tilstrekkelig mRNA til å profilere genuttrykk ved hjelp av qPCR og / eller RNA-sekvensering fra våre endometrielle epitelorganoider. Denne delen beskriver hvordan du samler organoider og behandler dem for nedstrøms analyse av genuttrykk. Det valgte behandlingsmediet gjenspeiler det som brukes til å behandle dyrkede endometrieceller. Det skal imidlertid bemerkes at dette behandlingsmediet kan optimaliseres tilsvarende, som gjort for behandling av humane endometriske 3D-kulturer med hormoner 8,16,17.

  1. Kultur endometrial organoider som beskrevet ovenfor.
  2. Fjern organoidmediet og erstatt det med 750 μL sultmedium fire dager etter sådd. Inkuber over natten.
  3. Neste morgen, fjern sultmediet. Tilsett 750 μL behandlingsmedium som inneholder enten kjøretøy eller 10 nM E2. Inkuber i 48 timer.
  4. Fortsett med RNA-isolasjon etter kitprodusentens protokoll.

5. Histologisk analyse av endometrieorganoider

MERK: Imaging de morfologiske egenskapene til endometrieorganoider er avgjørende for å evaluere den cellulære effekten av vekstfaktorer, genetiske manipulasjoner eller små molekylhemmere. Denne delen beskriver teknikkene som brukes til å fikse, behandle og avbilde endometrielle epitelorganoider ved hjelp av histologiske flekker og immunfluorescerende antistofffarging.

  1. Forbered 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder 1 ml 4% paraformaldehyd i 1x PBS. Legg dem på is.
  2. Aspirer mediet fra brønnene på 12-brønnsplaten som inneholder organoider.
  3. Bruk en 1 ml pipettespiss med en kuttspiss, overfør 500 μL 4% paraformaldehyd til hver brønn og løsne gelmatrisekuplene forsiktig fra bunnen av platen.
  4. Aspirer forsiktig hele gelmatrisekuplene inn i pipettespissen og overfør til mikrosentrifugerøret på 1,5 ml.
  5. Fest organoidene ved å plassere dem på en rotator ved 4 °C over natten.
  6. Neste morgen sentrifugerer du røret ved 600 × g i 5 minutter for å pelletere organoidene. Fjern forsiktig 4% paraformaldehydoppløsningen med en pipette og kast den. Vask organoider 2x med 70% etanol.
  7. Etter siste vask, fjern alle unntatt 50-100 μL etanol fra røret. Sett røret til side.
  8. Plasser et rør med prøvebehandlingsgel i et vannbad og mikrobølgeovn i ~ 30 s for å smelte gelen. Sørg for at prøvebehandlingsgelen ikke koker over ved å overvåke konsistensen av gelen.
    MERK: Når prøvebehandlingsgelen er smeltet, men ikke kokende varm, arbeid raskt for å innkapsle organoidene.
  9. Overfør nok prøvebehandlingsgel til å dekke hele overflaten av formen (ca. 250 μL).
  10. Mens prøvebehandlingsgelen fortsatt er smeltet, overfører du raskt 50 μL 70% etanoloppløsning som inneholder organoider. Sørg for at organoidene er nedsunket eller presset til den nederste delen av formen.
  11. Plasser histologiformen på en bøtte med is og la prøvebehandlingsgelen avkjøles og størkne.
  12. Når prøvebehandlingsgelen er helt tørr, overfør forsiktig prøvebehandlingsgelplassen til en prøvepose, og hold styr på flyet der organoidene er plassert.
  13. Plasser posen i en histologikassett og kjør ved hjelp av standardmetoder som brukes for formalinfiksering og parafininnblanding av vev18.
  14. Etter fiksering og innebygging i parafin, seksjon i 5 μm seksjoner ved hjelp av en mikrotom19. Fortsett med standard hematoksylin og eosin (H &E) farging eller immunostaining prosedyrer, som beskrevet nedenfor.

