Summary
Her præsenterer vi en protokol til måling af brun fedtvævsaktivitet efter et måltid hos mennesker og forsøgsdyr.
Abstract
Måling af brunt fedtvæv (BAT) aktivitet ved positronemissionstomografi computertomografi (PET-CT) via akkumulering af 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) efter et måltid eller hos overvægtige eller diabetespatienter mislykkes som den valgte metode. Hovedårsagen er, at 18F-FDG konkurrerer med den postprandielle høje glukoseplasmakoncentration for den samme glukosetransportør på membranen i BAT-celler. Derudover bruger BAT også fedtsyrer som energikilde, hvilket ikke er synligt med PET-CT og kan ændres sammen med glukosekoncentrationen hos overvægtige og diabetespatienter. For at estimere den fysiologiske betydning af BAT hos dyr og mennesker anvendes derfor en ny infrarød termografimetode, der anvendes i nyere publikationer.
Efter natlig faste blev BAT-aktivitet målt ved infrarød termografi før og efter et måltid hos frivillige forsøgspersoner og hunmus af vildtypen. Kamerasoftwaren beregner objektets temperatur ved hjælp af afstand fra objektet, hudens emissivitet, reflekteret stuetemperatur, lufttemperatur og relativ luftfugtighed. Hos mus var det barberede område over BAT et interesseområde, for hvilket gennemsnitlige og maksimale temperaturer blev målt. Fasen af østruscyklussen hos hunmus blev bestemt efter et eksperiment ved vaginale udstrygninger farvet med cresylviolet (0,1%) pletopløsning. Hos raske frivillige blev der valgt to hudområder i nakken: det supraklavikulære område (over kravebenet, hvor BAT-celler er til stede) og det interklavikulære område (mellem kravebenene, hvor der ikke er påvist BAT-væv). BAT-aktivitet bestemmes af subtraktionen af disse to værdier. De gennemsnitlige og maksimale temperaturer i hudområder kunne også bestemmes hos dyr og menneskelige deltagere.
Ændringer i BAT-aktivitet efter et måltid målt ved infrarød termografi, en ikke-invasiv og mere følsom metode, viste sig at være køn, alder og fase af brunstcyklussen afhængig hos forsøgsdyr. Som en del af diætinduceret termogenese viste BAT-aktivering hos mennesker sig også at være afhængig af køn, alder og kropsmasseindeks. Yderligere bestemmelse af de patofysiologiske ændringer i BAT-aktivitet efter et måltid vil være af stor betydning for deltagere med høje glukoseplasmakoncentrationer (fedme og diabetes mellitus type 2) såvel som hos forskellige forsøgsdyr (knock-out mus). Denne metode er også et variabelt værktøj til bestemmelse af mulige aktiverende lægemidler, der kan forynge BAT-aktivitet.
Introduction
Brunt fedtvæv (BAT), i modsætning til hvidt fedtvæv (WAT), lagrer ikke, men bruger snarere energi. Ved sympatisk stimulering udnytter BAT fedtsyrer og glukose og producerer varme ved aktivering af afkoblingsprotein 1 (UCP1). Funktionen af UCP1 er at bruge en H + gradient mellem to mitokondriemembraner til at producere varme i stedet for ATP. BAT's funktion er at øge varmeproduktionen under kolde forhold, hvilket fører til en stigning i energiforbruget1. Efter kold eksponering hæmmer sensoriske input fra huden varmefølsomme neuroner i den mediane præoptiske (MnPO) kerne i det hypothalamiske præoptiske område (POA), hvilket mindsker den hæmmende virkning af POA-neuroner på rostral raphe pallidus (rRPa). Aktiveringen af rRPa-neuroner øger sympatisk aktivitet, hvilket efterfølges af en stigning i BAT-aktivitet 2,3. Koldinduceret BAT-aktivering forbedrer insulinfølsomheden hos mennesker4, og denne aktivitet er nedsat hos mennesker med øget body mass index (BMI) og alder 1,5,6,7.
Bortset fra dets rolle i koldinduceret termogenese øges glukoseoptagelsen i BAT efter et måltid i den magre mandlige population, hvilket bidrager til diætinduceret termogenese (DIT), som er højere hos BAT-positive mandlige forsøgspersoner 8,9. Den avancerede teknik, der anvendes til måling af BAT-aktivitet, er positronemissionstomografi computertomografi, kendt som PET-CT. Denne metode bestemmer BAT-aktiviteten ved at måle akkumuleringen af fluorodeoxyglucose (18F-FDG). PET-CT fejler imidlertid som den foretrukne metode til påvisning af aktivering af BAT efter et måltid. En af grundene er, at 18F-FDG efter et måltid konkurrerer med postprandial hyperglykæmi om den samme glukosetransportør, hvilket gør den uegnet til bestemmelse af BAT-aktivering efter et måltid, især når man sammenligner BAT-aktivitet hos raske og diabetiske deltagere med mulige forskelle i blodglukosekoncentrationer. Desuden bruger BAT fedtsyrer som energikilde til varmeproduktion, hvilket ikke er synligt med PET-CT. 18 Ophobning af F-FDG i BAT efter et måltid er næsten ikke synlig10 og fortolkes derfor i de fleste tilfælde som et negativt resultat. Ikke overraskende blev det for nylig foreslået, at aktiveringen af BAT er mere udtalt i den menneskelige befolkning, end vi tidligere havde troet; derfor er der behov for en ny tilgang til påvisning af BAT-aktivitet og dens involvering i metaboliske lidelser7. Et forsøg på at løse dette problem er at måle volumen af BAT med magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) hos prædiabetiske patienter og patienter med diabetes mellitus type 2 (T2DM) med insulinresistens11. BAT-volumen målt ved MR er imidlertid ikke en tilstrækkelig indikator til at estimere den daglige funktion og brug af glukose og fedtsyrer af BAT. For at estimere reelle forskelle i BAT-aktivitet hos raske versus T2DM-patienter er der derfor behov for en ny tilgang, der giver mulighed for at finde ud af den patologiske mekanisme for BAT-funktionsfejl hos T2DM-patienter.
