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Medicine

Infrarot-Thermografie zur Detektion von Veränderungen der Aktivität des braunen Fettgewebes

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64463
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 2,3
1MKP Ltd., 2Croatian Institute for Brain Research, University of Zagreb, School of Medicine, 3Department of Physiology, University of Zagreb, School of Medicine

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Messung der Aktivität von braunem Fettgewebe nach einer Mahlzeit bei Menschen und Versuchstieren vor.

Abstract

Die Messung der Aktivität des braunen Fettgewebes (BAT) mittels Positronen-Emissions-Tomographie, Computertomographie (PET-CT) über die Akkumulation von 18F-Fluorodeoxyglukose (FDG) nach einer Mahlzeit oder bei adipösen oder diabetischen Patienten versagt als Methode der Wahl. Der Hauptgrund dafür ist, dass 18F-FDG mit der postprandialen hohen Glukoseplasmakonzentration um den gleichen Glukosetransporter auf der Membran von BAT-Zellen konkurriert. Darüber hinaus nutzt BAT auch Fettsäuren als Energiequelle, was bei PET-CT nicht sichtbar ist und bei adipösen und diabetischen Patienten zusammen mit der Glukosekonzentration verändert werden kann. Um die physiologische Bedeutung von BVT bei Tier und Mensch abzuschätzen, wird daher ein neues Infrarot-Thermografieverfahren angewendet, das in neueren Publikationen verwendet wird.

Nach dem nächtlichen Fasten wurde die BAT-Aktivität mittels Infrarot-Thermografie vor und nach einer Mahlzeit bei Probanden und weiblichen Wildtyp-Mäusen gemessen. Die Kamerasoftware berechnet die Temperatur des Objekts anhand des Abstands zum Objekt, des Emissionsgrades der Haut, der reflektierten Raumtemperatur, der Lufttemperatur und der relativen Luftfeuchtigkeit. Bei Mäusen war der rasierte Bereich oberhalb der BAT eine Region von Interesse, für die Durchschnitts- und Maximaltemperaturen gemessen wurden. Die Phase des Brunstzyklus bei weiblichen Mäusen wurde nach einem Experiment durch Vaginalausstriche bestimmt, die mit Kresylviolett (0,1%) Färbelösung gefärbt wurden. Bei gesunden Probanden wurden zwei Hautbereiche des Halses ausgewählt: der supraklavikuläre Bereich (oberhalb des Schlüsselbeins, wo BAT-Zellen vorhanden sind) und der interklavikuläre Bereich (zwischen den Schlüsselbeinen, wo kein BAT-Gewebe nachgewiesen werden kann). Die BVT-Aktivität wird durch die Subtraktion dieser beiden Werte bestimmt. Auch die durchschnittliche und maximale Temperatur von Hautarealen konnte bei Tieren und Menschen bestimmt werden.

Es konnte gezeigt werden, dass Veränderungen der BVT-Aktivität nach einer Mahlzeit, die mittels Infrarot-Thermografie, einer nicht-invasiven und sensitiveren Methode, gemessen wurden, bei Labortieren von Geschlecht, Alter und Phase des Brunstzyklus abhängen. Im Rahmen der ernährungsinduzierten Thermogenese ist die BAT-Aktivierung beim Menschen auch nachweislich geschlechts-, alters- und body-mass-index-abhängig. Die weitere Bestimmung der pathophysiologischen Veränderungen der BAT-Aktivität nach einer Mahlzeit wird für Teilnehmer mit hohen Glukoseplasmakonzentrationen (Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2) sowie bei verschiedenen Versuchstieren (Knock-out-Mäuse) von großer Bedeutung sein. Diese Methode ist auch ein variables Werkzeug, um mögliche aktivierende Medikamente zu bestimmen, die die BAT-Aktivität verjüngen könnten.

Introduction

Braunes Fettgewebe (BAT) speichert im Gegensatz zu weißem Fettgewebe (WAT) nicht, sondern verbraucht Energie. Bei sympathischer Stimulation nutzt BAT Fettsäuren und Glukose und erzeugt Wärme durch die Aktivierung des Entkopplungsproteins 1 (UCP1). Die Funktion von UCP1 besteht darin, einen H+-Gradienten zwischen zwei mitochondrialen Membranen zu nutzen, um Wärme anstelle von ATP zu erzeugen. Die BVT hat die Funktion, die Wärmeerzeugung unter kalten Bedingungen zu erhöhen, was zu einem Anstieg des Energieverbrauchsführt 1. Nach Kälteexposition hemmen sensorische Inputs der Haut wärmeempfindliche Neuronen im Nucleus median präoptischer (MnPO) des hypothalamischen präoptischen Bereichs (POA), was die hemmende Wirkung von POA-Neuronen auf den rostralen Raphe pallidus (rRPa) verringert. Die Aktivierung von rRPa-Neuronen erhöht die sympathische Aktivität, worauf eine Erhöhung der BAT-Aktivität folgt 2,3. Die kälteinduzierte BAT-Aktivierung verbessert die Insulinsensitivität beim Menschen4, und diese Aktivität ist bei Menschen mit erhöhtem Body-Mass-Index (BMI) und Alter 1,5,6,7 verringert.