6. Hematoksylin & eosin farging

  1. Deparaffinize seksjonene som følger: xylen, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% etanol, 3 min; 60% etanol, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min i hematoksylin; vann fra springen (3 x 5 s); 1 min i eosin.
  2. Dehydrer seksjonene som følger: 60% etanol, 3 min; 80% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 100% etanol, 2 x 3 min; xylen, 2 x 15 min.
  3. Monteres ved hjelp av monteringsmedium.

7. Immunfluorescens farging

  1. Avparafiner avsnittene som beskrevet i trinn 6.1.
  2. Utfør antigenuthenting
    1. Senk lysbildene i antigeninnhentingsløsning i en mikrobølgesikker beholder.
    2. Mikrobølgeovn ved høy varme i 20 minutter, med 5 minutters intervaller for å sikre at løsningen ikke koker over.
  3. Etter at 20 min antigeninnhentingstrinnet er fullført, la lysbildene avkjøles på is i 40 minutter mens de fortsatt er nedsenket i antigeninnhentingsbuffer.
  4. Vask lysbildene med 1x TBST i 3 minutter
  5. Blokker lysbildene ved å inkubere i 3% BSA i TBST i 1 time ved romtemperatur.
  6. Primær antistoffinkubasjon
    1. Fortynn antistoffet i 3% BSA i TBST (1: 50-1: 1,000, avhengig av Ab).
    2. Rug over natten ved 4 °C i et fuktet kammer.
    3. Vask 3 x 5 min med TBST.
  7. Sekundær antistoffinkubasjon
    1. Fortynn antistoffet i 3% BSA (i TBST) (1:250), eller i 5% normalt eselserum.
    2. Inkuber i 1 time ved romtemperatur (RT) i mørket, siden antistoffet er konjugert til en fluorofor.
  8. Nukleær farging
    1. Fortynn 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) 1:1,000 i TBST.
    2. Inkuber i 5 min på RT.
    3. Vask 2 x 5 min med TBST.
  9. Montering
    1. Bruk en dråpe monteringsmedium for å montere dekselet.
    2. Forsegl dekselet med neglelakk dagen etter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fasekontrastbilder av musens endometrieorganoider
Vi etablerte organoider fra WT-mus endometrisk epitel, som beskrevet i vedlagte protokoll (se figur 1). Etter enzymatisk dissosiasjon av musens endometrieepitel ble epitelarkene mekanisk separert fra livmorstromalcellene og videre dissosiert med kollagenase for å generere en encellet suspensjon. Hvis det utføres riktig, bør denne metoden for epitel- og stromalcelleseparasjon gi prøver med forurensning på ikke mer enn 10% -15% av motsatt celletype (se immunfluorescensbilder i figur 2). Epitelcellepelleten ble deretter resuspendert i gelmatrise, tillatt å gelere ved romtemperatur og belagt i 25 μL kupler på vevskulturplater. Etter at gelmatrisekuplene størknet, ble de overlagt med organoidmedium og fikk lov til å vokse. Vi observerte vanligvis at endometrieepitelceller samlet seg til organoider innen 3-4 dager, som vist i figur 3. Organoidene ble opprettholdt i kulturen, med medieendringer som skjedde hver 3. dag, og passerte hver 5-7 dag.

Avbildning av musens endometrieorganoider ved bruk av histologisk og immunfluorescerende farging
For å analysere morfologien til museepitelorganoider, tilpasset vi metoder som ble brukt for innkapsling av cellulære finnålsaspirer ved bruk av prøvebehandlingsgel20. Dette muliggjør bevaring av endometrial organoidmorfologi og innkapsling i en matrise som kan underkastes behandling som forberedelse til parafininnbygging. Prøvebehandlingsgel er en modifisert agar som er mye brukt i kliniske patologilaboratorier for analyse av fine nålaspirater og har blitt brukt til å kapsle vaginale organoider21,22. Etter at prøvebehandlingsgelen / organoidblandingen stivner, kan den behandles, farges og avbildes med teknikker som vanligvis brukes til å analysere vev. I figur 4A, B, viser vi at seksjonerte formalinfaste paraffin-innebygde endometrieorganoider kan visualiseres av hematoxylin- og eosinflekker, som viser enkeltlaget av epitel og hule sentre - lumenene - av organoider. Visse organoider inneholder også sekreter i lumen, noe som indikerer at organoider får de funksjonelle egenskapene til glandulære epitelceller. Vi beskriver også teknikker for å visualisere organoidene ved hjelp av immunostaining (figur 4C, D); snittede endometrieorganoider ble inkubert med et primært antistoff mot cytokeratin 8 (TROMA-1) og et fluoroforkonjugert sekundært antistoff (sekundært antirotte-594). Kjerner ble deretter visualisert med DAPI, og lysbildene ble avbildet ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Vi observerte at alle cellene i organoidene var Cytokeratin 8-positive og inneholdt DAPI, noe som indikerer at fiksering, innebygging og behandling av endometrieorganoider er kompatibel med antistoffbasert immunostaining.