For at bestemme aktiveringen af BAT udførte vi målinger af BAT-varmeproduktion før og efter et måltid ved hjælp af infrarød (IR) termografi (figur 1)12,13. Etablering af IR-termografi som en metode til måling af BAT-aktivitet efter et måltid hos raske og overvægtige personer eller patienter med diabetes mellitus vil have en enorm indflydelse på feltet. Den dag i dag anvendes IR-termografi til bestemmelse af koldinduceret aktivering af BAT13,14,15. I nyere menneskelig historie er kuldeinduceret BAT-aktivitet ikke særlig udtalt længere (på grund af korrekt opvarmning af levesteder, korrekt tøj), mens BAT-aktivering efter et måltid forekommer hver dag. Desuden er den fysiologiske regulering af disse to BAT-funktioner via hypothalamus helt forskellig. Efter et måltid fører aktiveringen af proopiomelanocortin (POMC)-ekspressive neuroner i den hypothalamiske bueformede kerne (Arc) til en stigning i sympatisk nerveaktivitet via rRPa16. Koldinduceret aktivering af BAT målt ved IR-termografi eller PET-CT er forkert, når det bruges som et mål for daglig BAT-aktivitet. Øget BAT-aktivitet efter et måltid efterfølges af glukoseudnyttelse, hvilket i sidste ende er vigtigt for at opretholde glukosehomeostase, insulinfølsomhed og den daglige regulering af glukosekoncentrationen. Postprandial BAT-aktivering fører til en stigning i postprandial glukoseforbrug efterfulgt af en stigning i varmeproduktion og kropstemperatur (DIT). Dette viste sig at være køn, alder og BMI-afhængig12. Lignende kønsforskelle i BAT-aktivering efter et måltid observeres hos laboratoriemus til han- og hundyr17. Disse resultater svarer til nyligt opdagede kønsforskelle i reguleringen af BAT af Burke et al., der viste, at den hypothalamiske regulering af BAT browning via en underpopulation af POMC-neuroner adskiller sig hos han- og hunmus18. Den postprandielle aktivering af BAT er mindre hos kvinder, ældre befolkninger og overvægtige mennesker. Manglen på BAT-aktivering efter et måltid (nedsat glukoseudnyttelse) kan føre til en højere forekomst af nedsat glukosetolerance hos kvinder 19,20,21,22. Desværre blev størstedelen af undersøgelserne af BAT-aktivering kun udført på mænd. Ved at aktivere BAT efter et måltid øges glukoseoptagelsen i den magre mandlige population. Det er ikke overraskende, at DIT efter BAT-aktivering er højere hos BAT-positive mandlige forsøgspersoner 8,9. Desuden forbedrer BAT-transplantation hos hanmus glukosetolerancen, øger insulinfølsomheden og nedsætter kropsvægt og fedtmasse23.
PET-CT fejler som en valgfri metode til måling af BAT-aktivitet, især efter et måltid. Derfor blev der udviklet en ikke-invasiv og mere følsom metode. IR-termografi muliggør estimering af BAT-aktivitet i forskellige forsøgsdyr (knock-out-mus) såvel som menneskelige deltagere, uanset køn, alder eller virkningerne af forskellige patologiske tilstande på BAT-aktivitet. En yderligere fordel ved denne metode er enkelheden for deltagere og forsøgsdyr, som giver os mulighed for at estimere de potentielle fordele ved BAT-boosterterapi. De nylige undersøgelser, der bruger IR-termografi til bestemmelse af BAT's fysiologiske adfærd efter kuldeeksponering eller et måltid, er beskrevet i den nylige publikation af Brasil et al.24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsforsøg på forsøgsdyr blev godkendt af det nationale etiske udvalg og landbrugsministeriet (EP 185/2018). Forsøgene blev udført i overensstemmelse med det etiske kodeks fra The Croatian Society for Laboratory Animal Science og ARRIVE retningslinjer. Alle procedurer, der blev udført i undersøgelser, der involverede menneskelige deltagere, var i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen og godkendt af den etiske komité ved universitetet i Zagreb, School of Medicine (UP/I-322-01/18-01/56). I denne undersøgelse præsenterer vi resultaterne fra tre kvindelige deltagere (BMI: 29 kg/m 2 ± 5 kg/m2). Der blev indhentet informeret samtykke fra alle frivillige forsøgspersoner til deres deltagelse i undersøgelsen og til præsentation af dataene.