Abgesehen von seiner Rolle bei der kälteinduzierten Thermogenese nimmt die Glukoseaufnahme im BAT nach einer Mahlzeit in der mageren männlichen Bevölkerung zu, was zur ernährungsinduzierten Thermogenese (DIT) beiträgt, die bei BVT-positiven männlichen Probanden höher ist 8,9. Das modernste Verfahren zur Messung der BAT-Aktivität ist die Positronen-Emissions-Tomographie-Computertomographie, bekannt als PET-CT. Diese Methode bestimmt die BAT-Aktivität durch Messung der Akkumulation des Radiotracers Fluordesoxyglucose (18F-FDG). Die PET-CT ist jedoch nicht die Methode der Wahl, um die Aktivierung von BAT nach einer Mahlzeit nachzuweisen. Einer der Gründe dafür ist, dass 18F-FDG nach einer Mahlzeit mit der postprandialen Hyperglykämie um denselben Glukosetransporter konkurriert, was es für die Bestimmung der BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit ungeeignet macht, insbesondere wenn die BAT-Aktivität bei gesunden und diabetischen Teilnehmern mit möglichen Unterschieden in der Blutzuckerkonzentration verglichen wird. Darüber hinaus nutzt BAT Fettsäuren als Energiequelle für die Wärmeerzeugung, die bei PET-CT nicht sichtbar ist. 18. Sonstiges Die F-FDG-Akkumulation in BVT nach einer Mahlzeit ist kaum sichtbar10 und wird daher in den meisten Fällen als negatives Ergebnis interpretiert. Es überrascht nicht, dass kürzlich vermutet wurde, dass die Aktivierung von BAT in der menschlichen Bevölkerung stärker ausgeprägt ist, als wir bisher angenommen hatten. Daher ist ein neuer Ansatz zum Nachweis der BAT-Aktivität und ihrer Beteiligung an Stoffwechselstörungen erforderlich7. Ein Versuch, dieses Problem zu lösen, besteht darin, das BVT-Volumen mit Magnetresonanztomographie (MRT) bei Prädiabetikern und Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM) mit Insulinresistenz zu messen11. Das mittels MRT gemessene BVT-Volumen ist jedoch kein ausreichender Indikator für die Abschätzung der täglichen Funktion und Verwendung von Glukose und Fettsäuren mittels BAT. Um reale Unterschiede in der BAT-Aktivität bei gesunden und T2DM-Patienten abschätzen zu können, ist daher ein neuer Ansatz erforderlich, der die Möglichkeit bietet, den pathologischen Mechanismus der BAT-Fehlfunktion bei T2DM-Patienten herauszufinden.

Um die Aktivierung von BVT zu bestimmen, führten wir Messungen der BAT-Wärmeproduktion vor und nach einer Mahlzeit mittels Infrarot (IR)-Thermografie durch (Abbildung 1)12,13. Die Etablierung der IR-Thermografie als Methode der Wahl zur Messung der BAT-Aktivität nach einer Mahlzeit bei gesunden und adipösen Personen oder Patienten mit Diabetes mellitus wird einen großen Einfluss auf das Feld haben. Bis heute wird die IR-Thermografie zur Bestimmung der kälteinduzierten Aktivierung von BVT13,14,15 eingesetzt. In der jüngeren Menschheitsgeschichte ist die kälteinduzierte BAT-Aktivität nicht mehr sehr ausgeprägt (aufgrund der richtigen Beheizung der Lebensräume, der richtigen Kleidung), während die BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit jeden Tag erfolgt. Darüber hinaus ist die physiologische Regulation dieser beiden BAT-Funktionen über den Hypothalamus völlig unterschiedlich. Nach einer Mahlzeit führt die Aktivierung von Proopiomelanocortin (POMC)-exprimierenden Neuronen im Nucleus arcuatus hypothalamicuatus (Arc) zu einer Erhöhung der Aktivität des Sympathikus über rRPa16. Die kälteinduzierte Aktivierung von BAT, gemessen durch IR-Thermografie oder PET-CT, ist ungeeignet, wenn sie als Maß für die tägliche BAT-Aktivität verwendet wird. Auf eine erhöhte BAT-Aktivität nach einer Mahlzeit folgt eine Glukoseverwertung, die letztendlich für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase, der Insulinsensitivität und der täglichen Regulierung der Glukosekonzentration wichtig ist. Die postprandiale BAT-Aktivierung führt zu einem Anstieg des postprandialen Glukoseverbrauchs, gefolgt von einer Erhöhung der Wärmeproduktion und der Körpertemperatur (DIT). Es zeigte sich, dass dies abhängig von Geschlecht, Alter und BMIist 12. Ähnliche geschlechtsspezifische Unterschiede bei der BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit wurden bei männlichen und weiblichen Labormäusen beobachtet17. Diese Ergebnisse korrespondieren mit kürzlich entdeckten geschlechtsspezifischen Unterschieden in der Regulation von BAT von Burke et al., die zeigten, dass sich die hypothalamische Regulation der BAT-Bräunung über eine Subpopulation von POMC-Neuronen in männlichen und weiblichen Mäusen unterscheidet18. Die postprandiale Aktivierung von BAT ist bei Frauen, älteren Bevölkerungsgruppen und adipösen Menschen geringer. Die fehlende BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit (verminderte Glukoseverwertung) könnte zu einer höheren Prävalenz einer gestörten Glukosetoleranz bei Frauen führen 19,20,21,22. Leider wurden die meisten Studien zur BAT-Aktivierung nur an Männern durchgeführt. Durch die Aktivierung von BAT nach einer Mahlzeit erhöht sich die Glukoseaufnahme in der mageren männlichen Bevölkerung. Es ist nicht verwunderlich, dass nach BAT-Aktivierung die DIT bei BVT-positiven männlichen Probanden höher ist 8,9. Darüber hinaus verbessert die BAT-Transplantation bei männlichen Mäusen die Glukosetoleranz, erhöht die Insulinsensitivität und verringert das Körpergewicht und die Fettmasse23.