RNA-ekstraksjon og genuttrykksanalyse
For å bestemme genuttrykksresponsen til endometrieorganoider, tillot vi endometriske organoider fra WT-mus å vokse i 4 dager etter den første passasjen. Kvelden før behandling ble endometrieorganoidmediet endret til sultemedium. Organoidene ble deretter behandlet i tredoble brønner (hver brønn inneholdt tre kupler) med kjøretøy (etanol, likt volum i oppløsning som brukt for østradiol) eller 10 nM østradiol (E2) i totalt 48 timer. Etter 48 timer ble mediet fjernet, og organoider ble behandlet for RNA-ekstraksjon. Omtrent 4 μg RNA kan oppnås fra totalt to kupler fra hver brønn, og 1 μg RNA ble brukt til å reversere transkribere cDNA. Forsterkning av genene som koder for lipokalin 2 (Lcn2), laktoferrin (Ltf) og progesteronreseptoren (Pgr) ble utført med kvantitativ PCR i sanntid (figur 5 og tabell 1)23,24,25. Som forventet observerte vi at ekspresjonen av Lcn2, Ltf og Pgr økte i epitelorganoidene etter stimulering med 10 nM E2 (figur 5). Dermed viser disse resultatene at endometrieepitelorganoider med hell kan brukes til å måle genuttrykksendringene som respons på E2.