1. Måling af aktiveringen af brunt fedtvæv efter et måltid hos mennesker
BEMÆRK: Udfør eksperimenterne om sommeren, når den daglige temperatur ikke er under 22 °C for at holde basal BAT-aktivitet så lav som muligt.
- Vælg omhyggeligt kontrolraske deltagere (hvis BAT-aktivitet skal estimeres under patologiske forhold), da BAT-aktivitet er køn, alder, BMI og endda fasen af østruscyklusafhængig.
- For at estimere fasen af menstruationscyklussen hos kvindelige deltagere skal du stille dem spørgsmål om, hvor lang deres gennemsnitlige menstruationscyklus er, og datoen for den første dag i deres sidste menstruation. Glem ikke at markere datoen for eksperimenterne.
BEMÆRK: Korrekt udvælgelse af matchende kontrolpersoner er den sværeste del af kliniske studier, da raske kontroller og deltagere med patologiske tilstande skal være så ens som muligt og kun afvige i den undersøgte sygdom.
- For at estimere fasen af menstruationscyklussen hos kvindelige deltagere skal du stille dem spørgsmål om, hvor lang deres gennemsnitlige menstruationscyklus er, og datoen for den første dag i deres sidste menstruation. Glem ikke at markere datoen for eksperimenterne.
- Bed deltagerne om at hvile godt, ikke spise morgenmad (fastende - intet indtag af kalorier), at samles om morgenen til eksperimenterne og hvile i mindst 30 minutter for at undgå mulig BAT-aktivering under muskelaktivitet via sympatisk aktivering.
- Bed deltagerne om at tage deres overtøj af 15 minutter før målingerne for at undgå de mulige virkninger af opvarmning af hudoverfladen (termiske virkninger af tøj), mens baseline BAT-aktiviteten bestemmes. Der foretages målinger ved passende stuetemperatur (22-27 °C).
- Udfør infrarøde målinger.
- Mens deltagerne hviler, monteres det termiske kamera (detektortype: ukølet mikrobolometr; detektorafstand: 17 μm; kameraspektralområde: 7,5-14,0 μm; termisk følsomhed: 20 mK ved 30 °C; linser: 36 mm; opløsning: 1024 pixels x 768 pixels; øjeblikkeligt synsfelt [IFOV]: 0,47 mRad) på stativet og placerer det 1 m væk fra det sted, hvor deltageren sidder.
BEMÆRK: Hvis målingerne udføres i koldere vejr (udetemperaturer under 15 °C ved 50 % fugtighed), skal du sætte kameraet ved stuetemperatur og tænde det i mindst 1 time, før målingerne udføres. Kolde instrumenter kan give forskellige resultater efter opvarmning til stuetemperatur på grund af autokalibrering. - Tilslut det termiske kamera til en computer og software som anvist af producenten. Optag aluminiumsfolie (krøllet og derefter strakt aluminiumsfolie) i en brændvidde på 1 m for at bestemme rummets reflekterede temperatur, præsenteret som målt temperatur. I kamerasoftwaren skal du indtaste afstanden på 0 m og emissiviteten på 1.
BEMÆRK: Den reflekterede tilsyneladende temperatur er en parameter, der opnås, når kameraets emissivitet er indstillet til 1,0 og afstanden til 0 m, og målingerne foretages på krøllet og derefter strakt aluminiumsfolie. Reflekteret tilsyneladende temperatur repræsenterer en tilnærmelse af den samlede indfaldende infrarøde stråling på detektoren fra miljøet. - Lige før målingerne påbegyndes, skal du bestemme rumtemperaturen og luftfugtigheden (nødvendig til senere analyse). I stedet for at tage et termisk billede skal du optage en film. Fra filmen skal du senere vælge den bedst mulige billedramme til analyse for at reducere muligheden for at miste værdifulde data.
- Før du starter optagelsen, skal du indstille følgende parametre: varigheden af videooptagelse ved 10-15 s (eller en anden ønsket værdi), billedhastigheden ved 5 fps (billeder pr. Sekund) eller en hvilken som helst anden værdi (i vores hænder er 5 fps det maksimale nødvendige) og et sted på disken, hvor filmen gemmes, som beskrevet nedenfor.
- I softwaren over hovedkameravinduet skal du vælge det tredje ikon fra venstre. I pop op-menuen skal du vælge Rediger postindstillinger, hvorefter et nyt vindue åbnes.
- I optagetilstand skal du vælge Optag på disk og derefter indstille Optag for denne varighed på det ønskede tidspunkt. I optagelsesindstillingerne i det samme vindue skal du begrænse optagehastigheden til 5 (Hz) og vælge det sted, hvor optagelserne skal gemmes.
- For at indstille billedhastigheden skal du lukke det eksisterende vindue, åbne Rediger i hovedmenuen og vælge Indstillinger. I højre del af det åbnede vindue skal du indtaste 5 i Target Frame Rate. I det samme vindue nedenfor skal du vælge Genvejstast / Remote Start Can Stop Record, og vælg I rullemenuen I Start / Stop-tilstand.