Die PET-CT versagt als Methode der Wahl zur Messung der BVT-Aktivität, insbesondere nach einer Mahlzeit. Daher wurde eine nicht-invasive und sensitivere Methode entwickelt. Die IR-Thermografie ermöglicht die Abschätzung der BAT-Aktivität bei verschiedenen Versuchstieren (Knock-out-Mäusen) sowie bei menschlichen Teilnehmern, unabhängig von Geschlecht, Alter oder den Auswirkungen verschiedener pathologischer Zustände auf die BAT-Aktivität. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die Einfachheit für Teilnehmer und Versuchstiere, die es uns ermöglicht, den potenziellen Nutzen einer BAT-Booster-Therapie abzuschätzen. Die neueren Studien, in denen die IR-Thermografie zur Bestimmung des physiologischen Verhaltens von BVT nach Kälteeinwirkung oder einer Mahlzeit eingesetzt wurde, werden in der aktuellen Veröffentlichung von Brasil et al.24 beschrieben.

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Protocol

Alle Versuchsverfahren an Versuchstieren wurden von der Nationalen Ethikkommission und dem Landwirtschaftsministerium genehmigt (EP 185/2018). Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Ethikkodex der Kroatischen Gesellschaft für Versuchstierkunde und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Alle Verfahren, die in Studien mit menschlichen Teilnehmern durchgeführt wurden, entsprachen der Deklaration von Helsinki und wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Zagreb (UP/I-322-01/18-01/56) genehmigt. In dieser Studie präsentieren wir die Ergebnisse von drei Teilnehmerinnen (BMI: 29 kg/m2 ± 5 kg/m2). Für die Teilnahme an der Studie und für die Präsentation der Daten wurde von allen Probanden eine informierte Einwilligung eingeholt.

1. Messung der Aktivierung von braunem Fettgewebe nach einer Mahlzeit beim Menschen

HINWEIS: Führen Sie die Experimente im Sommer durch, wenn die Tagestemperatur nicht unter 22 °C liegt, um die basale BAT-Aktivität so gering wie möglich zu halten.

