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Biology

डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर का उपयोग करके परिपत्र आरएनए का परिमाणीकरण

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64464
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1
1Institute of Life Sciences, 2School of Biotechnology, KIIT University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल डाइवर्जेंट प्राइमरों का उपयोग करके कोशिकाओं में परिपत्र आरएनए (सीआईआरएनए) स्तरों की सटीक मात्रा का निर्धारण करने के लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) की विस्तृत विधि का वर्णन करता है।

Abstract

डिजिटल ड्रॉपलेट पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (डीडी-पीसीआर) सबसे संवेदनशील परिमाणीकरण विधियों में से एक है; यह प्रतिक्रिया को लगभग 20,000 पानी-इन-ऑयल बूंदों में विभाजित करता है, और पीसीआर व्यक्तिगत बूंदों में होता है। डीडी-पीसीआर के पारंपरिक वास्तविक समय क्यूपीसीआर पर कई फायदे हैं, जिसमें कम-बहुतायत लक्ष्यों का पता लगाने में सटीकता में वृद्धि, परिमाणीकरण के लिए संदर्भ जीन को छोड़ना, नमूनों के लिए तकनीकी प्रतिकृति को समाप्त करना और नमूनों में अवरोधकों के लिए उच्च लचीलापन दिखाना शामिल है। हाल ही में, डीडी-पीसीआर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और निदान के लिए लक्ष्य डीएनए या आरएनए को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक बन गया है। सर्कुलर आरएनए (सीआईआरएनए) हाल ही में खोजे गए सहसंयोजक रूप से बंद आरएनए अणुओं का एक बड़ा परिवार है जिसमें 5 ' और 3 ' सिरों की कमी होती है। उन्हें आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन और माइक्रोआरएनए के लिए स्पंज के रूप में कार्य करके जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, लगभग आरएनए शरीर के तरल पदार्थों में स्रावित होते हैं, और एक्सोन्यूक्लिज़ के लिए उनका प्रतिरोध उन्हें रोग निदान के लिए बायोमार्कर के रूप में काम करता है। इस लेख का उद्देश्य यह दिखाना है कि कोशिकाओं में विशिष्ट परिपत्र आरएनए (सिरआरएनए) स्तरों को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए डाइवर्जेंट प्राइमर डिजाइन, आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण और डीडी-पीसीआर विश्लेषण कैसे किया जाए। अंत में, हम डीडी-पीसीआर का उपयोग करके सीआईआरएनए की सटीक मात्रा का प्रदर्शन करते हैं।

Introduction

आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों और उपन्यास कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम में हालिया प्रगति ने गैर-कोडिंग आरएनए के बढ़ते परिवार के एक नए सदस्य की खोज की है, जिसे परिपत्र आरएनए (सीआईआरएनए) 1 कहा जाता है। जैसा कि नाम से पता चलता है, लगभग आरएनए एकल-फंसे आरएनए अणुओं का एक परिवार है जिसमें कोई मुक्त सिरा नहीं है। वे गैर-कैननिकल हेड-टू-टेल स्प्लिसिंग द्वारा बनाए जाते हैं जिन्हें बैक-स्प्लिसिंग कहा जाता है, जहां अपस्ट्रीम स्प्लिस स्वीकर्ता साइट डाउनस्ट्रीम स्प्लिस डोनर साइट के साथ सहसंयोजक रूप से जुड़ती है ताकि एक स्थिर आरएनए सर्कल 1,2 बनाया जा सके। इस प्रक्रिया को कई कारकों द्वारा मध्यस्थ किया जा सकता है, जिसमें गोलाकार एक्सॉन के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम में मौजूद उल्टे अलु दोहराए जाने वाले तत्व शामिल हैं, या कुछ स्प्लिसिंग कारकों या आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) 2,3 द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है। एक्सोनिक या इनट्रोनिक अनुक्रम से विशेष रूप से उत्पन्न परिपत्र आरएनए को एक्सोनिक सर्आरएनए और सर्कुलर इनट्रोनिक आरएनए या सीआई-आरएनए के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जबकि कुछ एक्सॉनिक सर्आरएनए इंट्रोन को बनाए रखते हैं और उन्हें एक्सॉन-इंट्रॉन सर्आरएनए (ईआईसीआईआरआरएनए) 3,4 कहा जाता है। लगभग आरएनए के कार्य बहुमुखी हैं, जिसमें स्पंजिंग मिआरएनए और / या आरबीपी, प्रतिलेखन को विनियमित करना और पेप्टाइड्स 3,5,6,7 में अनुवाद करके सेलुलर फ़ंक्शन को विनियमित करना शामिल है। कई रिपोर्टों ने विभिन्न बीमारियों और शारीरिक प्रक्रियाओं में सीआईआरएनए के महत्व पर प्रकाश डालाहै। इसके अलावा, ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न और एक्सोन्यूक्लिज़ पाचन के प्रतिरोध इसे रोग निदान के लिए एक कार्यात्मक बायोमार्कर बनाते हैं और इसका उपयोग उपयुक्त चिकित्सीय लक्ष्य8 के रूप में भी किया जा सकता है। स्वास्थ्य और रोगों को विनियमित करने में इसके महत्व को ध्यान में रखते हुए, सर्आरएनए अभिव्यक्ति का सटीक परिमाणीकरण समय की आवश्यकता है।

