Summary
该协议描述了数字液滴PCR（dd-PCR）的详细方法，用于使用不同的引物精确定量细胞中的环状RNA（circRNA）水平。
Abstract
数字液滴聚合酶链反应（dd-PCR）是最灵敏的定量方法之一;它将反应分馏成近 20，000 个油包水液滴，PCR 发生在单个液滴中。与传统的实时qPCR相比，dd-PCR具有多个优势，包括检测低丰度靶标的准确性更高，省略了定量的参考基因，消除了样品的技术重复，以及对样品中的抑制剂表现出高弹性。最近，dd-PCR已成为准确定量靶DNA或RNA以进行基因表达分析和诊断的最流行的方法之一。环状RNA（circRNA）是最近发现的共价闭合RNA分子的大家族，缺乏5'和3'末端。它们已被证明通过充当RNA结合蛋白和microRNA的海绵来调节基因表达。此外，circRNA分泌到体液中，它们对核酸外切酶的抗性使它们成为疾病诊断的生物标志物。本文旨在展示如何进行不同的引物设计、RNA 提取、cDNA 合成和 dd-PCR 分析，以准确定量细胞中的特定环状 RNA （circRNA） 水平。总之，我们证明了使用dd-PCR对circRNA的精确定量。
Introduction
RNA测序技术和新颖计算算法的最新进展发现了不断增长的非编码RNA家族的新成员，称为环状RNA（circRNA）1。顾名思义，circRNA是一类没有自由末端的单链RNA分子。它们由称为反向剪接的非规范头到尾剪接形成，其中上游剪接受体位点与下游剪接供体位点共价连接，形成稳定的RNA环1，2。这个过程可以由几个因素介导，包括存在于环状外显子上游和下游的倒置Alu重复元件，或者可以通过一些剪接因子或RNA结合蛋白（RBP）介导2，3。仅由外显子或内含子序列产生的环状RNA被归类为外显子circRNA和环状内含子RNA或ci-RNA，而一些外显子circRNA保留内含子并称为外显子-内含子circRNA（EIcircRNA）3，4。circRNA的功能是多方面的，包括海绵miRNA和/或RBP，调节转录以及通过翻译成肽3，5，6，7来调节细胞功能。一些报告强调了circRNA在各种疾病和生理过程中的重要性8。此外，组织特异性表达模式和对核酸外切酶消化的抗性使其成为疾病诊断的功能生物标志物，也可以用作合适的治疗靶点8。考虑到其在调节健康和疾病方面的重要性，准确定量circRNA表达是当务之急。
已经开发了几种生化方法来量化生物样品中的circRNA9。circRNA定量最方便和最广泛接受的方法之一是逆转录，然后使用不同的引物对进行定量聚合酶链反应（RT-qPCR）10。然而，与线性mRNA相比，大多数circRNA的丰度较低，这使得量化它们具有挑战性11。为了克服这个问题，我们试图使用数字微滴PCR（dd-PCR）来准确量化给定样品中circRNA的数量。dd-PCR是一种遵循微流体原理的先进PCR技术;它在油中产生多个水滴，并且PCR作为单独的反应在每个液滴中发生12。反应发生在单个液滴中，并使用液滴读数器进行分析，该读数器给出了目标基因的正或负液滴数12。这是准确定量目的基因的最灵敏技术，即使给定样本中只有一个拷贝。对抑制剂的敏感性降低，精度更高，并且省略了用于定量的参考基因，使其比传统的qPCR13，14，15更具优势。它已被广泛用作对感兴趣的基因进行绝对定量的研究和诊断工具16，17。在这里，我们描述了使用不同引物分化小鼠C2C12肌管和增殖小鼠C2C12成肌细胞中circRNA定量的详细dd-PCR协议。
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Protocol
RNA对核糖核酸酶敏感;因此，所有试剂、仪器和工作空间都应不含RNase，并应小心处理。
1. circRNA的不同引物设计（见 图1）