BEMÆRK: Prøv at lave de kortest mulige film med den lavest mulige billedhastighed, da det er hukommelseskrævende. Ved disse indstillinger vil en post have ca. 100 Mb.
- Mens deltagerne hviler, monteres det termiske kamera (detektortype: ukølet mikrobolometr; detektorafstand: 17 μm; kameraspektralområde: 7,5-14,0 μm; termisk følsomhed: 20 mK ved 30 °C; linser: 36 mm; opløsning: 1024 pixels x 768 pixels; øjeblikkeligt synsfelt [IFOV]: 0,47 mRad) på stativet og placerer det 1 m væk fra det sted, hvor deltageren sidder.
- Placer deltageren, så det supraklavikulære område af nakken over kravebenet, hvor BAT er placeret (figur 1), er i en brændvidde på 1 m, og optag en kortfilm (10-15 s) med en billedhastighed på 5 fps ved at trykke på F5-tasten . Optagelsen stopper på det angivne tidspunkt.
- I rummet på tidspunktet for målingerne skal du sikre dig, at kun deltageren og den person, der udfører målingerne, er til stede. Undgå luftbevægelse eller træk (f.eks. fra aircondition). Sørg for, at deltagerne er væk fra koldt træk, sollys (direkte eller indirekte) eller enhver varmekilde som pærer.
- Hvis det er passende, måles blodglukosekoncentrationerne i kapillærblod fra fingerspidsen med et standard glucometer og kropstemperaturen ved hjælp af et aksillært termometer.
- Sørg for, at alle deltagere spiser det samme måltid. Vær opmærksom på fødevarebegrænsningerne og kravene hos de testede emner (for eksempel måltidet til diabetespatienter). Alle deltagere, herunder kontrol (sunde) mennesker og deltagere med metaboliske lidelser, bør spise det samme måltid.
BEMÆRK: For flere detaljer om måltider, som diabetespatienter kan forbruge, kontakt en lokal endokrinolog eller diskuter det med deltagerne, der lider af diabetes mellitus. - På det ønskede tidspunkt efter et måltid skal du foretage den nye optagelse ved at trykke på F5 ved hjælp af de samme indstillingsværdier. Gentag ikke den indstillede protokol for optagelser. Gentag målingerne 30 min, 1 time, 2 timer og 3 timer efter et måltid12. For dit specifikke studiedesign kan tiden efter et måltid være kortere eller længere, men vi anbefaler mindst de første tre tidspunkter.
OBS: Begrænsningen af antallet af deltagere er fire til seks, selvom målingerne sker hurtigt. Med et højere antal deltagere vil forsinkelsestiden for nogle være for lang.
2. Måling af aktivering af brunt fedtvæv efter et måltid hos forsøgsdyr
BEMÆRK: Da dyrene er opstaldet i et dyreanlæg med reguleret stuetemperatur og en dag/nat-cyklus på 12 timer/12 timer, kan forsøgene udføres i løbet af en hvilken som helst sæson. Rumtemperaturen under forsøg bør være mellem 22 °C og 27 °C. I denne undersøgelse blev seks hundyr i diestrus og seks mandlige vildtypedyr (WT) C57Bl/6NCrl undersøgt
- Bedøv dyrene i henhold til institutionens etiske retningslinjer. I denne undersøgelse blev anæstesi udført ved hjælp af i.p. injektioner af ketamin / xylazin (henholdsvis 80-100 mg / kg og 6-8 mg / kg). Påfør øjengel på begge øjne for at forhindre hornhindetørring under anæstesi. Testdyrenes interscapulære områder barberes dagen før forsøgene (hudområdet mellem skulderbladene) ved hjælp af en trimmer til små dyr.
- Dagen før forsøgene bestemmer også fasen af østruscyklussen hos kvindelige dyr.
BEMÆRK: Fasen af østruscyklussen bestemmes af vaginale udstrygninger.- Dyp en vatpind i steril saltopløsning ved stuetemperatur (0,9% NaCl) og indsæt den i vagina. Skrab forsigtigt vaginalvæggen med vatpinden, spred de vedhæftede celler på et glasglas, og lad det lufttørre.
- Sæt dyrene tilbage i deres bure. Plet cellerne med 500 μL 0,1% cresylviolet acetat i 1 min, hvorefter de skylles 3 gange med vand.
- Se cellerne under et lysmikroskop med 100x forstørrelse og lysstyrkebelysning. Bestem fasen af østruscyklussen baseret på antallet af leukocytter og nukleerede og cornified epitelceller observeret i udstrygningen25.
- Fjern dyrenes mad aftenen før forsøgene (faste natten over) med vand ad libitum. Den bedste måde er at overføre dyrene til nye rene bure for at undgå mulige rester af mad i burene.
- Om morgenen på forsøgsdagen skal du forberede det termiske kamera og optagelsesindstillingerne som gjort for at teste de menneskelige deltagere.