Figure 1
Figur 1: Prosedyrer for etablering av endometrieorganoider. Diagram skisserer de viktigste trinnene som ble fulgt for å (A) etablere og (B) passasje epitelorganoider fra musens endometrium. (A) Metoder inkluderer enzymatisk og mekanisk dissosiasjon av endometrieepitel fra musens livmor, etterfulgt av enkeltcelledispersjon og innkapsling av epitelet i en gelmatrise. For å oppnå livmorvevet for enzymatisk dissosiasjon, fjernes eggstokkene og oviduktene fra livmorhornene med fin saks, kuttes lateralt i 4-5 mm fragmenter og plasseres deretter i enzymoppløsningen. Etter enzymatisk inkubasjon separeres endometrisk epitel mekanisk fra den underliggende stroma under et mikroskop ved hjelp av tang og en pipette for å "klemme" ut epitelet fra livmorrøret. Epitelet fordøyes videre i epitelceller ved hjelp av en kort inkubasjon i kollagenase, etterfulgt av innkapsling i en gelmatrise. (B) Passaging av endometrieorganoider krever mekanisk dissosiasjon i kaldt medium og sentrifugering for å frigjøre organoider fra matrisen og å generere mindre organoidfragmenter. Når organoidene har blitt frigjort fra matrisen og mekanisk dissosiert i mindre fragmenter, blir de innkapslet i matrise og ombelagt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Immunfarging av isolerte endometrieepitel- og stromalcellepopulasjoner. Immunfluorescensbilder viser epitel- og stromalcellepopulasjoner av (A,B) epitelcellen og (C,D) stromale cellefraksjoner etter enzymatisk og mekanisk separasjon av livmoren. Cytokeratin 8 (en epitelcellemarkør) er vist i rødt, vimentin (en stromal cellemarkør) er vist i grønt, og DAPI (en nukleær markør) er vist i blått. Skalastenger = 100 μm (A,C), 20 μm (B,D). Forkortelser: CK8 = cytokeratin 8; VIM = vimentin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Dannelse av endometrieorganoider fra WT-mus i løpet av 4 dager. Endometrial epitel ble isolert fra en WT-mus og brukt til å generere organoider. (A) Fasekontrastbilde av epitelcellene innkapslet i gelmatrisen umiddelbart etter fordøyelsen (dag 0). (B,C) Noen få små organoider kan observeres på dag 1 (B) og dag 2 (C) av kulturen. (D) Større og modne epitelorganoider kan observeres på dag 3 av kulturen. Bilder ble tatt med et 5x mål; skala barer = 200 μm. Forkortelse: WT = vill type. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Histologisk analyse av endometrieorganoider . (A,B) FFPE endometrieepitelorganoider ble snittet og farget med H&E. (C,D) FFPE epitelorganoider ble immunfarget med epitelcellemarkøren cytokeratin 8 (rød). Cellekjerner ble farget med DAPI (blå). Skalastenger = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B,D). Forkortelser: FFPE = formalin-fast parafin innebygd; H&E = hematoksylin & eosin; CK8 = cytokeratin 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Genuttrykksanalyse av musens endometrieorganoider. Mus endometrial epitelorganoider fra WT-mus ble dyrket i 4 dager i organoid vekstmedium, etterfulgt av behandling med kjøretøy eller 10 nM E2 i 48 timer i DMEM / F12 supplert med 2% kull-strippet FBS. (A,B) Fasekontrastbilder av WT-museorganoider etter behandling med vehikkel (A) eller 10 nM E2 (B). (CE) Sanntids qPCR-analyse av epitelial endometrieorganoider behandlet med kjøretøy eller 10 nM E2. Ekspresjon av E2-regulerte gener, lipokalin 2 (Lnc2), laktoferrin (Ltf) og progesteronreseptor (Pgr). Barer representerer gjennomsnittlig ± SEM, analysert av en to-tailed t-test; *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Gjentatt med organoider avledet fra n = 3 WT-mus per tilstand. Skalastenger = 200 μm (A,B). Forkortelser: WT = vill type; E2 = østradiol; qPCR = kvantitativ PCR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Primer sekvens Fremover (5'-3') Omvendt (5'-3')
Lipokalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTGTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Laktoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesteron (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyseraldehyd 3 fosfat dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT
PCR-blanding inneholder:
2x SYBR Grønn
0,5 μM Fwd Primer
0,5 μM Rev Primer
cDNA
RNAse/DNAse-fri H2O
Cycler Forhold:
Temperatur Tid Sykluser
Holde 95 °C 10 minutter 1
Denaturering 95 °C 15 s 40
Forlenge 60 °C 60-tallet

Tabell 1: Primersekvenser og PCR-tilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi metoder for å generere endometrielle epitelorganoider fra musens endometrium og protokollene som rutinemessig brukes til nedstrømsanalyse. Endometrieorganoider er et kraftig verktøy for å studere mekanismene som kontrollerer endometrierelaterte sykdommer, som endometriose, endometriekreft og implantasjonssvikt. Landemerkestudier publisert i 2017 rapporterte forholdene til å dyrke langsiktige og fornybare kulturer av endometrieorganoider fra mus og humant epitel 4,5. Selv om organoider har blitt mye brukt til å studere biologiske veier i andre systemer, har studien av endometrievev in vitro vært begrenset av fraværet av en egnet modell for å studere det ikke-transformerte primære epitelet i kultur26. Endometrieorganoider avledet fra humant og mus endometrium ble vellykket etablert ved hjelp av forhold som vanligvis brukes til å dyrke organoider fra andre organvev, som tarm, nyre og lunge, og ved å legge dem inn i et ekstracellulært matriksstillas sammensatt av gelmatrise4. Siden disse første rapportene har bruken av endometrieorganoider for å studere endometriumets biologi økt betydelig i det vitenskapelige samfunn.