- 使用 BEDTools 从 circRNA 注释数据中检索成熟序列，或通过连接背接连接坐标18，19 之间存在的外显子/内含子序列从 UCSC 基因组浏览器中检索成熟序列。
- 通过将总 circRNA 序列长度的最后 100 个核苷酸连接到 circRNA 序列 10 的前 100 个核苷酸，制备长度为200 个核苷酸的 PCR 模板序列。
注意：如果circRNA长度小于200个核苷酸，则将其分成相等的两半，并从后半部分到上半部分的开始连接核苷酸。 - 使用上述模板序列进行引物设计，方法是使用Primer3网络工具设置PCR产物长度，范围为120-180个核苷酸，长度为20。
- 使用Primer3的默认设置作为其他参数，如Tm和引物长度。circBnc2的引物序列列于 表1中。
- 从任何寡核苷酸合成公司订购用于合成的不同引物序列。
2. 核糖核酸分离
注意：使用任何市售试剂盒或内部RNA分离方法从小鼠C2C12细胞中分离总RNA。这里使用的内部RNA分离方法已在前面描述过21。磁性硅胶珠在实验室中使用先前发布的方案22制备。这些磁珠也可以从各种供应商处采购。
- 取一个含有约5 x 106 增殖C2C12肌母细胞的10厘米培养皿和一个4天分化的C2C12肌管进行RNA分离。
- 用 10 mL 的 1x PBS 洗涤细胞 3 次，然后使用移液管丢弃 PBS。
- 使用细胞刮刀在1mL的1x PBS中刮取细胞，在4°C下以750× g离心5分钟，然后使用移液管丢弃PBS。
- 加入 1 mL RNA 分离试剂 （RIR） 并通过剧烈移液裂解细胞21.
- 加入 200 μL（RIR 体积的 1/5）氯仿并涡旋 15 秒。将管在4°C下以12，000× g离心10分钟。
- 取 400 μL 上层水层，将其加载到硅胶柱上，并在室温下以 12，000 x g 离心 1 分钟。将流通液放入新管中，加入 600 μL 100% 乙醇。
- 加入 20 μL 磁性硅胶珠，并将管置于设置为 25 °C 和 1，200 rpm 的热混合器上 5 分钟。
注意：磁珠体积可以增加或减少，具体取决于用于裂解的初始细胞数。磁性硅胶珠可以从商业供应商处采购。 - 将管子放在磁性支架上30秒或直到溶液变清。使用移液管小心地弃去上清液。
- 将磁性硅胶珠重悬于含有 90% 乙醇的 500 μL 洗涤缓冲液中。将管子放在磁性支架上30秒。在磁性支架上旋转管两次以清洗珠子。让磁珠朝磁体沉降，并使用移液器丢弃缓冲液。
- 重复步骤 2.9 两次。洗涤后，短暂旋转管并将其放回磁性支架上30秒。丢弃剩余的洗涤缓冲液。在热混合器上将管在50°C风干3分钟，保持盖子打开。
- 加入 20 μL 无核酸酶水并重悬磁珠。
注意：RNA洗脱体积可以减少到10μL，以增加RNA浓度。 - 将试管在室温下放置2-3分钟。将管放回磁性支架上，静置 30 秒。将溶解的RNA收集在新管中，使用分光光度计进行数量和质量评估。
注意：RNA可以储存在-20°C或-80°C下长期储存。为了获得最佳结果，建议第二天进行cDNA合成步骤。
3. cDNA合成
- 使用分光光度计测量RNA浓度，并取1μgRNA进行cDNA合成。
- 将 1 μg 总 RNA 与 1 μL dNTP 混合物（dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 10 mM）、4 μL 5x 逆转录酶 （RT） 缓冲液、2 μL 10x RT 随机引物、0.25 μL 逆转录酶 （200 U/μL） 和 0.5 μL RNase 抑制剂 （40 U/μL） 混合，并使用无核酸酶水补足高达 20 μL 的体积。
注意：逆转录酶体积可以根据cDNA合成的初始RNA浓度而改变。 - 点击试管以混合反应并短暂旋转。将管在25°C放置10分钟，然后在50°C下放置1小时。
- 要灭活酶，请将管置于85°C下5分钟。
- 将试管冰冷 2 分钟，并向试管中加入 480 μL 无核酸酶水，使 cDNA 浓度达到 2 ng/μL。
注意：cDNA可以储存在-20°C或立即用于dd-PCR分析。
4. 数字微滴聚合酶链反应 （dd-PCR） 工作流程
注意：dd-PCR 的工作流程涉及多个步骤，从样品制备开始，然后是液滴生成、PCR 扩增、液滴计数和数据分析。由于dd-PCR涉及产品的绝对定量，并且不需要任何标准曲线，因此每个步骤对于准确的数据生成都至关重要。因此，下面描述了dd-PCR的每个不同步骤。
- 制备dd-PCR反应。
- 在 0.2 mL PCR 管或试管以及阴性对照管和 NTC（非模板对照）管中设置 22 μL 的 PCR 反应。
注意：用于检测不同circRNA的每个不同的发散引物对必须与测试样品一起具有NTC反应。 - 加入 11 μL dd-PCR 预混液（例如 EvaGreen 超级混液）和 11 μL 无核酸酶水以设置阴性对照反应管。
注意：在室温下解冻dd-PCR预混液，然后进行短暂的涡旋以制成均匀的混合物。使用相同的无核酸酶水设置阴性对照反应管和用于稀释cDNA的NTC管。 - 加入 11 μL dd-PCR 预混液、5.5 μL 1 μM 浓度的 circRNA 特异性正向和反向引物混合物以及 5.5 μL 无核酸酶水以设置 NTC 反应管。
注意：稀释100μM储备液的正向和反向环状RNA特异性发散引物并混合以制备1μM工作浓度的正向和反向circRNA引物混合物;因此，在22 μL反应中，最终引物浓度为250 nM。 - 加入 11 μL dd-PCR 预混液、5.5 μL 1 μM 浓度的 circRNA 特异性正向和反向引物混合物以及 5.5 μL cDNA （2 ng/μL） 以设置测试反应管。
- 彻底涡旋，然后短暂离心所有反应管，在管底部获得均匀的反应混合物。
- 在 0.2 mL PCR 管或试管以及阴性对照管和 NTC（非模板对照）管中设置 22 μL 的 PCR 反应。
- 液滴生成。
- 将 20 μL PCR 混合物从 0.2 mL PCR 管转移到液滴发生器盒的样品孔中。
- 使用多通道移液器小心地将 70 μL 液滴发生油添加到液滴发生器盒的油井中。
注意：使用前将液滴生成油在室温下孵育15分钟。 - 用橡胶垫圈盖住液滴发生器滤芯，并将其放入液滴发生器机器中，以获得在液滴发生器滤芯的液滴孔中产生的样品-油滴混合物。
- PCR扩增。
- 使用多通道移液管将 40 μL 样品-油滴混合物从液滴发生器盒的液滴孔转移到 96 孔 PCR 板中。
注意：小心地转移样品-油滴混合物，同时通过多通道移液器的尖端与孔成一定角度，以避免在将它们转移到dd-PCR 96孔板时破坏液滴。 - 用铝箔封口机密封96孔PCR板，将其放入预热于80°C的板封口机机块中，然后单击 密封 以密封PCR板。
- 现在，将板放入dd-PCR热循环仪中，并按照 表2 中所述设置程序，盖子温度设置为105°C，升温速率为2°C / s。
- 使用多通道移液管将 40 μL 样品-油滴混合物从液滴发生器盒的液滴孔转移到 96 孔 PCR 板中。
- 液滴计数。
- PCR结束后，将板放在dd-PCR液滴计数器机上，将板架置于正确的位置以计数液滴。
- 打开液滴分析软件，通过输入样品信息来设置运行。
- 单击 设置选项。然后，单击模板选项以打开新 模板 。
- 通过输入实验的详细信息来定义每个孔，例如样品名称（使用的cDNA或阴性对照或NTC），目标名称（circRNA引物名称）和类型（未知），以及实验类型为ABS（绝对定量）和Supermix（dd-PCR EvaGreen超级混合物）等。
- 最后，保存模板并通过单击运行选项开始 运行 ，然后选择按 行或按列计数。让机器完成液滴计数，大约需要 1 分钟/孔。
- 单击“分析”按钮以 分析 液滴读数完成后的数据。
- 单击 “一维振幅 ”按钮以查看正极和负极液滴
- 要将正液滴与负液滴分开，请为具有相同目标的所有样品设置一条通用阈值线。
注意：每个样品中的总液滴应高于10，000，才能考虑绝对定量。NTC 不应显示阳性液滴计数。NTC中阳性液滴的存在表明试剂污染或引物二聚体扩增。很难确定阳性液滴在NTC中是否具有引物二聚体或非特异性产物。建议检查引物并避免试剂受到任何污染，这是任何PCR的常规做法，包括dd-PCR。 - 单击 “导出 ”按钮将 circRNA 计数数据导出为.csv文件。导出的数据显示了每个样品中存在的circRNA的数量。
- 通过考虑每个反应中使用的cDNA总量，手动计算每个样品中每纳克RNA中的circRNA数量。
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Representative Results
每个样品中circRNA的绝对数量可以从导出的dd-PCR数据中得出。实时定量PCR分析表明 circBnc2 在分化的C2C12肌管中表达差异化（数据未显示）。在这里，我们想检查c2C12成肌细胞和肌管增殖中 circBnc2 的绝对拷贝数。由于 circBnc2 的表达是在两种条件下进行比较的，因此使用相同的试剂和程序同时处理所有用于RNA分离，cDNA合成和PCR的样品非常重要。为了使用dd-PCR反应对circRNA进行绝对定量，应使用等量的初始总RNA进行cDNA合成，以计算每纳克总RNA中靶RNA分子的确切数量。例如，在进行dd-PCR测定之前，使用1 μg总RNA进行cDNA合成，并使用无核酸酶水稀释至500 μL，以获得2 ng/μL的最终浓度（图1）。
如图2A所示，使用来自增殖C2C12成肌细胞（MB）的10 ngRNA的cDNA和4天分化肌管（MT）来检查circBnc2在这两种条件下表达的差异。对样品进行处理以产生液滴并进行PCR，然后根据制造商的说明使用液滴分析软件对阳性和阴性液滴进行计数（图2B）。由于引物可以扩增非特异性产物并形成引物二聚体，因此所有引物组都应使用NTC。理想情况下，NTC不应具有阳性液滴计数。
如图3A所示，除MT1外，所有样品的液滴计数均超过12，000个。由于MT1中的总液滴数较低，因此不考虑该样品进行最终数据分析。总液滴计数低可能是由于液滴生成错误、液滴在转移到PCR板过程中破裂或移液问题造成的。有趣的是，与肌母细胞相比，在4天分化肌管条件下circBnc2的表达模式存在明显差异。circBnc2丰度的拷贝数分析表明，C2C12成肌细胞的3个重复序列的RNA数量分别为76.8、67和46拷贝/ng，而2个肌管样品的RNA拷贝数分别为558和610拷贝/ng（图3B）。由于一个肌管样本效果不佳，因此最好进行更多的生物学重复，以研究它们在两种条件下表达模式的统计差异。
图 1：用于 circBnc2 PCR 扩增的不同引物设计的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于 circRNA 定量的 dd-PCR 工作流程。 完整的dd-PCR工作流程包括许多步骤：（A）从C2C12肌母细胞和4天分化肌管细胞中分离RNA和cDNA制备，PCR混合物制备，（B）液滴生成，PCR扩增，液滴计数和数据分析。 请点击此处查看此图的大图。
图3：使用QuantaSoft软件进行数据分析 。 （A）数据分析包括使用定量软件识别正极和负极液滴。（B）计算C2C12成肌细胞（MB）和肌管（MT）中RNA的circRNA/ng的数量。 面板B 条形图中的数据表示两到三个生物学重复的平均±STDEV。 请点击此处查看此图的大图。
| 引物名称 | 序列 |
| circBnc2 正向引物 | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2 反向底漆 | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
表 1： 用于扩增 circBnc2的不同引物序列。
| 步 | 温度（°C） | 时间 | 周期数 | 斜坡速率 |
| 酶活化 | 95 | 10 分钟 | 1 | ~ 2 °C/s |
| 变性 | 94 | 30 秒 | 40 | ~ 2 °C/s |
| 退火/延伸 | 60 | 1 分钟 | 40 | ~ 2 °C/s |
| 信号稳定 | 4 | 5 分钟 | 1 | ~ 2 °C/s |
| 信号稳定 | 90 | 5 分钟 | 1 | ~ 2 °C/s |
表 2： 在热循环仪上对 circBnc2 进行PCR扩增的条件。
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Discussion
在过去的十年中，随着高通量测序技术的发现，CircRNA研究得到了发展。因此，它被认为是未来RNA疗法的潜在分子。此外，已知它可以作为多种疾病的生物标志物，包括癌症和心血管疾病4，8。然而，circRNA的鉴定是棘手的，因为它的丰度低，并且只有一个特定的背剪接连接序列，将其与亲本mRNA9区分开来。自发现以来，使用不同引物的RT-PCR一直是验证circRNA的金标准技术9，10。尽管已经开发了几种用于circRNA定量的分子方法，但由于其丰度低，准确测量circRNA表达具有挑战性。由于dd-PCR可以从给定样品14中扩增非常低丰度的RNA / DNA分子，因此它是准确定量circRNA的最佳方法之一。
dd-PCR是一种终点测定，可对靶基因进行绝对定量15。与传统的qPCR不同，它耗时、乏味且昂贵，即使在发现15年后，与实时荧光定量PCR相比，其接受度也较低。然而，与广泛使用的qPCR相比，它在研究基因表达变化方面具有几个优点13，23。首先，dd-PCR可以提供给定样品中存在的DNA拷贝的确切数量。其次，管家基因表达的变化改变了给定样本中目标基因群体的计算。这在dd-PCR中可以避免，DD-PCR不依赖于标准曲线或管家基因来量化靶DNA15。第三，由于PCR反应发生在小区室中，因此它为非特异性抑制剂或背景DNA的存在提供了更高的灵活性，使其成为定量靶基因的更准确的方法23，24。
我们使用dd-PCR技术使用不同的引物定量了c2C12成肌细胞和分化肌管中 circBnc2 的表达。然而，在进行dd-PCR之前，必须在常规PCR中检查没有引物二聚体的不同引物对的特定circRNA扩增。此外，必须仔细遵循dd-PCR方案才能准确测量circRNA表达。此处介绍的工作流程可以轻松调整，以定量任何感兴趣的circRNA。最近的研究强调了存在于组织和体液中的circRNA对检测疾病的诊断价值8。总之，这种方法将成为研究和诊断行业的重要工具，并将加速circRNA研究。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了生命科学研究所的校内资助，DBT研究资助（BT / PR27622 / MED/30 / 1961 / 2018）和授予Amaresh C. Panda的威康信托基金会/ DBT印度联盟奖学金[IA / I / 18 / 2 / 504017]的支持。我们感谢其他实验室成员校对本文。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
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