  1. Wählen Sie die gesunden Kontrollteilnehmer sorgfältig aus (wenn die BAT-Aktivität unter pathologischen Bedingungen geschätzt werden soll), da die BAT-Aktivität von Geschlecht, Alter, BMI und sogar der Phase des Brunstzyklus abhängt.
    1. Um die Phase des Menstruationszyklus der Teilnehmerinnen abzuschätzen, stellen Sie ihnen Fragen zur Dauer ihres durchschnittlichen Menstruationszyklus und zum Datum des ersten Tages ihrer letzten Menstruation. Vergessen Sie nicht, das Datum der Experimente zu markieren.
      HINWEIS: Die richtige Auswahl passender Kontrollpersonen ist der schwierigste Teil klinischer Studien, da gesunde Kontrollpersonen und Teilnehmer mit pathologischen Zuständen so ähnlich wie möglich sein und sich nur in der untersuchten Krankheit unterscheiden sollten.
  2. Bitten Sie die Teilnehmer, sich gut auszuruhen, nicht zu frühstücken (Fasten - keine Kalorienaufnahme), sich in den Morgenstunden für die Experimente zu versammeln und sich mindestens 30 Minuten auszuruhen, um eine mögliche BAT-Aktivierung während der Muskelaktivität durch sympathische Aktivierung zu vermeiden.
  3. Bitten Sie die Teilnehmer, 15 Minuten vor den Messungen ihre Oberbekleidung auszuziehen, um die möglichen Auswirkungen einer Erwärmung der Hautoberfläche (thermische Auswirkungen der Kleidung) bei der Bestimmung der BVT-Ausgangsaktivität zu vermeiden. Führen Sie die Messungen bei geeigneter Raumtemperatur (22-27 °C) durch.
  4. Führen Sie Infrarotmessungen durch.
    1. Während sich die Teilnehmer ausruhen, montieren Sie die Wärmebildkamera (Detektortyp: ungekühltes Mikrobolometer; Detektorabstand: 17 μm; Kameraspektralbereich: 7,5-14,0 μm; thermische Empfindlichkeit: 20 mK bei 30 °C; Objektive: 36 mm; Auflösung: 1024 Pixel x 768 Pixel; momentanes Sichtfeld [IFOV]: 0,47 mRad) auf dem Stativ und positionieren Sie sie 1 m von der Stelle, an der der Teilnehmer sitzen wird.
      HINWEIS: Wenn die Messungen bei kälterem Wetter durchgeführt werden (Außenlufttemperaturen unter 15 °C bei 50 % Luftfeuchtigkeit), stellen Sie die Kamera auf Raumtemperatur und schalten Sie sie mindestens 1 Stunde lang ein, bevor Sie die Messungen durchführen. Kalte Geräte können nach dem Aufwärmen auf Raumtemperatur aufgrund der Autokalibrierung unterschiedliche Ergebnisse liefern.
    2. Schließen Sie die Wärmebildkamera gemäß den Anweisungen des Herstellers an einen Computer und eine Software an. Nehmen Sie Aluminiumfolie (zerknitterte und dann gestreckte Aluminiumfolie) in einer Brennweite von 1 m auf, um die reflektierte Temperatur des Raumes zu bestimmen, die als gemessene Temperatur dargestellt wird. Geben Sie in der Kamerasoftware die Entfernung von 0 m und den Emissionsgrad von 1 ein.
      HINWEIS: Die reflektierte scheinbare Temperatur ist ein Parameter, der erhalten wird, wenn der Emissionsgrad der Kamera auf 1,0 und der Abstand auf 0 m eingestellt ist und die Messungen auf zerknitterter und dann gereckter Aluminiumfolie durchgeführt werden. Die reflektierte scheinbare Temperatur stellt eine Annäherung an die gesamte auf den Detektor einfallende Infrarotstrahlung aus der Umgebung dar.
    3. Bestimmen Sie kurz vor Beginn der Messungen die Raumlufttemperatur und die Luftfeuchtigkeit (notwendig für eine spätere Analyse). Anstatt ein Wärmebild aufzunehmen, nehmen Sie einen Film auf. Wählen Sie später aus dem Film den bestmöglichen Bildrahmen für die Analyse aus, um die Möglichkeit des Verlusts wertvoller Daten zu verringern.
    4. Bevor Sie mit der Aufnahme beginnen, stellen Sie die folgenden Parameter ein: die Dauer der Videoaufnahme auf 10-15 s (oder einen anderen gewünschten Wert), die Bildrate auf 5 fps (Bilder pro Sekunde) oder einen anderen Wert (in unseren Händen sind 5 fps das maximal benötigte Maximum) und einen Speicherort auf der Festplatte, an dem der Film gespeichert werden soll, wie unten beschrieben.
      1. Wählen Sie in der Software über dem Hauptkamerafenster das dritte Symbol von links. Wählen Sie im Popup-Menü die Option "Datensatzeinstellungen bearbeiten", woraufhin ein neues Fenster geöffnet wird.
      2. Wählen Sie im Aufnahmemodus die Option Auf Datenträger aufzeichnen und legen Sie darunter den Datensatz für diese Dauer zum gewünschten Zeitpunkt fest. Begrenzen Sie in den Aufnahmeoptionen desselben Fensters die Aufnahmerate auf 5 (Hz) und wählen Sie den Ort, an dem die Aufnahmen gespeichert werden sollen.
      3. Um die Bildrate einzustellen, schließen Sie das vorhandene Fenster, öffnen Sie Bearbeiten im Hauptmenü und wählen Sie Einstellungen. Geben Sie im rechten Teil des geöffneten Fensters 5 in Target Frame Rate (Zielbildrate) ein. Wählen Sie im gleichen Fenster unten Hotkey/Remote-Start kann die Aufnahme stoppen und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Im Start/Stopp-Modus.
        HINWEIS: Versuchen Sie, die kürzestmöglichen Filme mit der niedrigstmöglichen Bildrate zu erstellen, da dies speicherintensiv ist. Bei diesen Einstellungen hat ein Datensatz ungefähr 100 MB.
  5. Positionieren Sie den Teilnehmer so, dass sich der supraklavikuläre Bereich des Halses über dem Schlüsselbein, in dem sich BAT befindet (Abbildung 1), in einer Brennweite von 1 m befindet, und nehmen Sie durch Drücken der Taste F5 einen Kurzfilm (10-15 s) mit einer Bildrate von 5 fps auf. Die Aufnahme wird zum angegebenen Zeitpunkt gestoppt.
  6. Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt der Messungen nur der Teilnehmer und die Person, die die Messungen durchführt, im Raum anwesend sind. Vermeiden Sie Luftbewegungen oder Zugluft (z. B. durch Klimaanlagen). Stellen Sie sicher, dass die Teilnehmer nicht in der Nähe von kalter Zugluft, Sonnenlicht (direkt oder indirekt) oder anderen Wärmequellen wie Glühbirnen sind.
  7. Messen Sie bei Bedarf die Blutzuckerkonzentrationen im Kapillarblut aus der Fingerkuppe mit einem handelsüblichen Blutzuckermessgerät und die Körpertemperatur mit einem Achselthermometer.
  8. Stellen Sie sicher, dass alle Teilnehmer die gleiche Mahlzeit zu sich nehmen. Achten Sie auf die Lebensmittelbeschränkungen und -anforderungen der getesteten Probanden (z. B. die Mahlzeit für Diabetiker). Alle Teilnehmer, einschließlich (gesunder) Kontrollpersonen und Teilnehmer mit Stoffwechselstörungen, sollten die gleiche Mahlzeit zu sich nehmen.
    HINWEIS: Für weitere Informationen zu den Mahlzeiten, die Diabetiker zu sich nehmen können, wenden Sie sich an einen Endokrinologen vor Ort oder besprechen Sie dies mit den Teilnehmern, die an Diabetes mellitus leiden.
  9. Machen Sie zum gewünschten Zeitpunkt nach einer Mahlzeit die neue Aufnahme, indem Sie F5 mit den gleichen Einstellwerten drücken. Wiederholen Sie nicht das eingestellte Protokoll für Aufnahmen. Wiederholen Sie die Messungen nach 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden und 3 Stunden nach einer Mahlzeit12. Für Ihr spezifisches Studiendesign kann die Zeit nach einer Mahlzeit kürzer oder länger sein, aber wir empfehlen mindestens die ersten drei Zeitpunkte.
    HINWEIS: Die Begrenzung der Teilnehmerzahl beträgt vier bis sechs, obwohl die Messungen schnell durchgeführt werden. Bei einer höheren Teilnehmerzahl wird die Verzögerungszeit für einige zu lang sein.

2. Messung der Aktivierung von braunem Fettgewebe nach einer Mahlzeit bei Versuchstieren

HINWEIS: Da die Tiere in einer Tierhaltung mit geregelter Raumtemperatur und einem Tag/Nacht-Zyklus von 12 h/12 h untergebracht sind, können die Experimente zu jeder Jahreszeit durchgeführt werden. Die Raumtemperatur während der Experimente sollte zwischen 22 °C und 27 °C liegen. In dieser Arbeit wurden sechs weibliche Tiere im Diestrus und sechs männliche Wildtyp-Tiere (WT) C57Bl/6NCrl untersucht.