जैविक नमूनों में सीआईआरएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई जैव रासायनिक विधियां विकसितकी गई हैं। सर्आरएनए परिमाणीकरण के लिए सबसे सुविधाजनक और व्यापक रूप से स्वीकृत तरीकों में से एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन है, जिसके बाद मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) डाइवर्जेंट प्राइमर जोड़े10 का उपयोग करता है। हालांकि, अधिकांश सीआईआरएनए रैखिक एमआरएनए की तुलना में कम बहुतायत में हैं, जो उन्हें11 की मात्रा निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण बनाता है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हमने किसी दिए गए नमूने में सीआईआरएनए की संख्या को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) का उपयोग करने की मांग की। डीडी-पीसीआर एक उन्नत पीसीआर तकनीक है जो माइक्रोफ्लुइडिक्स सिद्धांत का पालन करती है; यह तेल में कई जलीय बूंदें उत्पन्न करता है, और पीसीआर प्रत्येक बूंद में एक व्यक्तिगत प्रतिक्रिया12 के रूप में होता है। प्रतिक्रिया अलग-अलग बूंदों में होती है और एक ड्रॉपलेट रीडर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है, जो रुचि के जीन के लिए सकारात्मक या नकारात्मक बूंदों की संख्यादेता है। यह रुचि के जीन को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए सबसे संवेदनशील तकनीक है, भले ही किसी दिए गए नमूने में केवल एक प्रति हो। अवरोधकों के प्रति संवेदनशीलता में कमी, बेहतर परिशुद्धता, और परिमाणीकरण के लिए संदर्भ जीन को छोड़ना इसे पारंपरिक क्यूपीसीआर 13,14,15 की तुलना में अधिक फायदेमंद बनाता है। यह व्यापक रूप से रुचिके जीन 16,17 के पूर्ण परिमाणीकरण के लिए एक शोध और नैदानिक उपकरण के रूप में उपयोग किया गया है। यहां, हम माउस सी 2 सी 12 मायोट्यूब को अलग करने और डाइवर्जेंट प्राइमरों का उपयोग करके माउस सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स के प्रसार में सर्आरएनए परिमाणीकरण के लिए विस्तृत डीडी-पीसीआर प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

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Protocol

आरएनए आरएनए के प्रति संवेदनशील है; इसलिए, सभी अभिकर्मकों, उपकरणों और कार्यक्षेत्र को RNase-मुक्त होना चाहिए और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।

1. सर्आरएनए के लिए डाइवर्जेंट प्राइमर डिजाइन (चित्रा 1 देखें)

  1. बैकस्प्लिस जंक्शन निर्देशांक18,19 के बीच मौजूद एक्सॉन /इंट्रॉन अनुक्रम को जोड़कर बीईईडीटूल्स का उपयोग करके या यूसीएससी जीनोम ब्राउज़र से सर्आरएनए एनोटेशन डेटा से परिपक्व अनुक्रम को पुनः प्राप्त करें।
  2. कुल सर्आरएनए अनुक्रम लंबाई के अंतिम 100 न्यूक्लियोटाइड्स को सर्आरएनए अनुक्रम 10 के पहले 100 न्यूक्लियोटाइड्स में जोड़कर लंबाई में 200 न्यूक्लियोटाइड्स का पीसीआरटेम्पलेट अनुक्रम तैयार करें।
    नोट: यदि सर्आरएनए की लंबाई 200 न्यूक्लियोटाइड से कम है, तो इसे दो बराबर हिस्सों में विभाजित करें और अंतिम आधे से पहली छमाही की शुरुआत तक न्यूक्लियोटाइड में शामिल हों।
  3. प्राइमर 3 वेब टूल का उपयोग करके और लंबाई 20 में 120-180 न्यूक्लियोटाइड से लेकर पीसीआरउत्पाद की लंबाई सेट करके प्राइमर डिज़ाइन के लिए उपरोक्त टेम्पलेट अनुक्रम का उपयोग करें।
  4. अन्य पैरामीटर जैसे टीएम और प्राइमर लंबाई के लिए प्राइमर 3 की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करें। CIRCBnc2 के लिए प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
  5. किसी भी ऑलिगो संश्लेषित कंपनी से संश्लेषण के लिए डाइवर्जेंट प्राइमर अनुक्रमों का आदेश दें।