Ved å modifisere en tidligere publisert metode for epitelial isolasjon fra musens livmor27,28, fremhever denne protokollen unikt viktige trinn for å isolere mus livmor ved direkte å plassere vevet i en enzymløsning, omgå behovet for å transektere livmoren eller bruke filtrering. Ved hjelp av denne metoden oppnådde vi epitel med ~ 85% -90% renhet, bestemt av cytokeratin 8 og vimentin immunostaining (figur 2). Denne protokollen skisserer også klart de viktigste detaljene for innkapsling av de isolerte epitelcellene i vekstmatrisen for generering, vedlikehold og passasjering av organoider. Bildene i figur 4 og våre upubliserte studier har identifisert tilstedeværelsen av muciner og kjertelceller (dvs. FOXA2-positive) i våre organoidkulturer29. Disse indikerer at metoden som presenteres her er effektiv for isolering av både glandulære og luminal-epitelcellepopulasjoner fra musens endometrium.

Viktige begrensninger for veksten av disse organoider inkluderer bruk av den kommersielle matrisen (dvs. Matrigel), som kan resultere i batch-til-batch variasjoner og inneholder vekstfaktorer som kan påvirke organoid vekst. Videre, mens disse organoider inneholder rent livmorepitel, har bruk av ytterligere endometriecelletyper (dvs. immun, stromal) nylig blitt beskrevet i humane organoide systemer av endometrium 8,30. Andre grupper har vist evne til å isolere både luminale og glandulære epitelceller for organoidkulturer fra musens livmor14.

Denne tilnærmingen bruker vev fra en liten dyremodell som er relativt vanlig og tilgjengelig for de fleste forskere; generering av endometrieorganoider fra større dyremodeller, eller mennesker, kan utgjøre etiske eller tekniske utfordringer, som kan overvinnes ved bruk av indusert pluripotent stamcelle (iPSC) -baserte teknikker. Slike teknologier har tidligere blitt beskrevet for endometrievev 31, andre vev i reproduktive kanal32 og har blitt effektivt brukt til å studere endometrielle / placenta-interaksjoner in vitro33. Derfor utgjør bruk av iPSCs som en kilde til endometrial stromal- og epitelceller i endometrium fra mennesker og andre store dyremodeller en fornybar og tilgjengelig kilde for å generere endometrieorganoider.

Mens musen er en mye brukt modell for studiet av implantasjon, er det viktige evolusjonære forskjeller i implantasjonsmekanismen mellom mus og mennesker som bør noteres. For eksempel, mens interstitiell implantasjon er preget av dyp trofoblastisk invasjon gjennom luminalepitelet i den underliggende stroma, er mekanismen for invasjonsprosessen forskjellig mellom mus og primater34. Hos mus innebærer trofoblastinvasjon gjennom luminalepitelet apoptose eller entose 35,36, mens trofoblaster migrerer mellom luminalepitel inn i den underliggende stroma hos primater 34,35.

Å gi endometrieorganoider de nødvendige vekstfaktorene for å støtte selvmontering og langsiktig fornyelse er viktig for å oppnå endometrieorganoidkulturer som rekapitulerer det opprinnelige vevet. Den komplekse mediesammensetningen for endometrieorganoider indikerer de mange signalveiene som bidrar til epitelcelleegenskaper, og vil oppstå fra både parakrine og autokrine kilder. Det stromale rommet i endometrium er en kompleks samling av mange celletyper, inkludert fibroblastlignende stromale celler, endotel, makrofager og andre spesialiserte immunceller som stadig endres som svar på østrogen og progesteron37.