  1. Betäuben Sie die Tiere gemäß den ethischen Richtlinien der Einrichtung. In dieser Studie wurde die Anästhesie mit i.p. Injektionen von Ketamin/Xylazin (80-100 mg/kg bzw. 6-8 mg/kg) durchgeführt. Tragen Sie Augengel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während der Anästhesie zu verhindern. Rasieren Sie die Schulterblattregionen der Versuchstiere einen Tag vor den Experimenten (den Hautbereich zwischen den Schulterblättern) mit einem Kleintiertrimmer.
  2. Bestimmen Sie am Tag vor den Experimenten auch die Phase des Brunstzyklus bei weiblichen Tieren.
    HINWEIS: Die Phase des Brunstzyklus wird durch Vaginalabstriche bestimmt.
    1. Tauchen Sie ein Wattestäbchen in sterile Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) bei Raumtemperatur und führen Sie es in die Vagina ein. Kratzen Sie die Scheidenwand vorsichtig mit dem Tupfer ab, verteilen Sie die angebrachten Zellen auf einem Glasobjektträger und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
    2. Setzen Sie die Tiere wieder in ihre Käfige. Färben Sie die Zellen 1 Minute lang mit 500 μl 0,1%igem Kresylviolettacetat und spülen Sie sie anschließend 3 Mal mit Wasser ab.
    3. Betrachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop mit 100-facher Vergrößerung und Hellfeldbeleuchtung. Bestimmen Sie die Phase des Brunstzyklus anhand der Anzahl der im Abstrich beobachteten Leukozyten und kernhaltigen und verhornten Epithelzellen25.
  3. Entfernen Sie das Futter der Tiere am Abend vor den Experimenten (Fasten über Nacht) mit Wasser ad libitum. Am besten ist es, die Tiere in neue, saubere Käfige umzusiedeln, um mögliche Futterreste in den Käfigen zu vermeiden.
  4. Bereiten Sie am Morgen des Experimentstages die Wärmebildkamera und die Aufnahmeeinstellungen so vor, wie sie für das Testen der menschlichen Teilnehmer vorgenommen wurden.
  5. Stören oder stressen Sie die Tiere nicht, bevor Sie IR-Messungen durchführen. Setzen Sie das Tier vorsichtig in einen sauberen Käfig (stellen Sie sicher, dass der Geruch anderer Tiere keine Auswirkungen auf das sympathische System des Tieres hat). Stellen Sie den Käfig in einer Brennweite von 1 m unter die Wärmebildkamera. Nehmen Sie einen Film auf, indem Sie F5 drücken.
  6. Wiegen Sie das Futterpellet, bevor Sie es jedem Tier geben, damit die Futteraufnahme berechnet werden kann. Lassen Sie das Tier 30 Minuten in seinem Käfig fressen und wiegen Sie das Futterpellet nach der Mahlzeit erneut. In dieser Studie fraßen weibliche Tiere 0,038 ± 0,004 g Futter/Körpergewicht.
    HINWEIS: Wenn Sie sich für die Messung der Blutzuckerkonzentration entscheiden, führen Sie die Messungen vor einer Mahlzeit, aber nach IR-Messungen durch, um sicherzustellen, dass dies nicht zu einer BAT-Aktivierung durch den Sympathikus führt.
  7. Wiederholen Sie die IR-Messungen zum gewünschten Zeitpunkt nach Beginn einer Mahlzeit (in der Regel 30 Minuten, 1 Stunde und 2 Stunden nach einer Mahlzeit)17,26.
  8. Nachdem alle Experimente abgeschlossen sind, testen Sie die Phase des Brunstzyklus bei weiblichen Tieren wie oben beschrieben erneut (weibliche Tiere können die gewünschte Phase des Brunstzyklus früher als erwartet verlassen).

3. Analyse der Wärmebildaufnahmen

Anmerkungen: Die Wärmebildkamera-Software berechnet die Temperatur des Objekts anhand von fünf Variablen.

  1. Stellen Sie vor der Analyse die folgenden Variablen in der Software ein: Emissionsgrad der Haut, e = 0,9815,27, reflektierte Raumtemperatur (wie aus dem Bild der Aluminiumfolie berechnet), Lufttemperatur, relative Luftfeuchtigkeit, Abstand zum Objekt = 1 m. Führen Sie die Analyse durch, indem Sie die Software mit diesen Werten verwenden.
    HINWEIS: Die bevorzugte Farbpalette ist Regenbogen, da sie mehr Farbtöne verwendet, was eine einfachere Erkennung von BAT über dem Schlüsselbein ermöglicht.
  2. Geben Sie für jeden Film die aufgelisteten Variablen in die Kamerasoftware auf der rechten Seite des Hauptfensters ein. Wählen Sie das passende Bild aus dem Film aus, indem Sie den Abspielkopf am unteren Bildschirmrand bewegen oder die Pause-Taste drücken.
  3. Wählen Sie den Bereich of Interest (ROI) aus, indem Sie die gewünschte Form des Bereichs auf der linken Seite des Hauptfensters auswählen. Wählen Sie die Form, die am besten zu dem Hautbereich über oder zwischen den Schlüsselbeinen passt.
  4. Wenn der ROI ausgewählt ist, werden die minimalen, maximalen und durchschnittlichen Temperaturen des ROI auf der rechten Seite angezeigt. Im Bild stellt das rote Dreieck den Punkt der maximal aufgezeichneten Temperatur dar, und das blaue Dreieck stellt die minimale aufgezeichnete Temperatur dar. Wiederholen Sie diesen Schritt für mehrere Bilder, um sicherzustellen, dass die gemessene Temperatur während einiger Sekunden der Aufnahme stabil ist.
  5. Subtrahieren Sie die maximalen Temperaturen des Hautareals oberhalb von BAT vor einer Mahlzeit von den maximalen Temperaturen nach einer Mahlzeit, um den Anstieg der postprandialen BAT-Aktivität bei Labortieren zu bestimmen.

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Representative Results

Der einfachste Weg, die BVT-Aktivität zu bestimmen, besteht darin, die maximale Hauttemperatur vor und nach einer Mahlzeit bei menschlichen Probanden über die BVT zu subtrahieren. Eine bessere Methode zur Berechnung der BAT-Aktivität besteht darin, zwei Bereiche von Interesse auszuwählen: den Hautbereich oberhalb des BAT, der sich im supraklavikulären Bereich befindet, und den interklavikulären Bereich der Haut, in dem beim Menschen kein BAT-Gewebe gefunden wird, der als Referenzbereich ausgewiesen ist (nach PET-CT; Abbildung 1). Die BAT-Aktivität lässt sich dann leicht durch die Subtraktion dieser beiden Temperaturen bestimmen. Wie in Abbildung 1 dargestellt, wurde die BVT-Aktivität mit 1,8 °C bestimmt. Um die Aktivierung von BAT nach der Fütterung zu bestimmen, wurde dies zu bestimmten Zeitpunkten nach einer Mahlzeit wiederholt12. In dieser Studie haben wir Experimente mit drei Teilnehmerinnen durchgeführt. Ähnliche Ergebnisse wurden von Teilnehmer 1 und Teilnehmer 2 mit BMIs von 23 kg/m2 bzw. 34 kg/m2 erzielt. Teilnehmer 3 hatte den niedrigsten BMI (18 kg/m2) und den höchsten Anstieg der BVT-Aktivität nach einer Mahlzeit (Abbildung 1B, links). Die maximale Temperatur im supraklavikulären Bereich der Haut ist kein guter Indikator für die BAT-Aktivität, da die Hauttemperatur auch 3 h nach einer Mahlzeit nicht abnimmt (Abbildung 1B, rechts). Aufgrund der Unterschiede in der BVT-Aktivität innerhalb der menschlichen Bevölkerung sollte die Analyse der Ergebnisse individuell durchgeführt werden, und/oder die Auswahl des Teilnehmers für die Studie sollte sehr sorgfältig erfolgen. Es gibt keinen derartigen Unterschied in der BVT-Aktivität bei Versuchstieren, da sie eng miteinander verwandt sind.

Der erste Vorteil dieser Methode gegenüber dem Einsatz der PET-CT (18F-FDG) besteht darin, dass sie die BVT-Aktivität unabhängig von der Wärmequelle misst. Aus diesem Grund ist die IR-Thermografie wesentlich empfindlicher und stellt die BVT-Aktivität unter verschiedenen physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen wahrheitsgetreuer dar. Mit dieser Methode können die physiologischen Bedingungen ermittelt werden, die zu Veränderungen der BVT-Aktivität führen, wie z. B. Alter, Geschlecht oder Phase des Brunstzyklus. Ein zusätzlicher Nutzen beim Menschen ist die Möglichkeit, die pathophysiologischen Veränderungen der BAT-Aktivität bei Stoffwechselerkrankungen wie Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2 zu bestimmen. Ein besonderer Nutzen konnte beim Vergleich der BAT-Aktivität von Personen mit hoher Blutzuckerkonzentration mit gesunden Kontrollen gesehen werden, da die radioaktive Glukose in der PET-CT mit den gleichen Glukosetransportern wie die Glukose im Körper konkurriert, was zu falsch negativen Ergebnissen oder falschen Darstellungen der BAT-Aktivität führt.

Ein mögliches Problem sind die Unterschiede in der Dicke der Haut, insbesondere des subkutanen weißen Fettgewebes, die die Hauttemperatur über BAT bei verschiedenen Probanden verändern können28. Dieses Problem kann vermieden werden, indem die BVT-Aktivierung vor und nach einer Mahlzeit verglichen wird. In der Regel werden die Aktivität und die daraus resultierende Bedeutung für verschiedene pathophysiologische Zustände durch die BAT-Aktivierung nach Kälteexposition bestimmt. Diese Art der BAT-Aktivierung ist jedoch saisonal bedingt und beim Menschen (im Vergleich zu Tieren in der Wildnis) nicht sehr wichtig. Um die Auswirkungen der BAT-Aktivität auf den Alltag sowie die Glukosehomöostase zu bestimmen, ist die BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit mit anschließender Glukose- und Fettsäureverwertung der richtige Weg.

Achten Sie auf die Messungen, die in warmer Umgebung oder zu früh nach der Muskelaktivität durchgeführt werden. Die Muskelaktivität erhöht die Körpertemperatur, was zu einer Vasodilatation der Haut führt (Abbildung 2). Wenn im Vergleich zu den umgebenden Hautarealen kein wärmerer Hautbereich oberhalb der BAT sichtbar ist, schließen Sie die Aufzeichnungen aus der Studie aus.

Die BVT-Aktivität bei Versuchstieren wird durch die maximale Temperatur der BVT zwischen dem Schulterblatt (interskapuläre BAT, iBAT) und die durchschnittliche Temperatur der Haut über der iBVT bestimmt. Es ist einfacher, die durchschnittliche Temperatur der Haut oberhalb der BVT bei Labortieren zu messen, da sie stärker lokalisiert ist als beim Menschen (Abbildung 3). In dieser Studie wurden die Veränderungen der BVT-Aktivität nach einer Mahlzeit bei weiblichen WT-Tieren im Diestrus (28,2 ± 0,5 Wochen alt) gemessen. Wie in Abbildung 3 dargestellt, wurden statistisch signifikante Veränderungen der BVT-Aktivität 30 Minuten nach einer Mahlzeit festgestellt, jedoch nur, wenn die maximale Temperatur gemessen wurde (p < 0,05). Wenn die BVT-Aktivität als Änderungen der Durchschnittstemperaturen dargestellt wurde, war die Änderung nicht signifikant (p = 0,066). Daher ist die Darstellung der BAT-Aktivität über Änderungen der maximalen Temperatur des interscapularären Hautbereichs eine bessere Möglichkeit, die Ergebnisse darzustellen. Diese Veränderung der BVT-Aktivität korrelierte positiv mit der Menge der aufgenommenen Nahrung (r = 0,65).

Die Hauptbedenken für beide Probanden sind die biologischen Unterschiede in der BAT-Aktivierung bei männlichen und weiblichen sowie jungen und alten Tieren sowie die Unterschiede in der BAT-Aktivität während des Brunstzyklus17. Besonderes Augenmerk sollte auf die Zeit seit der letzten Mahlzeit gelegt werden, die schwer abzuschätzen ist, wenn das obige Protokoll nicht befolgt wird. Die gleichzeitige Durchführung von Experimenten am Morgen ist nicht präzise genug17.

Ein weiteres Anliegen bei der Messung der BAT-Aktivität ist es, Stress bei den Tieren so weit wie möglich zu vermeiden. Jede Störung erhöht die sympathische Aktivität und damit die BVT-Aktivität16. Darüber hinaus können die meisten Fehler bei der Temperaturaufzeichnung auftreten, wenn der Zwischenraum der Mäuse nicht richtig rasiert ist, was dazu führen kann, dass der falsche Bereich der Haut gemessen wird.

Figure 1
Abbildung 1: Infrarot-Thermografie. (A) Es werden zwei Hautareale ausgewählt: eines oberhalb des braunen Fettgewebes (BAT; supraclavicularer Bereich) und das zweite im interclavicularen Bereich (kein BAT-Gewebe unterhalb der Haut dieses Area-Referenzpunktes vorhanden). Die BAT-Stelle wird als der wärmste Bereich über dem Schlüsselbein dargestellt. Die schematische Darstellung der BVT-Lokalisation im Hals nach PET-CT ist in der linken Abbildung dargestellt. Temperaturen sind Maximaltemperaturen, die in umschlossenen Hautbereichen gemessen werden. Der Balken stellt 5 cm dar. (B) Die Unterschiede zwischen den Maximaltemperaturen in beiden Hautarealen werden für jeden Teilnehmer dargestellt und zeigen den Anstieg der BAT-Aktivität 2 h nach einer Mahlzeit (links). Die BVT-Aktivität kann nicht durch maximale Temperaturen der Haut über BAT (rechts) dargestellt werden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. * p < 0,05 im Vergleich zum Startwert (gepaarte ANOVA). Abkürzung: SC = supraskapulierend. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Die Bedingungen, unter denen die BVT-Aktivität nicht gemessen werden kann. Die Abbildung zeigt die Bedingungen, unter denen es aufgrund einer erhöhten Gefäßerweiterung der Blutgefäße der Haut nicht möglich ist, die BVT-Aktivität zu bestimmen. Der Balken stellt 5 cm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Braunes Fettgewebe in Labormäusen. (A,B) Interskapuläres braunes Fettgewebe (BAT) wird nach Kälteexposition aktiviert und erst dann als 18F-FDG-Akkumulation mittels PET-CT dargestellt. Die Aktivität von BAT konnte mit einer Wärmebildkamera ohne Kältebelichtung beobachtet werden. (C) Die Position der BVT im Thermoscan entspricht der BVT, die im PET-CT-Bild durch einen Pfeil dargestellt ist. Die rasierte Fläche ist größer als die BAT, um alle Temperaturänderungen sehen zu können (die Lage von Tmax konnte nicht perfekt vorhergesagt werden, und in einigen Studien kann die Durchschnittstemperatur gemessen werden). Der Balken stellt 1 cm dar. (D) Die gemessenen maximalen und mittleren Temperaturen der Haut oberhalb der BVT für sechs weibliche Mäuse in Diestrus werden dargestellt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. * p < 0,05 im Vergleich zum Startwert (gepaarte ANOVA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Neuere Studien liefern zunehmend Hinweise auf die physiologische Regulation und Bedeutung der BAT-Aktivität bei erwachsenen Menschen und Tieren bei der Entwicklung von Adipositas und Diabetes mellitus. Darüber hinaus wird eine mögliche BAT-Aktivierung durch exogene Aktivatoren zum Ziel von Pharmaunternehmen. Um die physiologische Regulation und pathophysiologische Bedeutung von BVT bei sehr belastenden Erkrankungen abschätzen zu können und einen möglichen Therapieansatz zu entdecken, wird die Infrarot-Thermografie zur Methode der Wahl. Auch wenn sich die IR-Technologie als neue Methode der Wahl zur Messung der BAT-Aktivität herauskristallisiert 12,13,14,15,17, sollte nicht der angewandten Methode selbst, sondern den physiologischen Eigenschaften der BAT-Aktivierung besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Besonderes Augenmerk sollte man bei menschlichen Probanden und Versuchstieren auf Geschlecht, Alter, Brunstzyklusphase, Fütterungsstatus und möglichen Stress legen.