2. आरएनए अलगाव

नोट: किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट या इन-हाउस आरएनए अलगाव विधि का उपयोग करके माउस सी 2 सी 12 कोशिकाओं से कुल आरएनए को अलग करें। यहां उपयोग की जाने वाली इन-हाउस आरएनए अलगाव विधि को पहले21 वर्णित किया गया है। चुंबकीय सिलिका मोती पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल22 का उपयोग करके प्रयोगशाला में तैयार किए जाते हैं। इन चुंबकीय मोतियों को विभिन्न विक्रेताओं से भी खरीदा जा सकता है।

  1. आरएनए अलगाव के लिए एक 10 सेमी डिश लें जिसमें लगभग 5 x 106 प्रसार सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट कोशिकाएं और एक 4-दिवसीय विभेदित सी 2 सी 12 मायोट्यूब हो।
  2. कोशिकाओं को 10 एमएल 1x PBS से तीन बार धोएं और पिपेट का उपयोग करके PBS को छोड़ दें।
  3. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके 1x PBS के 1 एमएल में कोशिकाओं को स्क्रैप करें, उन्हें 750 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें, और पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को छोड़ दें।
  4. 1 एमएल आरएनए आइसोलेशन अभिकर्मक (आरआईआर) जोड़ें और जोरदार पाइपिंग21 द्वारा कोशिकाओं को लाइस करें।
  5. 15 सेकंड के लिए क्लोरोफॉर्म और भंवर के 200 μL (आरआईआर की मात्रा का 1/5) जोड़ें। ट्यूब को 12,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. ऊपरी जलीय परत का 400 μL लें, इसे सिलिका स्तंभ पर लोड करें, और कमरे के तापमान पर 12,000 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। एक नई ट्यूब में प्रवाह लें और 100% इथेनॉल का 600 μL जोड़ें।
  7. चुंबकीय सिलिका मोतियों के 20 μL जोड़ें और ट्यूब को 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस और 1,200 आरपीएम पर थर्मोमिक्सर सेट पर रखें।
    नोट: लाइसिस के लिए ली गई प्रारंभिक सेल संख्याओं के आधार पर मोती की मात्रा को बढ़ाया या घटाया जा सकता है। चुंबकीय सिलिका मोती वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदे जा सकते हैं।
  8. ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर 30 सेकंड के लिए रखें या जब तक समाधान स्पष्ट न हो जाए। पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को सावधानी से छोड़ दें।
  9. चुंबकीय सिलिका मोतियों को 90% इथेनॉल युक्त 500 μL वॉश बफर में पुन: निलंबित करें। ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर 30 सेकंड के लिए रखें। मोतियों को धोने के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब को दो बार घुमाएं। मोतियों को चुंबक की ओर बसने दें और पिपेट का उपयोग करके बफर को छोड़ दें।
  10. चरण 2.9 को दो बार दोहराएँ। धोने के बाद, ट्यूब को संक्षेप में घुमाएं और इसे 30 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड पर वापस रखें। शेष वॉश बफर को छोड़ दें। ट्यूब को थर्मोमिक्सर पर 3 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर हवा से सुखाएं, ढक्कन को खुला रखें।
  11. न्यूक्लियस मुक्त पानी के 20 μL जोड़ें और मोतियों को फिर से निलंबित करें।
    नोट: आरएनए एकाग्रता को बढ़ाने के लिए आरएनए क्षालन की मात्रा को 10 μL तक कम किया जा सकता है।
  12. ट्यूबों को कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए रखें। ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर वापस रखें और इसे 30 सेकंड तक बैठने दें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मात्रा और गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक नई ट्यूब में विघटित आरएनए एकत्र करें।
    नोट: आरएनए को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, अगले दिन सीडीएनए संश्लेषण चरण के साथ आगे बढ़ने की सिफारिश की जाती है।

3. सीडीएनए संश्लेषण

  1. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता को मापें और सीडीएनए संश्लेषण के लिए आरएनए का 1 μg लें।
  2. कुल आरएनए के 1 μg को 1 μL dNTP मिश्रण (DATP, dTTP, dGTP, और dCTP का 10 mM प्रत्येक), 5x रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (RT) बफर का 4 μL, 10x RT रैंडम प्राइमर का 2 μL, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज एंजाइम का 0.25 μL, और RNase इनहिबिटर (40 U/μL) के 0.5 μL के साथ मिलाएं और 20 μL तक की मात्रा को न्यूक्लियस-फ्री पानी का उपयोग करके 20 μL तक बनाएं।
    नोट: सीडीएनए संश्लेषण के लिए ली गई प्रारंभिक आरएनए एकाग्रता के आधार पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज एंजाइम वॉल्यूम को बदला जा सकता है।
  3. प्रतिक्रिया को मिलाने और संक्षेप में स्पिन करने के लिए ट्यूब टैप करें। ट्यूब को 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें और उसके बाद 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए, ट्यूब को 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  5. 2 मिनट के लिए ट्यूब को ठंडा करें और सीडीएनए एकाग्रता को 2 एनजी / μL बनाने के लिए ट्यूब में 480 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें।
    नोट: सीडीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या डीडी-पीसीआर विश्लेषण के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है।

4. डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) वर्कफ़्लो

नोट: डीडी-पीसीआर के वर्कफ़्लो में कई चरण शामिल हैं, जो नमूना तैयार करने से शुरू होते हैं, इसके बाद ड्रॉपलेट जनरेशन, पीसीआर प्रवर्धन, ड्रॉपलेट काउंटिंग और डेटा विश्लेषण होता है। प्रत्येक चरण सटीक डेटा उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि डीडी-पीसीआर में उत्पादों की पूर्ण मात्रा शामिल है और किसी भी मानक वक्र की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, डीडी-पीसीआर के विभिन्न चरणों में से प्रत्येक को नीचे वर्णित किया गया है।

  1. डीडी-पीसीआर प्रतिक्रिया की तैयारी।
    1. एक नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब और एनटीसी (गैर-टेम्पलेट नियंत्रण) ट्यूबों के साथ 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों या स्ट्रिप्स में 22 μL की पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें।
      नोट: विभिन्न सर्आरएनए का पता लगाने के लिए प्रत्येक अलग-अलग डाइवर्जेंट प्राइमर जोड़ी में परीक्षण नमूनों के साथ एनटीसी प्रतिक्रिया होनी चाहिए।
    2. नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया ट्यूब को सेट करने के लिए डीडी-पीसीआर मास्टर-मिक्स (जैसे, ईवाग्रीन सुपरमिक्स) के 11 μL और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 11 μL जोड़ें।
      नोट: कमरे के तापमान पर डीडी-पीसीआर मास्टर-मिश्रण को पिघलाएं और इसके बाद एक सजातीय मिश्रण बनाने के लिए एक संक्षिप्त भंवर बनाएं। नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया ट्यूब और एनटीसी ट्यूबों को स्थापित करने के लिए उसी न्यूक्लियस-मुक्त पानी का उपयोग करें जो सीडीएनए को पतला करने के लिए उपयोग किए गए थे।
    3. एनटीसी प्रतिक्रिया ट्यूबों को स्थापित करने के लिए डीडी-पीसीआर मास्टर-मिक्स का 11 μL, 1 μM सांद्रता के 5.5 μL विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमर मिश्रण, और न्यूक्लियस-मुक्त पानी का 5.5 μL जोड़ें।
      नोट: 100 μM स्टॉक के फॉरवर्ड और रिवर्स सर्कुलर आरएनए-विशिष्ट डाइवर्जेंट प्राइमरों को पतला करें और फॉरवर्ड और रिवर्स सर्आरएनए प्राइमर मिश्रण की 1 μM कार्यशील एकाग्रता तैयार करने के लिए मिलाएं; इस प्रकार, अंतिम प्राइमर एकाग्रता 22 μL प्रतिक्रिया में 250 nM है।
    4. परीक्षण प्रतिक्रिया ट्यूबों को सेट करने के लिए डीडी-पीसीआर मास्टर-मिक्स का 11 μL, 5.5 μL विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमर मिश्रण 1 μM एकाग्रता, और 5.5 μL cDNA (2 ng/μL) जोड़ें।
    5. वोर्टेक्स के बाद ट्यूबों के तल पर एक सजातीय प्रतिक्रिया मिश्रण प्राप्त करने के लिए सभी प्रतिक्रिया ट्यूबों को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज किया जाता है।
  2. बूंद उत्पादन।
    1. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों से 20 μL पीसीआर मिश्रण को ड्रॉपलेट जनरेटर कारतूस के नमूना कुओं में स्थानांतरित करें।
    2. मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके बूंद जनरेटर कारतूस के तेल कुओं में 70 μL बूंद उत्पादन तेल सावधानीपूर्वक जोड़ें।
      नोट: उपयोग से पहले 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बूंद पीढ़ी के तेल को इनक्यूबेट करें।
    3. ड्रॉपलेट जनरेटर कार्ट्रिज को रबर गैसकेट के साथ कवर करें और इसे ड्रॉपलेट जनरेटर मशीन में रखें, ताकि कारतूस के ड्रॉपलेट कुओं में उत्पन्न नमूना-तेल बूंद मिश्रण प्राप्त किया जा सके।
  3. पीसीआर प्रवर्धन।
    1. मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके ड्रॉपलेट जनरेटर कार्ट्रिज के ड्रॉपलेट कुओं से नमूना-तेल बूंद मिश्रण के 40 μL को 96-वेल पीसीआर प्लेट में स्थानांतरित करें।
      नोट: मल्टी-चैनल पिपेट की युक्तियों के माध्यम से कुओं में एक कोण बनाते समय नमूना-तेल बूंद मिश्रण को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें ताकि बूंदों को डीडी-पीसीआर 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करते समय तोड़ने से बचा जा सके।
    2. एल्यूमीनियम पन्नी सीलर के साथ 96-वेल पीसीआर प्लेट को सील करें, इसे 80 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट प्लेट सीलर मशीन ब्लॉक में रखें, और पीसीआर प्लेट को सील करने के लिए सील पर क्लिक करें।
    3. अब, प्लेट को डीडी-पीसीआर थर्मल साइकलर में रखें और 105 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित ढक्कन तापमान और 2 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की रैंप दर के साथ तालिका 2 में उल्लिखित कार्यक्रम सेट करें।
  4. बूंदों की गिनती।
    1. एक बार पीसीआर खत्म हो जाने के बाद, बूंदों की गिनती के लिए प्लेट धारक के साथ डीडी-पीसीआर ड्रॉपलेट काउंटर मशीन पर प्लेट रखें।
    2. ड्रॉपलेट विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और नमूना जानकारी के लिए इनपुट देकर रन सेट करें।
    3. सेटअप विकल्प पर क्लिक करें। फिर, एक नया टेम्पलेट खोलने के लिए टेम्पलेट विकल्प पर क्लिक करें।
    4. प्रयोग के विवरण डालकर प्रत्येक को अच्छी तरह से परिभाषित करें, जैसे नमूना नाम (सीडीएनए का उपयोग या नकारात्मक नियंत्रण या एनटीसी), लक्ष्य नाम (सिरआरएनए प्राइमर नाम) और प्रकार (अज्ञात), और प्रयोग प्रकार के रूप में एबीएस (पूर्ण मात्रा) और सुपरमिक्स (डीडी-पीसीआर ईवाग्रीन सुपरमिक्स) का उपयोग किया जाता है, आदि।
    5. अंत में, टेम्पलेट को सहेजें और रन विकल्प पर क्लिक करके रन शुरू करें और पंक्ति या कॉलम-वार गिनती का चयन करें। मशीन को बूंद गिनती को पूरा करने की अनुमति दें, जिसमें लगभग 1 मिनट /
    6. ड्रॉपलेट रीडिंग के पूरा होने के बाद डेटा का विश्लेषण करने के लिए विश्लेषण बटन पर क्लिक करें।
    7. धनात्मक और ऋणात्मक बूंदों को देखने के लिए 1D आयाम बटन क्लिक करें
    8. नकारात्मक बूंदों से सकारात्मक बूंदों को अलग करने के लिए, एक ही लक्ष्य के साथ सभी नमूनों के लिए एक सामान्य दहलीज रेखा रखें।
      नोट: प्रत्येक नमूने में कुल बूंदें 10,000 से ऊपर होनी चाहिए ताकि पूर्ण परिमाणीकरण पर विचार किया जा सके। एनटीसी को सकारात्मक बूंदों की गिनती नहीं दिखानी चाहिए। एनटीसी में सकारात्मक बूंदों की उपस्थिति अभिकर्मकों के संदूषण या प्राइमर डिमर के प्रवर्धन को इंगित करती है। यह पता लगाना मुश्किल है कि सकारात्मक बूंदों में प्राइमर डिमर हैं या एनटीसी में गैर-विशिष्ट उत्पाद हैं। डीडी-पीसीआर सहित किसी भी पीसीआर के लिए एक सामान्य अभ्यास के रूप में प्राइमरों की जांच करने और अभिकर्मकों के किसी भी संदूषण से बचने की सलाह दी जाती है।
    9. किसी .csv फ़ाइल के रूप में CIRCRNA गणना डेटा निर्यात करने के लिए निर्यात करें बटन क्लिक करें. निर्यात किए गए डेटा प्रत्येक नमूने में मौजूद सीआईआरएनए की संख्या दिखाते हैं।
    10. प्रत्येक प्रतिक्रिया में उपयोग किए जाने वाले सीडीएनए की कुल मात्रा पर विचार करके आरएनए के प्रति नैनोग्राम प्रत्येक नमूने में सीआईआरएनए की संख्या की मैन्युअल रूप से गणना करें।

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Representative Results

प्रत्येक नमूने में सीआईआरएनए की पूर्ण संख्या निर्यात किए गए डीडी-पीसीआर डेटा से प्राप्त की जा सकती है। वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण ने विभेदित C2C12 मायोट्यूब (डेटा नहीं दिखाया गया) में CIRCBnc2 की विभेदक अभिव्यक्ति का सुझाव दिया। यहां, हम C2C12 मायोब्लास्ट्स और मायोट्यूब्स के प्रसार में circBnc2 की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या की जांच करना चाहते थे। चूंकि सीआईआरबीएनसी 2 की अभिव्यक्ति की तुलना दो स्थितियों में की जाती है, इसलिए आरएनए अलगाव, सीडीएनए संश्लेषण और पीसीआर के लिए सभी नमूनों को एक ही अभिकर्मकों और प्रक्रिया का उपयोग करके एक साथ संसाधित करना वास्तव में महत्वपूर्ण है। डीडी-पीसीआर प्रतिक्रिया का उपयोग करके लगभग आरएनए की पूर्ण मात्रा का निर्धारण करने के लिए, सीडीएनए संश्लेषण के लिए प्रारंभिक कुल आरएनए की एक समान मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए ताकि कुल आरएनए के प्रति नैनोग्राम लक्ष्य आरएनए अणुओं की सटीक संख्या की गणना की जा सके। उदाहरण के लिए, सीडीएनए संश्लेषण के लिए कुल आरएनए के 1 μg का उपयोग किया गया था और डीडी-पीसीआर परख करने से पहले 2 ng / μL की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी का उपयोग करके 500 μL तक पतला किया गया था (चित्रा 1)।

जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, इन दो स्थितियों में सीआईआरबीएनसी 2 की अभिव्यक्ति में अंतर की जांच करने के लिए सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट कोशिकाओं (एमबी) और 4-दिवसीय विभेदित मायोट्यूब (एमटी) के प्रसार से आरएनए के 10 एनजी से सीडीएनए का उपयोग किया गया था। नमूने को बूंद उत्पन्न करने और पीसीआर करने के लिए संसाधित किया गया था, इसके बाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार ड्रॉपलेट विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों की गिनती की गई थी (चित्रा 2 बी)। चूंकि प्राइमर गैर-विशिष्ट उत्पादों को बढ़ा सकते हैं और प्राइमर डिमर बना सकते हैं, इसलिए एनटीसी का उपयोग सभी प्राइमर सेटों के लिए किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, एनटीसी में कोई सकारात्मक बूंद गिनती नहीं होनी चाहिए।

जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, एमटी 1 को छोड़कर सभी नमूनों ने 12,000 से अधिक बूंदों की गिनती दिखाई। चूंकि एमटी 1 में कुल बूंद गिनती कम थी, इसलिए इस नमूने को अंतिम डेटा विश्लेषण के लिए नहीं माना गया था। कम कुल बूंदों की गिनती बूंद उत्पादन में त्रुटि, पीसीआर प्लेट में स्थानांतरण के दौरान बूंदों के टूटने, या पाइपिंग मुद्दों के कारण हो सकती है। दिलचस्प बात यह है कि मायोब्लास्ट कोशिकाओं की तुलना में 4-दिवसीय विभेदित मायोट्यूब स्थिति में सीआईआरबीएनसी 2 के अभिव्यक्ति पैटर्न में स्पष्ट अंतर था। प्रतिलिपि संख्या के संदर्भ में सीआईआरबीएनसी 2 बहुतायत के विश्लेषण से संकेत मिलता है कि सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स की तीन प्रतिकृतियों में आरएनए की 76.8, 67 और 46 प्रतियां / एनजी थीं, जबकि दो मायोट्यूब नमूनों में आरएनए की 558 और 610 प्रतियां / एनजी थीं (चित्रा 3 बी)। चूंकि एक मायोट्यूब नमूना अच्छी तरह से काम नहीं करता था, इसलिए दो स्थितियों में उनके अभिव्यक्ति पैटर्न में सांख्यिकीय अंतर का अध्ययन करने के लिए अधिक संख्या में जैविक प्रतिकृतियां होना बेहतर है।

Figure 1
चित्रा 1: circBnc2 के PCR प्रवर्धन के लिए डाइवर्जेंट प्राइमर डिज़ाइन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सीआईआरएनए परिमाणीकरण के लिए डीडी-पीसीआर वर्कफ़्लो। पूर्ण डीडी-पीसीआर वर्कफ़्लो में कई चरण शामिल हैं: (ए) सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट और 4-दिवसीय विभेदित मायोट्यूब कोशिकाओं से आरएनए अलगाव और सीडीएनए तैयारी, पीसीआर मिश्रण तैयारी, (बी) बूंद पीढ़ी, पीसीआर प्रवर्धन, बूंद गिनती, और डेटा विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: क्वांटासॉफ्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण। (ए) डेटा विश्लेषण में मात्रा सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों की पहचान शामिल है। (बी) सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स (एमबी) और मायोट्यूब्स (एमटी) में आरएनए के लगभग आरएनए / एनजी की संख्या की गणना करना। पैनल बी बार ग्राफ में डेटा दो से तीन जैविक प्रतिकृतियों के औसत ± एसटीडीईवी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राइमर का नाम अनुक्रम
circBnc2 फॉरवर्ड प्राइमर AAGAGATGCACCGTCTGCAC
circBnc2 रिवर्स प्राइमर AACCGCAGAACTGGAAG

तालिका 1: डाइवर्जेंट प्राइमर अनुक्रमों का उपयोग सीआईआरबीएनसी 2 के प्रवर्धन के लिए किया जाता है।

क़दम तापमान (°C) समय चक्रों की संख्या रैंप दर
एंजाइम सक्रियण 95 10 मिनट 1 ~ 2 °C/
विकृतीकरण 94 30 s 40 ~ 2 °C/
एनीलिंग/एक्सटेंशन 60 1 मिनट 40 ~ 2 °C/
सिग्नल स्थिरीकरण 4 5 मिनट 1 ~ 2 °C/
सिग्नल स्थिरीकरण 90 5 मिनट 1 ~ 2 °C/

तालिका 2: थर्मल साइकलर पर सीआईआरबीएनसी 2 के पीसीआर प्रवर्धन के लिए शर्तें।

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Discussion

उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की खोज के साथ पिछले दशक में सीआईआरएनए अनुसंधान में वृद्धि हुई है। नतीजतन, इसे भविष्य के आरएनए चिकित्सीय के लिए एक संभावित अणु माना गया है। इसके अलावा, यह कैंसर और हृदय रोगों सहित कई बीमारियों में बायोमार्कर के रूप में कार्य करने के लिए जानाजाता है। हालांकि, इसकी कम प्रचुरता के कारण सर्आरएनए की पहचान मुश्किल है और इसमें केवल एक विशिष्ट बैकस्प्लिस जंक्शन अनुक्रम है जो इसे पैतृक एमआरएनए9 से अलग करता है। डाइवर्जेंट प्राइमरों का उपयोग करके आरटी-पीसीआरअपनी खोज 9,10 के बाद से सर्आरएनए को मान्य करने के लिए स्वर्ण मानक तकनीक रही है। यद्यपि सर्आरएनए परिमाणीकरण के लिए कई आणविक विधियां विकसित की गई हैं, लेकिन उनकी कम बहुतायत के कारण सर्आरएनए अभिव्यक्तियों को सटीक रूप से मापना चुनौतीपूर्ण है। चूंकि डीडी-पीसीआर किसी दिए गए नमूने14 से बहुत कम प्रचुर मात्रा में आरएनए / डीएनए अणुओं को बढ़ा सकता है, इसलिए यह सीआईआरएनए के सटीक परिमाणीकरण के लिए सर्वोत्तम तरीकों में से एक है।