For eksempel inneholder organoidkulturmediet faktorer som aktiverer WNT/β-catenin-signalering i organoidene, slik som WNT3a og R-Spondin. Studier på mus har vist at WNT-ligander er kritiske for livmorutvikling og kjertelfunksjon; Derfor er aktivering av denne signalveien kritisk for organoid utvikling og vedlikehold38,39. R-Spondin forsterker WNT-signalering og er liganden til den leucinrike gjentakelsesholdige G-proteinkoblede reseptoren (LGR5)40. Endometrieorganoidkulturer krever også inhibering av signalveiene transformerende vekstfaktor β (TGFβ) og benmorfogenetisk protein (BMP). For eksempel inneholder endometrial organoid kulturmedium BMP-hemmeren, Noggin, et utskilt protein som binder seg til og inaktiverer BMP2, BMP4 og BMP741. Den farmakologiske inhibitoren, A83-01, er også tilstede i endometrisk organoidmedium. A83-01 er en liten molekylhemmer med høy spesifisitet til reseptorene ALK4, ALK5 og ALK742. ALK4/5/7 er type 1-reseptorer av TGFβ-signalfamilien som binder seg til og overfører signaler fremkalt av ligander som TGFβ, aktivin eller nodal. BMP-signaler er kritiske for stamcellevedlikehold i vev som tarm43 og hårsekkene44. Inhibering av TGFβ-signalering bidrar til proliferativ kapasitet og kolonidannelseseffektivitet av endometrielle mesenkymale stamceller45, som oppstår ved ombygging av nøkkelregioner i kromatin46. Dermed er modulering av disse to viktige signalveiene, BMP og TGFβ, nødvendig for å opprettholde organoidkulturer med selvfornyelseskapasitet.

Selv om det ikke vises her, fant vi at langtidskultur av museorganoider med ALK4/5/7-hemmeren, A83-01, førte til morfologiske endringer i epitelorganoidene etter tre eller fire kontinuerlige passasjer (Kriseman et al., under vurdering). De morfologiske forandringene i epitelorganoidene minnet om de "tette" epitelorganoidene beskrevet av Boretto et al.4, hvor utviklingen av mer sekretoriske celler skjedde på grunn av redusert parakrin sekresjon av WNT-ligander. Dermed er det sannsynlig at TGFβ- og WNT-signalveier krysser hverandre for å kontrollere endometrieepitelorganoidregenerering og differensiering.

Nylige studier har generert 3D endometrial epitel / stromal co-kultur systemer fra humant vev 7,8,16. En metode for co-dyrking benytter et stillasfritt system, hvor endometrielle epitel- og stromale celler kombineres og får lov til å samle seg i 3D-strukturer i en stillasfri brønn ved hjelp av et definert kulturmedium. Disse 3D-endometriske epitel / stromale organoider uttrykker ikke bare reseptorer for østrogen, progesteron og androgen, men rekapitulerer også trofast responsen på ovariehormoner - østrogen og progesteron 6,7. I en annen co-dyrkingsmetode, brukt i en studie av Rawlings et al., kombineres endometrial epitelorganoider med stromale celler i en kollagenmatrise og dyrkes i et modifisert organoid medium8. Disse epiteliale / stromale samkulturerte organoider, eller assembloider, organiserer seg i et suspendert 3D-system, hvor stromale celler omgir epitelkjertellignende strukturer.

Flertallet av endometrieorganoider er dyrket i vekstfaktorredusert gelmatrise; Tilstedeværelsen av aktive forbindelser i matrisen kan imidlertid utøve uønskede cellulære responser i organoider. For å overvinne denne begrensningen er organoider etablert i gelmatrisefrie stillaser, for eksempel 3D-printede agaroseformer der individuelle organoider får lov til å selvmontere6. Andre grupper har utviklet syntetiske hydrogeler for å tjene som 3D-matriser for kulturen av endometrieorganoider47. Disse organoider samles i 3D-strukturer med apikobasal polaritet og kan også kombineres med stromale celler i endometrium for å danne komplekse organoider48. Siden organoider med hell kan brukes til å dyrke ikke-transformerte primære menneskelige og mus endometrievev på måter som 2D-cellekulturer ikke kan, er det ingen tvil om at endometrieorganoider vil fremme feltet kvinners reproduktive helse og være et utrolig verktøy for å studere reproduktive patologier som tilbakevendende graviditetstap, endometriose og endometriekreft16, 49,50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Stephanie Pangas og Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) for kritisk lesing og redigering av manuskriptet vårt. Studier ble støttet av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development tilskudd R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.), og R01-HD110038 (M.M.M.), og av NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. har en Next Gen Pregnancy Award fra Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Tags

Biologi utgave 191 endometrium organoider infertilitet livmor regenerering
Etablering av 3D Endometrial Organoids fra Mouse Uterus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter