Summary
פרוטוקול זה מתאר את השיטה המפורטת של טיפות דיגיטליות PCR (dd-PCR) לכימות מדויק של רמות RNA מעגלי (circRNA) בתאים באמצעות פריימרים מסתעפים.
Abstract
תגובת שרשרת פולימראז טיפות דיגיטלית (dd-PCR) היא אחת משיטות הכימות הרגישות ביותר; הוא מחלק את התגובה לכמעט 20,000 טיפות מים בשמן, וה-PCR מתרחש בטיפות הבודדות. ל-dd-PCR יש מספר יתרונות על פני qPCR קונבנציונלי בזמן אמת, כולל דיוק מוגבר באיתור מטרות בשפע נמוך, השמטת גני ייחוס לכימות, ביטול שכפולים טכניים לדגימות והפגנת עמידות גבוהה בפני מעכבים בדגימות. לאחרונה, dd-PCR הפך לאחת השיטות הפופולריות ביותר לכימות מדויק של דנ"א מטרה או RNA לצורך ניתוח ביטוי גנים ואבחון. רנ"א מעגלי (circRNAs) הם משפחה גדולה של מולקולות RNA סגורות קוולנטיות שהתגלו לאחרונה, חסרות קצוות של 5' ו-3'. הודגם כי הם מווסתים את ביטוי הגנים על ידי כך שהם מתפקדים כספוגים עבור חלבונים קושרי RNA ומיקרו-רנ"א. יתר על כן, circRNAs מופרשים לנוזלי גוף, ועמידותם בפני אקסונוקלאזות גורמת להם לשמש כסמנים ביולוגיים לאבחון מחלות. מאמר זה נועד להראות כיצד לבצע תכנון פריימר מסתעף, מיצוי RNA, סינתזת cDNA וניתוח dd-PCR כדי לכמת במדויק רמות RNA מעגליות ספציפיות (circRNA) בתאים. לסיכום, אנו מדגימים את הכימות המדויק של circRNAs באמצעות dd-PCR.
Introduction
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות ריצוף RNA ואלגוריתמים חישוביים חדשניים גילו חבר חדש במשפחה ההולכת וגדלה של רנ"א שאינם מקודדים, הנקראים RNA מעגלי (circRNA)1. כפי שהשם מרמז, circRNAs הם משפחה של מולקולות RNA חד-גדיליות ללא קצוות חופשיים. הם נוצרים על ידי שחבור לא-קנוני של ראש-לזנב הנקרא שחבור אחורי, שבו אתר מקבל השחבור במעלה הזרם מתחבר באופן קוולנטי עם אתר תורם השחבור במורד הזרם ויוצר מעגל RNA יציב 1,2. תהליך זה יכול להיות מתווך על ידי מספר גורמים, כולל אלמנטים חוזרים של Alu הפוכים הנמצאים במעלה הזרם ובמורד הזרם של אקסונים מעגליים, או יכול להיות מתווך על ידי כמה גורמי שחבור או חלבונים קושרי RNA (RBPs)2,3. רנ"א מעגלי שנוצר באופן בלעדי מהרצף האקסוני או האינטרוני מסווג כ-circRNA אקסוני ו-RNA אינטרוני מעגלי או ci-RNAs, בעוד שחלק מה-circRNAs האקסוניים שומרים על האינטרון ונקראים אקסון-אינטרון circRNAs (EIcircRNAs)3,4. הפונקציות של circRNA הן רבות פנים, כולל ספוג miRNA ו / או RBP, ויסות שעתוק, וויסות תפקוד התא על ידי תרגום לפפטידים 3,5,6,7. מספר דיווחים הדגישו את החשיבות של circRNAs במחלות שונות ובתהליכים פיזיולוגיים8. יתר על כן, דפוסי ביטוי ספציפיים לרקמות ועמידות לעיכול אקסונוקלאז הופכים אותו לסמן ביולוגי פונקציונלי לאבחון מחלות והוא יכול לשמש גם כיעד טיפולי מתאים8. בהתחשב בחשיבותו בוויסות הבריאות והמחלות, הכימות המדויק של ביטוי circRNA הוא צורך השעה.
מספר שיטות ביוכימיות פותחו לכימות circRNAs בדגימות ביולוגיות9. אחת השיטות הנוחות והמקובלות ביותר לכימות circRNA היא שעתוק הפוך ואחריו תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) באמצעות זוגות פריימרים מסתעפים10. עם זאת, רוב ה-circRNAs נמצאים בשפע נמוך בהשוואה ל-mRNAs ליניאריים, מה שמקשה לכמת אותם11. כדי להתגבר על בעיה זו, ביקשנו להשתמש בטיפות דיגיטליות PCR (dd-PCR) כדי לכמת את מספר ה-circRNAs בדגימה נתונה באופן מדויק. ה- dd-PCR היא טכנולוגיית PCR מתקדמת הפועלת על פי עקרון המיקרופלואידיקה; הוא מייצר טיפות מימיות מרובות בשמן, וה-PCR מופיע בכל טיפה כתגובה בודדת12. התגובה מתרחשת בטיפות בודדות ומנותחת באמצעות קורא טיפות, אשר נותן את מספר הטיפות חיוביות או שליליות עבור הגן המעניין12. זוהי הטכניקה הרגישה ביותר לכימות מדויק של גן בעל עניין, גם אם יש רק עותק אחד בדגימה נתונה. ירידה ברגישות כלפי מעכבים, דיוק טוב יותר והשמטת גן הייחוס לכימות הופכים אותו ליתרון יותר מאשר qPCR13,14,15 קונבנציונלי. הוא נמצא בשימוש נרחב ככלי מחקר ואבחון לכימות מוחלט של גן בעל עניין16,17. כאן נתאר את פרוטוקול dd-PCR המפורט לכימות circRNA בהבחנה בין מיוטובים C2C12 של עכברים לבין מיובלסטים של עכברים מתרבים C2C12 באמצעות פריימרים מסתעפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רנ"א רגיש ל-RNases; לכן, כל הריאגנטים, המכשירים וסביבות העבודה צריכים להיות נטולי RNase ומטופלים בזהירות.
1. תכנון פריימר מסתעף עבור circRNA (ראו איור 1)
- אחזר את הרצף הבוגר מנתוני ביאור circRNA באמצעות BEDTools או מדפדפן הגנום של UCSC על ידי צירוף רצף האקסון/אינטרון הקיים בין קואורדינטות צומת backsplice18,19.
- הכן רצף תבנית PCR באורך של 200 נוקלאוטידים על ידי צירוף 100 הנוקלאוטידים האחרונים של אורך רצף circRNA הכולל ל-100 הנוקלאוטידים הראשונים של רצף circRNA10.
הערה: אם אורך ה-circRNA קטן מ-200 נוקלאוטידים, חלקו אותו לשני חצאים שווים והצטרפו לנוקלאוטידים מהמחצית האחרונה ועד תחילת המחצית הראשונה. - השתמש ברצף התבניות לעיל לעיצוב פריימר על ידי שימוש בכלי האינטרנט Primer3 והגדרת אורך מוצר PCR הנע בין 120-180 נוקלאוטידים באורך20.
- השתמש בהגדרות ברירת המחדל של Primer3 עבור פרמטרים אחרים כגון Tm ואורך פריימר. רצפי הפריימרים עבור circBnc2 מפורטים בטבלה 1.
- הזמינו את רצפי הפריימר המסתעפים לסינתזה מכל חברת סינתזה של אוליגו.
2. בידוד RNA
הערה: בודד RNA כולל מתאי C2C12 של העכבר באמצעות כל ערכות הזמינות מסחרית או שיטת בידוד RNA פנימית. שיטת בידוד הרנ"א הפנימית המשמשת כאן תוארה בעבר21. חרוזי הסיליקה המגנטיים מוכנים במעבדה באמצעות פרוטוקול22 שפורסם בעבר. חרוזים מגנטיים אלה ניתן גם לרכוש מספקים שונים.
- קח מנה אחת בגודל 10 ס"מ המכילה כ-5 x 106 תאי מיובלסט C2C12 מתרבים ומיוטיוב C2C12 מובחן אחד למשך 4 ימים לבידוד RNA.
- לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של 1x PBS שלוש פעמים ולהשליך את PBS באמצעות פיפטה.
- לגרד את התאים ב 1 מ"ל של 1x PBS באמצעות מגרד תאים, צנטריפוגה אותם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ב 750 x גרם, ולהשליך את PBS באמצעות פיפטה.
- הוסיפו 1 מ"ל של מגיב בידוד RNA (RIR) והניחו את התאים על ידי פיפטינגנמרץ 21.
- הוסף 200 μL (1/5 מנפח RIR) של כלורופורם ומערבולת במשך 15 שניות. צנטריפוגה הצינור ב 4 °C במשך 10 דקות ב 12,000 x גרם.
- קח 400 μL של השכבה המימית העליונה, טען אותו על עמוד סיליקה, צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 12,000 x גרם בטמפרטורת החדר. קח את הזרימה לצינור חדש והוסף 600 μL של 100% אתנול.
- הוסף 20 μL של חרוזי סיליקה מגנטיים והנח את הצינור על תרמומיקסר שנקבע על 25 °C ו 1,200 סל"ד במשך 5 דקות.
הערה: ניתן להגדיל או להקטין את נפח החרוזים בהתאם למספרי התאים ההתחלתיים שנלקחו לתזה. חרוזי סיליקה מגנטיים ניתן לרכוש מספקים מסחריים. - מניחים את הצינור על מעמד מגנטי למשך 30 שניות או עד שהתמיסה מתבהרת. השליכו את הסופר-נטנט בזהירות באמצעות פיפטה.
- החזירו את חרוזי הסיליקה המגנטיים ב-500 מיקרו-ליטר של מאגר כביסה המכיל 90% אתנול. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי למשך 30 שניות. סובב את הצינור פעמיים על המעמד המגנטי כדי לשטוף את החרוזים. תנו לחרוזים להתיישב לכיוון המגנט והשליכו את החיץ באמצעות פיפטה.
- חזור על שלב 2.9 פעמיים. לאחר הכביסה, סובבו לזמן קצר את הצינור והחזירו אותו למעמד המגנטי למשך 30 שניות. יש להשליך את מאגר הכביסה שנותר. ייבשו את הצינור באוויר בטמפרטורה של 50°C למשך 3 דקות על תרמומיקסר, תוך שמירה על המכסה פתוח.
- הוסיפו 20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז והחזירו את החרוזים.
הערה: ניתן להקטין את נפח ה-RNA עד ל-10 μL כדי להגדיל את ריכוז ה-RNA. - מניחים את הצינורות למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את הצינור למעמד המגנטי ותנו לו לשבת במשך 30 שניות. אסוף את הרנ"א המומס בצינור חדש להערכת כמות ואיכות באמצעות ספקטרופוטומטר.
הערה: ניתן לאחסן RNA בטמפרטורה של −20 °C או −80 °C לאחסון לטווח ארוך. כדי לקבל תוצאה אופטימלית, מומלץ להמשיך עם שלב סינתזת cDNA למחרת.
3. סינתזת cDNA
- מדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר וקח 1 מיקרוגרם של RNA לסינתזת cDNA.
- ערבבו 1 מיקרוגרם של RNA כולל עם 1 μL של תערובת dNTP (10 mM כל אחד של dATP, dTTP, dGTP ו- dCTP), 4 μL של 5x מאגר טרנסקריפטאז הפוך (RT), 2 μL של 10x RT פריימר אקראי, 0.25 μL של אנזים טרנסקריפטאז הפוך (200 U/μL), ו-0.5 μL של מעכב RNase (40 U/μL), והרכיבו את הנפח עד 20 μL באמצעות מים נטולי נוקלאז.
הערה: ניתן לשנות את נפח האנזים טרנסקריפטאז הפוך בהתאם לריכוז הרנ"א הראשוני שנלקח לסינתזת cDNA. - הקש על הצינור כדי לערבב את התגובה ולסובב לזמן קצר. מניחים את הצינור ב-25°C למשך 10 דקות ולאחר מכן ב-50°C למשך שעה.
- כדי להשבית את האנזים, מקם את הצינור ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- קרח מקררים את הצינור למשך 2 דקות ומוסיפים 480 μL של מים ללא נוקלאז לצינור כדי להפוך את ריכוז ה-cDNA ל-2 ng/μL.
הערה: ניתן לאחסן cDNA בטמפרטורה של -20°C או להשתמש בו באופן מיידי לניתוח dd-PCR.
4. זרימת עבודה דיגיטלית של טיפות PCR (dd-PCR)
הערה: זרימת העבודה של dd-PCR כוללת שלבים מרובים, החל מהכנת הדגימה, ולאחר מכן יצירת טיפות, הגברה של PCR, ספירת טיפות וניתוח נתונים. כל שלב הוא קריטי ליצירת נתונים מדויקים מכיוון ש- dd-PCR כרוך בכימות מוחלט של מוצרים ואינו זקוק לשום עקומה סטנדרטית. לפיכך, כל אחד מהשלבים השונים של dd-PCR תואר להלן.
- הכנת תגובת dd-PCR.
- הגדר את תגובת ה- PCR של 22 μL בצינורות או רצועות PCR של 0.2 מ"ל יחד עם צינור בקרה שלילי וצינורות NTC (ללא בקרת תבנית).
הערה: כל זוג פריימרים שונים לזיהוי של circRNAs שונים חייב להיות בעל תגובת NTC יחד עם דגימות בדיקה. - הוסיפו 11 μL של תערובת מאסטר dd-PCR (למשל, EvaGreen Supermix) ו-11 μL של מים נטולי נוקלאז כדי להגדיר את צינור תגובת הבקרה השלילית.
הערה: הפשירו את תערובת המאסטר dd-PCR בטמפרטורת החדר ולאחר מכן מערבולת קצרה ליצירת תערובת הומוגנית. השתמש באותם מים נטולי נוקלאז כדי להגדיר את צינור תגובת הבקרה השלילית ואת צינורות ה- NTC ששימשו לדילול ה- cDNA. - הוסיפו 11 μL של תערובת מאסטר dd-PCR, 5.5 μL של תערובת פריימר ספציפית ל-circRNA קדימה ואחורה בריכוז של 1 μM, ו-5.5 μL של מים נטולי נוקלאז כדי להגדיר את צינורות התגובה של NTC.
הערה: לדלל את הפריימרים המסתעפים הספציפיים ל-RNA המעגלי קדימה ואחורה של מלאי של 100 μM ולערבב כדי להכין ריכוז עבודה של 1 μM של תערובת פריימר circRNA קדימה ואחורה; לפיכך, ריכוז הפריימר הסופי הוא 250 ננומטר בתגובת 22 μL. - הוסף 11 μL של תערובת מאסטר dd-PCR, 5.5 μL של תערובת פריימר ספציפית ל-circRNA קדימה ואחורה של ריכוז 1 μM, ו-5.5 μL של cDNA (2 ng/μL) כדי להגדיר את מבחנות התגובה.
- מערבולת ואחריה בקצרה צנטריפוגה של כל צינורות התגובה כדי לקבל תערובת תגובה הומוגנית בתחתית הצינורות.
- הגדר את תגובת ה- PCR של 22 μL בצינורות או רצועות PCR של 0.2 מ"ל יחד עם צינור בקרה שלילי וצינורות NTC (ללא בקרת תבנית).
- דור טיפות.
- העבר את תערובת 20 μL של PCR מצינורות PCR של 0.2 מ"ל לבארות הדגימה של מחסנית מחולל הטיפות.
- הוסף 70 μL של שמן לייצור טיפות לבארות הנפט של מחסנית מחולל הטיפות בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית.
הערה: יש לדגום את שמן ייצור הטיפות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני השימוש. - כסו את מחסנית מחולל הטיפות באטם הגומי והניחו אותה במכונת מחולל הטיפות כדי לקבל את תערובת טיפות שמן הדגימה, שנוצרה בבארות הטיפות של המחסנית.
- הגברת PCR.
- העבר 40 μL של תערובת טיפות שמן דגימה מבארות הטיפות של מחסנית מחולל הטיפות לצלחת PCR של 96 בארות באמצעות פיפטה רב ערוצית.
הערה: העבר בזהירות את תערובת טיפות שמן הדגימה תוך יצירת זווית לבארות דרך קצות הפיפטה הרב-ערוצית כדי למנוע שבירת הטיפות בעת העברתן לצלחת dd-PCR 96-well. - אטמו את צלחת ה-PCR בעלת 96 הבארות עם איטום רדיד האלומיניום, הניחו אותה בבלוק מכונת איטום הצלחות שחומם מראש בטמפרטורה של 80°C, ולחצו על איטום לאיטום צלחת ה-PCR.
- כעת, הנח את הצלחת במחזור התרמי dd-PCR והגדר את התוכנית כאמור בטבלה 2 כאשר טמפרטורת המכסה נקבעה על 105 °C וקצב רמפה של 2 °C / s.
- העבר 40 μL של תערובת טיפות שמן דגימה מבארות הטיפות של מחסנית מחולל הטיפות לצלחת PCR של 96 בארות באמצעות פיפטה רב ערוצית.
- ספירת טיפות.
- לאחר סיום ה-PCR, הניחו את הצלחת על מכונת מונה הטיפות dd-PCR כאשר מחזיק הצלחת נמצא במיקום הנכון לספירת הטיפות.
- פתח את תוכנת ניתוח הטיפות והגדר את ההפעלה על-ידי מתן קלט למידע לדוגמה.
- לחץ על אפשרות ההגדרה. לאחר מכן, לחץ על אפשרות התבנית כדי לפתוח תבנית חדשה.
- הגדר כל באר על ידי הצבת פרטי הניסוי, כגון שם הדגימה (cDNA בשימוש או בקרה שלילית או NTC), שם היעד (שם פריימר circRNA) וסוג (לא ידוע), וסוג הניסוי כ- ABS (כימות מוחלט) ו- Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) בשימוש וכו '.
- לבסוף, שמור את התבנית והתחל את הריצה על ידי לחיצה על אפשרות ההפעלה ובחר ספירה לפי שורה או עמודה. אפשרו למכונה להשלים את ספירת הטיפות, שאורכת כדקה/טוב.
- לחץ על לחצן נתח כדי לנתח את הנתונים לאחר השלמת קריאת הטיפות.
- לחץ על הלחצן משרעת 1D כדי לראות את הטיפות החיוביות והשליליות
- כדי להפריד בין הטיפות החיוביות לבין הטיפות השליליות, שים קו סף משותף לכל הדגימות עם אותה מטרה.
הערה: סך הטיפות בכל דגימה צריך להיות מעל 10,000 כדי להיחשב לכימות מוחלט. ה- NTC לא אמור להראות ספירות טיפות חיוביות. נוכחות של טיפות חיוביות ב NTC מציין זיהום של ריאגנטים או הגברה של dimers פריימר. קשה לברר אם לטיפות החיוביות יש דימרים ראשוניים או מוצרים לא ספציפיים ב- NTC. מומלץ לבדוק את הפריימרים ולהימנע מכל זיהום של הריאגנטים כפרקטיקה כללית לכל PCR כולל dd-PCR. - לחץ על יצוא לחצן כדי לייצא את הנתונים של ספירת circRNA כקובץ .csv. הנתונים המיוצאים מראים את מספר ה-circRNAs שנמצאים בכל דגימה.
- חשב באופן ידני את מספר ה-circRNA בכל דגימה לכל ננוגרם של RNA על-ידי התחשבות בכמות הכוללת של cDNA המשמשת בכל תגובה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן לגזור את המספר המוחלט של circRNAs בכל דגימה מנתוני dd-PCR המיוצאים. ניתוח PCR כמותי בזמן אמת הציע ביטוי דיפרנציאלי של circBnc2 במיוטיובים המובחנים C2C12 (הנתונים לא מוצגים). כאן, רצינו לבדוק את מספר העותקים המוחלט של circBnc2 בהתפשטות מיובלסטים ומיוטובים C2C12. מכיוון שהביטוי של circBnc2 מושווה בשני תנאים, חשוב מאוד לעבד את כל הדגימות לבידוד RNA, סינתזת cDNA ו- PCR בו זמנית באמצעות אותם ריאגנטים ופרוצדורה. כדי לבצע את הכימות המוחלט של circRNAs באמצעות תגובת dd-PCR, יש להשתמש בכמות שווה של RNA כולל ראשוני עבור סינתזת cDNA כדי לחשב את המספר המדויק של מולקולות RNA מטרה לכל ננוגרם של סך RNA. לדוגמה, 1 מיקרוגרם של רנ"א כולל שימש לסינתזת cDNA ודולל ל-500 μL באמצעות מים נטולי נוקלאז כדי לקבל ריכוז סופי של 2 ng/μL לפני ביצוע בדיקת dd-PCR (איור 1).