डीडी-पीसीआर एक अंत-बिंदु परख है जो लक्ष्य जीन15 का पूर्ण परिमाणीकरण देता है। पारंपरिक क्यूपीसीआर के विपरीत, यह समय लेने वाला, थकाऊ और महंगा है, जिससे इसकी खोज के एक दशक बाद भी वास्तविक समय पीसीआर की तुलना में इसे कम स्वीकार किया जाताहै। हालांकि, यह जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन13,23 का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले क्यूपीसीआर पर कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, डीडी-पीसीआर किसी दिए गए नमूने में मौजूद डीएनए की प्रतियों की सटीक संख्या प्रदान कर सकता है। दूसरा, हाउसकीपिंग जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन किसी दिए गए नमूने में लक्ष्य जीन आबादी की गणना को बदल देता है। डीडी-पीसीआर में इससे बचा जा सकता है, जो लक्ष्य डीएनए15 की मात्रा निर्धारित करने के लिए मानक वक्रों या हाउसकीपिंग जीन पर निर्भर नहीं करता है। तीसरा, जैसा कि पीसीआर प्रतिक्रिया छोटे डिब्बों में होती है, यह गैर-विशिष्ट अवरोधकों या पृष्ठभूमि डीएनए की उपस्थिति की ओर उच्च लचीलापन प्रदान करती है, जिससे यह लक्ष्य जीन23,24 को निर्धारित करने के लिए अधिक सटीक तरीका बन जाता है।

हमने अलग-अलग प्राइमरों का उपयोग करके सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स और विभेदित मायोट्यूब के प्रसार में सीआईआरबीएनसी 2 अभिव्यक्ति को मापने के लिए डीडी-पीसीआर तकनीक का उपयोग किया। हालांकि, प्राइमर-डिमर के बिना डाइवर्जेंट प्राइमर जोड़े के साथ विशिष्ट सर्आरएनए प्रवर्धन को डीडी-पीसीआर करने से पहले नियमित पीसीआर में जांचा जाना चाहिए। इसके अलावा, सीआईआरएनए अभिव्यक्ति के सटीक माप के लिए डीडी-पीसीआर प्रोटोकॉल का सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो को ब्याज के किसी भी सर्आरएनए की मात्रा का ठहराव के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। हाल के अध्ययनों ने रोगों का पता लगाने के लिए ऊतक और शरीर के तरल पदार्थों में मौजूद सीआईआरएनए के नैदानिक मूल्यों पर प्रकाश डालाहै। साथ में, यह विधि अनुसंधान और निदान उद्योग में एक आवश्यक उपकरण होगी और सीआईआरएनए अनुसंधान में तेजी लाएगी।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस कार्य को इंस्टीट्यूट ऑफ लाइफ साइंसेज, डीबीटी अनुसंधान अनुदान (बीटी/पीआर 27622/एमईडी/30/1961/2018) और अमरेश सी पांडा को दिए गए वेलकम ट्रस्ट/डीबीटी इंडिया एलायंस फैलोशिप [आईए/आई/18/2/504017] से इंट्राम्यूरल फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। हम लेख को प्रूफरीडिंग करने के लिए अन्य प्रयोगशाला सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentifuge tube Tarson 500010
0.2 ml tube strips with cap Tarson 610020, 510073
Filter Tips Tarson 528104
DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific 10977023
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P4417
Cell scrapper HiMedia TCP223
Chloroform SRL 96764
DNA diluent HiMedia MB228
Random primers Thermo Fisher Scientific 48190011
dNTP set Thermo Fisher Scientific R0181
Murine RNase inhibitor NEB M0314S
Maxima reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix Bio-Rad 1864033
Droplet generation oil for Evagreen Bio-Rad 1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio-Rad 1814040
DG8 Cartridges and Gaskets Bio-Rad 1864007
DG8 Cartridge holder Bio-Rad 1863051
QX200 Droplet Generator Bio-Rad 1864002
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad 12001925
PX1 PCR Plate Sealer Bio-Rad 1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module Bio-Rad 1851197
QX200 Droplet Reader Bio-Rad 1864003
Quantasoft Software Bio-Rad 1864011
Silica column Umbrella Life Science 38220090
UCSC Genome Browser https://genome.ucsc.edu/
Primer 3 https://primer3.ut.ee/

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References

  1. Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
  2. Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
  3. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  4. Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
  5. Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
  6. Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
  7. Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).
  8. Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
  9. Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
  10. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
  11. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  12. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  13. Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
  14. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
  15. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  16. Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
  17. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  18. Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  21. Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
  22. Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
  23. Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
  24. Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).

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जीव विज्ञान अंक 187 परिपत्र आरएनए आरटी-पीसीआर डाइवर्जेंट प्राइमर पूर्ण परिमाणीकरण
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Das, A., Das, D., Panda, A. C.… More

Das, A., Das, D., Panda, A. C. Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR. J. Vis. Exp. (187), e64464, doi:10.3791/64464 (2022).

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