- Forstyr ikke eller forårsage stress for dyrene, før du udfører IR-målinger. Placer forsigtigt dyret i et rent bur (sikrer, at der ikke er nogen virkninger af andre dyrs duft på dyrets sympatiske system). Placer buret under det termiske kamera i en brændvidde på 1 m. Optag en film ved at trykke på F5.
- Vej madpillen, før du giver den til hvert dyr, så fødeindtagelsen kan beregnes. Lad dyret spise i 30 minutter i buret og vej madpillen igen efter måltidet. I denne undersøgelse spiste hundyr 0,038 ± 0,004 g mad / kropsvægt.
BEMÆRK: Hvis du beslutter dig for at måle blodsukkerkoncentrationer, skal du udføre målingerne før et måltid, men efter IR-målinger for at sikre, at dette ikke fører til BAT-aktivering af det sympatiske system. - Gentag IR-målingerne på det ønskede tidspunkt efter start af et måltid (normalt 30 min, 1 time og 2 timer efter et måltid)17,26.
- Når alle forsøgene er afsluttet, testes østruscyklussen igen hos hundyr som beskrevet ovenfor (hundyr kan forlade den ønskede fase af brunstcyklussen hurtigere end forventet).
3. Analyse af de termiske optagelser
BEMÆRK: Den termiske kamerasoftware beregner objektets temperatur ved hjælp af fem variabler.
- Indstil følgende variabler i softwaren før analyse: hudemissivitet, e = 0,9815,27, reflekteret stuetemperatur (beregnet ud fra billedet af aluminiumsfolie), lufttemperatur, relativ luftfugtighed, afstand til objektet = 1 m. Udfør analysen ved hjælp af softwaren med disse værdier.
BEMÆRK: Den foretrukne farvepalet er regnbue, da den bruger flere nuancer, hvilket giver mulighed for lettere påvisning af BAT over kravebenet. - For hver film skal du indtaste de anførte variabler i kamerasoftwaren i højre side af hovedvinduet. Vælg det passende billede (billede) fra filmen ved at flytte afspilningshovedet nederst på skærmen eller trykke på knappen Pause .
- Vælg interesseområdet (ROI) ved at vælge den ønskede form på området i venstre side af hovedvinduet. Vælg den form, der bedst svarer til hudområdet over eller mellem kravebenene.
- Når ROI er valgt, vises de minimale, maksimale og gennemsnitlige temperaturer for ROI på højre side. På billedet repræsenterer den røde trekant punktet med maksimal registreret temperatur, og den blå trekant repræsenterer den minimale registrerede temperatur. Gentag dette trin for flere billeder for at være sikker på, at den målte temperatur er stabil i nogle få sekunder af optagelsen.
- Træk de maksimale temperaturer i hudområdet over BAT før et måltid fra de maksimale temperaturer efter et måltid for at bestemme stigningen i postprandial BAT-aktivitet hos forsøgsdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nemmeste måde at bestemme BAT-aktivitet på er at trække den maksimale hudtemperatur over BAT før og efter et måltid hos mennesker. En bedre måde at beregne BAT-aktivitet på er at vælge to områder af interesse: hudområdet over BAT, som er placeret i det supraklavikulære område, og det interklavikulære område af huden, hvor der ikke findes BAT-væv hos mennesker, udpeget som referenceområde (ifølge PET-CT; Figur 1). BAT-aktivitet bestemmes derefter let ved subtraktion af disse to temperaturer. Som vist i figur 1 blev BAT-aktiviteten bestemt til 1,8 °C. For at bestemme aktiveringen af BAT efter fodring blev dette gentaget på bestemte tidspunkter efter et måltid12. I denne undersøgelse udførte vi eksperimenter med tre kvindelige deltagere. Lignende resultater blev opnået fra deltager 1 og deltager 2 med BMI på henholdsvis 23 kg / m 2 og 34 kg / m2. Deltager 3 havde det laveste BMI (18 kg/m2) og den højeste stigning i BAT-aktivitet efter et måltid (figur 1B, venstre). Den maksimale temperatur på det supraklavikulære område af huden er ikke en god repræsentation af BAT-aktivitet, da der ikke er noget fald i hudtemperaturen, selv 3 timer efter et måltid (figur 1B, højre). På grund af forskelle i BAT-aktivitet blandt den menneskelige befolkning bør analysen af resultaterne udføres individuelt, og/eller valg af deltager til undersøgelsen bør udføres meget omhyggeligt. Der er ikke en sådan forskel i BAT-aktiviteten hos forsøgsdyr, da de er nært beslægtede.
Den første fordel ved denne metode sammenlignet med brugen af PET-CT (18F-FDG) er, at den måler BAT-aktivitet uanset varmekilden. Af den grund er IR-termografi meget mere følsom og repræsenterer mere sandfærdigt BAT-aktiviteten under forskellige fysiologiske eller patofysiologiske forhold. Denne metode kan bruges til at bestemme de fysiologiske forhold, der fører til ændringer i BAT-aktivitet, såsom alder, køn eller fase af brunstcyklussen. Hos mennesker er en ekstra fordel evnen til at bestemme de patofysiologiske ændringer i BAT-aktivitet i metaboliske sygdomme som fedme og diabetes mellitus type 2. En særlig fordel kunne ses, når man sammenligner BAT-aktiviteten hos mennesker med høj blodglukosekoncentration med sunde kontroller, da den radioaktive glukose i PET-CT konkurrerer med de samme glukosetransportører som glukose i kroppen, hvilket fører til falske negative resultater eller fejlagtige fremstillinger af BAT-aktivitet.
En mulig bekymring er forskellene i hudens tykkelse, især det subkutane hvide fedtvæv, som kan ændre hudtemperaturen over BAT hos forskellige forsøgspersoner28. Dette problem kan undgås ved at sammenligne BAT-aktiveringen før og efter et måltid. Normalt bestemmes aktiviteten og den efterfølgende betydning for forskellige patofysiologiske tilstande ved BAT-aktivering efter kold eksponering. Denne type BAT-aktivering er imidlertid sæsonbestemt og hos mennesker (sammenlignet med dyr i vildmarken) ikke særlig vigtig. For at bestemme virkningerne af BAT-aktivitet på hverdagen såvel som glukosehomeostase er BAT-aktivering efter et måltid efterfulgt af glukose- og fedtsyreudnyttelse den rigtige måde.
Man skal være opmærksom på de målinger, der udføres i varme omgivelser eller for tidligt efter muskelaktivitet. Muskelaktivitet øger kropstemperaturen, hvilket fører til vasodilatation i huden (figur 2). Når der ikke er noget synligt varmere hudområde over BAT sammenlignet med de omgivende hudområder, skal optagelserne udelukkes fra undersøgelsen.
BAT-aktivitet i laboratoriedyr bestemmes af den maksimale temperatur af BAT, der ligger mellem skulderbladet (interscapular BAT, iBAT) og hudens gennemsnitstemperatur over iBAT. Det er lettere at måle hudens gennemsnitstemperatur over BAT hos forsøgsdyr, da den er mere lokaliseret end hos mennesker (figur 3). I dette studie blev ændringerne i BAT-aktivitet efter et måltid målt hos kvindelige WT-dyr i diestrus (28,2 ± 0,5 uger gamle). Som vist i figur 3 blev statistisk signifikante ændringer i BAT-aktivitet bestemt 30 minutter efter et måltid, men kun når den maksimale temperatur blev målt (p < 0,05). Når BAT-aktiviteten blev præsenteret som ændringer i gennemsnitstemperaturer, var ændringen ikke signifikant (p = 0,066). Derfor er præsentation af BAT-aktiviteten via ændringer i den maksimale temperatur i det interscapulære hudområde en bedre måde at præsentere resultaterne på. Denne ændring i BAT-aktiviteten var positivt korreleret med mængden af indtaget føde (r = 0,65).
De største bekymringer for begge forsøgspersoner er de biologiske forskelle i BAT-aktivering hos han- og hundyr og unge og gamle dyr samt forskellene i BAT-aktivitet under brunstcyklus17. Der skal lægges særlig vægt på den tid, der er gået fra det sidste måltid, hvilket vil være svært at estimere, hvis ovenstående protokol ikke følges. At udføre eksperimenter på samme tid om morgenen er ikke præcist nok17.
En yderligere bekymring ved måling af BAT-aktivitet er at undgå stress hos dyrene så meget som muligt. Enhver forstyrrelse vil øge sympatiaktiviteten og dermed BAT-aktiviteten16. Desuden kan de fleste fejl, der involverer temperaturregistreringer, forekomme, hvis musenes interscapulære område ikke barberes ordentligt, hvilket kan føre til måling af det forkerte område af huden.
Figur 1: Infrarød termografi. (A) Der vælges to hudområder: et over det brune fedtvæv (BAT; supraklavikulært område) og et andet i det interklavikulære område (intet BAT-væv under huden i dette områdereferencepunkt). BAT-lokationen præsenteres som det varmeste område over kravebenet. Den skematiske gengivelse af BAT-placeringen i nakken ifølge PET-CT er vist i venstre figur. Temperaturer er maksimale temperaturer målt i omkransede hudområder. Stangen repræsenterer 5 cm. (B) Forskellene mellem maksimale temperaturer i begge hudområder præsenteres for hver deltager, hvilket viser stigningen i BAT-aktivitet 2 timer efter et måltid (til venstre). BAT-aktivitet kan ikke præsenteres ved hudens maksimale temperaturer over BAT (højre). Resultaterne præsenteres som middelværdien ± standardfejl i middelværdien. * p < 0,05 sammenlignet med startværdien (parret ANOVA). Forkortelse: SC = suprascapular. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: De forhold, hvor BAT-aktiviteten ikke kan måles. Figuren repræsenterer de forhold, hvor det ikke er muligt at bestemme BAT-aktivitet på grund af øget vasodilatation af hudens blodkar. Stangen repræsenterer 5 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Brunt fedtvæv i laboratoriemus. (A,B) Interscapular brunt fedtvæv (BAT) aktiveres efter kold eksponering og vises først derefter som 18F-FDG-akkumulering ved PET-CT. Aktiviteten af BAT kunne ses med et termisk kamera uden kuldeeksponering. C) BAT's placering i den termiske scanning svarer til den BAT, der vises på PET-CT-billedet med en pil. Det barberede område er større end BAT for at kunne se alle temperaturændringer (placeringen af Tmax kunne ikke forudsiges perfekt, og i nogle undersøgelser kan gennemsnitstemperaturen måles). Stangen repræsenterer 1 cm. (D) De målte maksimale og gennemsnitlige temperaturer af huden over BAT for seks hunmus i diestrus er præsenteret. Resultaterne præsenteres som middelværdien ± standardfejl i middelværdien. * p < 0,05 sammenlignet med startværdien (parret ANOVA). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nylige undersøgelser viser voksende beviser for den fysiologiske regulering og betydningen af BAT-aktivitet hos voksne mennesker og dyr i udviklingen af fedme og diabetes mellitus. Desuden er mulig BAT-aktivering af eksogene aktivatorer ved at blive et mål for medicinalvirksomheder. For at kunne estimere den fysiologiske regulering og patofysiologiske betydning af BAT i meget byrdefulde sygdomme samt opdage en potentiel terapeutisk tilgang, bliver infrarød termografi den foretrukne metode. Selv om IR-teknologien er ved at udvikle sig som en ny metode til måling af BAT-aktivitet 12,13,14,15,17, bør der ikke lægges særlig vægt på selve den anvendte metode, men på de fysiologiske egenskaber ved BAT-aktivering. Man bør være særlig opmærksom på køn, alder, fase af brunstcyklussen, fodringsstatus og mulig stress hos menneskelige deltagere og forsøgsdyr.
Målinger af stigningen i BAT-aktivitet efter et måltid udført på mennesker og forsøgsdyr er ret ens12,17. Kritiske trin i udførelsen af disse målinger omfatter undgåelse af stress og muskelaktivitet (dyr bør ikke forstyrres, før de udfører målinger). For kvindelige deltagere bør der tages hensyn til de funktionelle forskelle i BAT-aktivitet under brunstcyklussen (menstruationscyklus). Desuden skal huden være bar (dyrene skal barberes dagen før forsøgene udføres for at undgå unødig stress). Desuden er det meget vigtigt at indstille kamerasoftwaren korrekt for at få den bedst mulige termiske opløsning. For at præsentere dataene som termiske billeder er den bedste måde at vælge en ordentlig farvepalet, der passer til den pågældende undersøgelse. Hvis protokollen følges korrekt, er der mindre mulighed for at lave fejl ved udførelse af IR-termografi.
Begrænsningen ved metoden er, at det ikke er muligt uden en lille bekymring at sammenligne BAT-aktiviteten mellem mennesker med forskellige mængder subkutant fedt (eller fede dyr med dyr med normal kropsvægt). For at undgå dette problem bør det samme emne anvendes som kontrolperson ved at måle BAT-aktiviteten før og efter et måltid. Beregningen af stigningen i BAT-aktivitet efter et måltid vil eliminere forskellene i varmefordeling fra den subkutane BAT til hudoverfladen.
Rapportering af BAT-aktivitet gennem ændringer mellem de maksimale hudtemperaturer i begge hudområder er efter vores mening en bedre måde, da det eliminerer forskellene i BAT-størrelse og/eller udpeget hudområde i de resultater, der opnås ved gennemsnitlige temperaturmålinger29.
Som tidligere nævnt er den foretrukne metode til måling af BAT-aktivitet til dato PET-CT ved anvendelse af radioaktiv glucose (18F-FDG). Denne metode har over tid vist sig ikke at være følsom nok, dens anvendelse af radioaktivt materiale er bekymrende, og den er meget dyr. PET-CT er ubrugelig til bestemmelse af BAT-aktivering efter et måltid. 18 F-FDG-akkumulering i BAT efter et måltid er næppe synlig10 og betragtes som et negativt resultat. For nylig blev det foreslået, at BAT-aktivering er mere udtalt i den menneskelige befolkning og derfor bliver stadig vigtigere i udviklingen og spredningen af metaboliske sygdomme7. Et forsøg på at løse dette problem er at måle BAT-volumen ved MR hos prædiabetiker og patienter med T2DM med insulinresistens11. Mængden af BAT giver imidlertid ingen oplysninger om aktiviteten af BAT og udnyttelsen af glukose og fedtsyrer, hvilket er vigtigt hos diabetespatienter.
Etablering af IR-termografi som en valgfri metode til måling af BAT-aktivitet, især hos mennesker med høj blodsukkerkoncentration, vil have en enorm indflydelse på feltet. IR-termografi anvendes til bestemmelse af kuldeinduceret aktivering af BAT 13,14,15 og for nylig BAT-aktivering efter et måltid hos raske frivillige 12 og forsøgsdyr 17. Den postprandiale BAT-aktivering er mindre hos kvinder og ældre forsøgspersoner uanset art. Desværre er størstedelen af forskningen i BAT-aktivering og metaboliske undersøgelser helt blevet udført på mandlige forsøgspersoner (mandlige forsøgsdyr eller mænd). Problemet med denne fremgangsmåde er, at den ignorerer virkningen af østruscyklusfasen på BAT-aktivitet30.
Endelig vil IR-termografi gøre det muligt at undersøge den fysiologiske og patofysiologiske betydning af BAT i forskellige befolkningsgrupper, især hos præ- og postmenopausale kvinder, som der mangler undersøgelser for.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af den kroatiske videnskabsfonds forskningsbevilling (IP-2018-01- 7416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% cresyl violet acetate | Commonly used chemical | ||
| Device for measuring air temperature and humidity | Kesterl | Kestrel 4200 | Certificat of conformity |
| External data storage | Hard Drive with at least 1 TB | ||
| Glass microscopic slides | Commonly used | ||
| Small cotton tip swab | Urethral swabs | ||
| Software for analysis | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | FLIR Tools | |
| Software for meassurements | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | ResearchIR software | FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit) |
| Thermac Camera | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | FLIR T-1020 |
References
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Morrison, S. F., Nakamura, K. Central neural pathways for thermoregulation. Frontiers in Bioscience. 16 (1), 74-104 (2011).
- Contreras, C., et al.
- Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 96 (1), 192-199 (2011).
- Pfannenberg, C., et al. Impact of age on the relationships of brown adipose tissue with sex and adiposity in humans. Diabetes. 59 (7), 1789-1793 (2010).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Vosselman, M. J., et al. Brown adipose tissue activity after a high-calorie meal in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 98 (1), 57-64 (2013).
- Hibi, M., et al. Brown adipose tissue is involved in diet-induced thermogenesis and whole-body fat utilization in healthy humans. International Journal of Obesity. 40 (11), 1655-1661 (2016).
- Fenzl, A., Kiefer, F. W. Brown adipose tissue and thermogenesis. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 19 (1), 25-37 (2014).
- Koksharova, E., et al. The relationship between brown adipose tissue content in supraclavicular fat depots and insulin sensitivity in patients with type 2 diabetes mellitus and prediabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (2), 96-102 (2017).
- Habek, N., Kordić, M., Jurenec, F., Dugandžić, A. Infrared thermography, a new method for detection brown adipose tissue activity after a meal in humans. Infrared Physics & Technology. 89, 271-276 (2018).
- Lee, P., Ho, K. K. Y. Hot fat in a cool man: Infrared thermography and brown adipose tissue. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13 (1), 92-93 (2011).
- Ang, Q. Y., et al. A new method of infrared thermography for quantification of brown adipose tissue activation in healthy adults (TACTICAL): A randomized trial. Journal of Physiological Sciences. 67 (3), 395-406 (2017).
- Jang, C., et al. Infrared thermography in the detection of brown adipose tissue in humans. Physiological Reports. 2 (11), 12167 (2014).
- Dodd, G. T., et al. Leptin and insulin act on POMC neurons to promote the browning of white fat. Cell. 160 (1-2), 88-104 (2015).
- Habek, N., et al. Activation of brown adipose tissue in diet-induced thermogenesis is GC-C dependent. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 472 (3), 405-417 (2020).
- Burke, L. K., et al. Sex difference in physical activity, energy expenditure and obesity driven by a subpopulation of hypothalamic POMC neurons. Molecular Metabolism. 5 (3), 245-252 (2016).
- Glumer, C., Jorgensen, T., Borch-Johnsen, K. Prevalences of diabetes and impaired glucose regulation in a Danish population: The Inter99 study. Diabetes Care. 26 (8), 2335-2340 (2003).
- Sicree, R. A., et al. Differences in height explain gender differences in the response to the oral glucose tolerance test-the AusDiab study. Diabetic Medicine. 25 (3), 296-302 (2008).
- van Genugten, R. E., et al. Effects of sex and hormone replacement therapy use on the prevalence of isolated impaired fasting glucose and isolated impaired glucose tolerance in subjects with a family history of type 2 diabetes. Diabetes. 55 (12), 3529-3535 (2006).
- Williams, J. W., et al. Gender differences in the prevalence of impaired fasting glycaemia and impaired glucose tolerance in Mauritius. Does sex matter. Diabetic Medicine. 20 (11), 915-920 (2003).
- Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 215-223 (2013).
- Brasil, S., et al. A systematic review on the role of infrared thermography in the brown adipose tissue assessment. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 21 (1), 37-44 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Crane, J. D., Mottillo, E. P., Farncombe, T. H., Morrison, K. M., Steinberg, G. R. A standardized infrared imaging technique that specifically detects UCP1-mediated thermogenesis in vivo. Molecular Metabolism. 3 (4), 490-494 (2014).
- Hartwig, V., et al. Multimodal imaging for the detection of brown adipose tissue activation in women: A pilot study using NIRS and infrared thermography. Journal of Healthcare Engineering. 2017, 5986452 (2017).
- James, L., et al. The use of infrared thermography in the measurement and characterization of brown adipose tissue activation. Temperature. 5 (2), 147-161 (2018).
- Folgueira, C., et al. Hypothalamic dopamine signaling regulates brown fat thermogenesis. Nature Metabolism. 1 (8), 811-829 (2019).
- Ratko, M., Habek, N., Kordić, M., Dugandžić, A. The use of infrared technology as a novel approach for studies with female laboratory animals. Croatian Medical Journal. 61 (4), 346-353 (2020).