כפי שניתן לראות באיור 2A, cDNA מ-10 ננוגרם של רנ"א מתאי מיובלסטים C2C12 מתרבים (MB) ומיו-טיוב מובחן (MT) במשך 4 ימים שימשו כדי לבדוק את ההבדל בביטוי של circBnc2 בשני התנאים האלה. הדגימות עובדו כדי ליצור את הטיפות ולבצע PCR, ולאחר מכן ספירת הטיפות החיוביות והשליליות באמצעות תוכנת ניתוח הטיפות בהתאם להוראות היצרן (איור 2B). מכיוון שפריימרים יכולים להגביר מוצרים לא ספציפיים וליצור דימרים לפריימרים, יש להשתמש ב-NTC עבור כל ערכות הפריימרים. באופן אידיאלי, NTC לא צריך להיות ספירת טיפות חיובית.
כפי שניתן לראות באיור 3A, כל הדגימות למעט MT1 הראו יותר מ-12,000 ספירות טיפות. מכיוון שספירת הטיפות הכוללת הייתה נמוכה ב- MT1, מדגם זה לא נחשב לניתוח נתונים סופי. ספירת הטיפות הכוללת הנמוכה יכולה לנבוע משגיאה ביצירת טיפות, קרע של הטיפות במהלך ההעברה לצלחת ה-PCR או בעיות צנרת. באופן מעניין, היה הבדל ברור בדפוס הביטוי של circBnc2 במצב מיוטוב מובחן של 4 ימים בהשוואה לתאי המיאובלסט. הניתוח של שפע העותקים של circBnc2 במונחים של מספר עותקים הצביע על כך שלשלושת ההעתקים של מיובלסטים C2C12 היו 76.8, 67 ו-46 עותקים/ng של RNA, בעוד שלשתי דגימות המיוטיוב היו 558 ו-610 עותקים/ng של RNA (איור 3B). מאחר שדגימת מיוטיוב אחת לא עבדה היטב, עדיף שיהיה מספר גדול יותר של שכפולים ביולוגיים כדי לחקור את ההבדלים הסטטיסטיים בדפוסי הביטוי שלהם בשני התנאים.
איור 1: ייצוג סכמטי של תכנון הפריימר המסתעף להגברת ה-PCR של circBnc2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: זרימת העבודה של dd-PCR לכימות circRNA. זרימת העבודה המלאה של dd-PCR כוללת שלבים רבים: (A) בידוד RNA והכנת cDNA מ-C2C12 מיובלסט ותאי מיוטיוב מובחנים ל-4 ימים, הכנת תערובת PCR, (B) יצירת טיפות, הגברת PCR, ספירת טיפות וניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח נתונים באמצעות תוכנת QuantaSoft. (א) ניתוח נתונים כולל זיהוי של טיפות חיוביות ושליליות באמצעות תוכנת הכמות. (B) חישוב מספר ה-circRNA/ng של רנ"א במיובלסטים C2C12 (MB) ובמיוטובים (MT). הנתונים בגרף העמודות של לוח B מייצגים את הממוצע ± STDEV של שניים עד שלושה שכפולים ביולוגיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| שם פריימר | רצף |
| circBnc2 פריימר קדימה | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2 פריימר הפוך | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
טבלה 1: רצפי פריימר מתפצלים המשמשים להגברה של circBnc2.
| צעד | טמפרטורה (צלסיוס) | זמן | לא של מחזורים | קצב רמפה |
| הפעלת אנזים | 95 | 10 דק' | 1 | ~ 2 מעלות צלזיוס / שנייה |
| דנטורציה | 94 | 30 שניות | 40 | ~ 2 מעלות צלזיוס / שנייה |
| חישול/הארכה | 60 | 1 דקות | 40 | ~ 2 מעלות צלזיוס / שנייה |
| ייצוב אותות | 4 | 5 דק' | 1 | ~ 2 מעלות צלזיוס / שנייה |
| ייצוב אותות | 90 | 5 דק' | 1 | ~ 2 מעלות צלזיוס / שנייה |
טבלה 2: תנאים להגברת PCR של circBnc2 על מחזור תרמי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר CircRNA גדל בעשור האחרון עם גילוי טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה. כתוצאה מכך, היא נחשבה למולקולה פוטנציאלית לטיפולי RNA עתידיים. בנוסף, ידוע כי הוא משמש כסמן ביולוגי במספר מחלות, כולל סרטן ומחלות לב וכלי דם 4,8. עם זאת, הזיהוי של circRNA הוא מסובך בגלל השפע הנמוך שלו ויש לו רק רצף צומת אחורי ספציפי אחד שמבדיל אותו מה-mRNA9 ההורי. RT-PCR באמצעות פריימרים מסתעפים הייתה טכניקת תקן הזהב לאימות circRNA מאז גילויו 9,10. למרות שפותחו מספר שיטות מולקולריות לכימות circRNA, קשה למדוד ביטויי circRNA באופן מדויק בגלל השפע הנמוך שלהם. מאחר ש-dd-PCR יכול להגביר מולקולות RNA/DNA בשפע נמוך מאוד מדגימהנתונה 14, זוהי אחת השיטות הטובות ביותר לכימות מדויק של circRNAs.
dd-PCR הוא מבחן נקודת קצה הנותן כימות מוחלט של גן המטרה15. שלא כמו qPCR רגיל, הוא גוזל זמן, מייגע ויקר, מה שהופך אותו לפחות מקובל בהשוואה ל- PCR בזמן אמת אפילו עשור לאחר גילויו15. עם זאת, הוא מציע מספר יתרונות על פני qPCR הנפוץ לחקר שינויים בביטוי גנים13,23. ראשית, dd-PCR יכול לספק את המספר המדויק של עותקים של דנ"א הנמצאים בדגימה נתונה. שנית, שינוי בביטוי הגנים משנה את חישוב אוכלוסיית גני המטרה בדגימה נתונה. ניתן להימנע מכך ב-dd-PCR, שאינו תלוי בעקומות סטנדרטיות או בגנים של משק בית לכימות דנ"א מטרה15. שלישית, מכיוון שתגובת ה-PCR מתרחשת בתאים קטנים, היא מספקת גמישות גבוהה יותר כלפי נוכחות של מעכבים לא ספציפיים או דנ"א רקע, מה שהופך אותה לשיטה מדויקת יותר לכימות גני מטרה23,24.
השתמשנו בטכנולוגיית dd-PCR כדי לכמת את הביטוי circBnc2 בהתפשטות מיובלסטים C2C12 ומיוטובים מובחנים באמצעות פריימרים מסתעפים. עם זאת, יש לבדוק הגברה ספציפית של circRNA עם זוגות פריימרים מסתעפים ללא פריימר-דימרים ב-PCR רגיל לפני ביצוע dd-PCR. כמו כן, יש לעקוב בקפידה אחר פרוטוקול dd-PCR למדידה מדויקת של ביטוי circRNA. זרימת העבודה המוצגת כאן יכולה להיות מותאמת בקלות לכימות של כל circRNA של עניין. מחקרים אחרונים הדגישו את ערכי האבחון של circRNAs הנמצאים ברקמות ובנוזלי גוף לאיתור מחלות8. יחד, שיטה זו תהווה כלי חיוני בתעשיית המחקר והאבחון ותאיץ את מחקר ה-circRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון תוך-מוחי מהמכון למדעי החיים, מענק המחקר DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018), ומלגת Wellcome Trust/DBT India Alliance [IA/I/18/2/504017] שהוענקה לאמארש ג. פנדה. אנו מודים לחברי מעבדה אחרים על הגהת המאמר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L.
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C.
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