Die Messungen des Anstiegs der BAT-Aktivität nach einer Mahlzeit, die an Menschen und Versuchstieren durchgeführt wurde, sind recht ähnlich12,17. Kritische Schritte bei der Durchführung dieser Messungen sind die Vermeidung von Stress und Muskelaktivität (Tiere sollten vor der Durchführung von Messungen nicht gestört werden). Bei weiblichen Teilnehmerinnen sollten die funktionellen Unterschiede in der BAT-Aktivität während des Brunstzyklus (Menstruationszyklus) berücksichtigt werden. Außerdem sollte die Haut nackt sein (Tiere sollten am Tag vor den Experimenten rasiert werden, um unnötigen Stress zu vermeiden). Darüber hinaus ist es sehr wichtig, die Kamerasoftware richtig einzustellen, um die bestmögliche thermische Auflösung zu erhalten. Um die Daten als Wärmebilder darzustellen, wählen Sie am besten eine geeignete Farbpalette aus, die zur jeweiligen Studie passt. Wenn das Protokoll richtig befolgt wird, ist die Wahrscheinlichkeit von Fehlern bei der Durchführung der IR-Thermografie geringer.

Die Einschränkung der Methode besteht darin, dass es nicht ohne Bedenken möglich ist, die BAT-Aktivität zwischen Menschen mit unterschiedlichen Mengen an subkutanem Fett (oder adipösen Tieren mit Tieren mit normalem Körpergewicht) zu vergleichen. Um dieses Problem zu vermeiden, sollte derselbe Proband als Kontrollperson verwendet werden, indem die BVT-Aktivität vor und nach einer Mahlzeit gemessen wird. Die Berechnung des Anstiegs der BVT-Aktivität nach einer Mahlzeit beseitigt die Unterschiede in der Wärmeverteilung von der subkutanen BVT zur Hautoberfläche.

Die Angabe der BVT-Aktivität durch Veränderungen zwischen den maximalen Hauttemperaturen beider Hautareale ist aus unserer Sicht ein besserer Weg, da dadurch die Unterschiede in der BVT-Größe und/oder der bezeichneten Hautfläche in den Ergebnissen der Durchschnittstemperaturmessungen eliminiertwerden 29.

Wie bereits erwähnt, ist die Methode der Wahl zur Messung der BVT-Aktivität bisher die PET-CT mit radioaktiver Glukose (18F-FDG). Diese Methode hat sich im Laufe der Zeit als nicht empfindlich genug erwiesen, die Verwendung von radioaktivem Material ist besorgniserregend und sehr teuer. Die PET-CT ist nutzlos, um die BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit zu bestimmen. 18. Sonstiges Die F-FDG-Akkumulation in BVT nach einer Mahlzeit ist kaum sichtbar10 und wird als negatives Ergebnis gewertet. Kürzlich wurde vermutet, dass die BAT-Aktivierung in der menschlichen Bevölkerung stärker ausgeprägt ist und daher für die Entwicklung und Ausbreitung von Stoffwechselerkrankungen immer wichtiger wird7. Ein Versuch, dieses Problem zu lösen, ist die MRT-Messung des BAT-Volumens bei Prädiabetikern und Patienten mit T2DM mit Insulinresistenz11. Die Menge an BAT gibt jedoch keine Auskunft über die Aktivität von BAT und die Verwertung von Glukose und Fettsäuren, was bei Diabetikern wichtig ist.

Die Etablierung der IR-Thermografie als Methode der Wahl zur Messung der BAT-Aktivität, insbesondere bei Menschen mit hoher Blutzuckerkonzentration, wird einen großen Einfluss auf das Feld haben. Die IR-Thermografie wird zur Bestimmung der kälteinduzierten Aktivierung von BAT 13,14,15 und neuerdings auch der BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit bei gesunden Probanden 12 und Versuchstieren 17 eingesetzt. Die postprandiale BAT-Aktivierung ist bei Weibchen und älteren Probanden unabhängig von der Art geringer. Leider wurde der Großteil der Forschung zur BAT-Aktivierung und der Stoffwechselstudien insgesamt nur an männlichen Probanden (männliche Versuchstiere oder Männer) durchgeführt. Das Problem bei diesem Ansatz ist, dass er den Einfluss der Phase des Brunstzyklus auf die BVT-Aktivitätignoriert 30.

Schließlich wird die IR-Thermografie die Möglichkeit bieten, die physiologische und pathophysiologische Bedeutung von BVT in verschiedenen menschlichen Populationen, insbesondere bei prä- und postmenopausalen Frauen, zu untersuchen, für die Studien fehlen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde durch das Forschungsstipendium der Kroatischen Wissenschaftsstiftung finanziert (IP-2018-01-7416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% cresyl violet acetate  Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity Kesterl Kestrel 4200 Certificat of conformity
External data storage Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides Commonly used
Small cotton tip swab  Urethral swabs
Software for analysis FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA FLIR Tools
Software for meassurements FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA ResearchIR software FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA FLIR T-1020

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Medizin Heft 187 Thermographie Mensch und Versuchstiere postprandiale Aktivierung von braunem Fettgewebe Positronen-Emissions-Tomographie Computertomographie (PET-CT)
Infrarot-Thermografie zur Detektion von Veränderungen der Aktivität des braunen Fettgewebes
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Kordić, M., Dugandžić, J., Ratko, M., Habek, N., Dugandžić, A. Infrared Thermography for the Detection of Changes in Brown Adipose Tissue Activity. J. Vis. Exp. (187), e64463, doi:10.3791/64463 (2022).

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