Summary
Этот протокол описывает подробный метод цифровой капельной ПЦР (dd-PCR) для точной количественной оценки уровней круговой РНК (циркРНК) в клетках с использованием расходящихся праймеров.
Abstract
Цифровая капельно-полимеразная цепная реакция (dd-PCR) является одним из наиболее чувствительных методов количественной оценки; он фракционирует реакцию почти на 20 000 капель воды в масле, и ПЦР происходит в отдельных каплях. dd-PCR имеет несколько преимуществ по сравнению с обычной qPCR в реальном времени, включая повышенную точность в обнаружении мишеней с низкой плотностью, пропуск эталонных генов для количественной оценки, устранение технических реплик для образцов и демонстрацию высокой устойчивости к ингибиторам в образцах. В последнее время дд-ПЦР стала одним из самых популярных методов точной количественной оценки целевой ДНК или РНК для анализа экспрессии генов и диагностики. Круговые РНК (циркРНК) представляют собой большое семейство недавно обнаруженных ковалентно закрытых молекул РНК, не имеющих 5' и 3' концов. Было показано, что они регулируют экспрессию генов, действуя как губки для РНК-связывающих белков и микроРНК. Кроме того, циркРНК секретируются в жидкости организма, и их устойчивость к экзонуклеазам делает их биомаркерами для диагностики заболеваний. Эта статья направлена на то, чтобы показать, как выполнить дизайн дивергентного праймера, экстракцию РНК, синтез кДНК и анализ dd-PCR для точной количественной оценки конкретных уровней циркулярной РНК (циркРНК) в клетках. В заключение мы демонстрируем точную количественную оценку циркРНК с помощью dd-PCR.
Introduction
Последние достижения в технологиях секвенирования РНК и новых вычислительных алгоритмах обнаружили нового члена растущего семейства некодирующих РНК, называемого круговой РНК (циркРНК)1. Как следует из названия, циркРНК представляют собой семейство одноцепочечных молекул РНК без свободных концов. Они образованы неканоническим сращиванием голова к хвосту, называемым обратным сращиванием, где восходящий акцептор сращивания соединяется ковалентно с нисходящим донорским сайтом сращивания, образуя стабильный круг РНК 1,2. Этот процесс может быть опосредован несколькими факторами, включая инвертированные повторяющиеся элементы Alu, присутствующие в восходящем и нисходящем потоке циркуляризированных экзонов, или может быть опосредован некоторыми факторами сплайсинга или РНК-связывающими белками (RBP)2,3. Круговые РНК, генерируемые исключительно из экзонной или интронной последовательности, классифицируются как экзонные циркРНК и циркулярные интронные РНК или ci-РНК, тогда как некоторые экзонные циркРНК сохраняют интрон и называются экзон-интронными циркРНК (EIcircRNAs)3,4. Функции циркРНК многогранны, включая губку миРНК и/или RBP, регулирующую транскрипцию и регулирующую клеточную функцию путем трансляции в пептиды 3,5,6,7. В нескольких докладах подчеркивается значение циркРНК при различных заболеваниях и физиологических процессах8. Кроме того, тканеспецифические паттерны экспрессии и резистентность к перевариванию экзонуклеазы делают ее функциональным биомаркером для диагностики заболеваний, и ее также можно использовать в качестве подходящей терапевтической мишени8. Учитывая его важность в регулировании здоровья и заболеваний, точная количественная оценка экспрессии циркРНК является необходимостью часа.
Было разработано несколько биохимических методов для количественной оценки циркРНК в биологических образцах9. Одним из наиболее удобных и широко распространенных методов количественного определения циркРНК является обратная транскрипция с последующей количественной полимеразной цепной реакцией (RT-qPCR) с использованием дивергентных пар праймеров10. Тем не менее, большинство циркРНК находятся в низком изобилии по сравнению с линейными мРНК, что затрудняет их количественную оценку11. Чтобы преодолеть эту проблему, мы стремились использовать цифровую капельную ПЦР (dd-PCR) для точной количественной оценки количества циркРНК в данном образце. dd-PCR - это передовая технология ПЦР, которая следует принципу микрофлюидики; он генерирует несколько водных капель в масле, и ПЦР происходит в каждой капле как индивидуальная реакция12. Реакция возникает в отдельных каплях и анализируется с помощью капельного считывателя, который дает количество положительных или отрицательных капель для интересующего гена12. Это наиболее чувствительный метод точной количественной оценки интересующего гена, даже если в данном образце есть только одна копия. Снижение чувствительности к ингибиторам, лучшая точность и пропуск эталонного гена для количественной оценки делают его более выгодным, чем обычный qPCR 13,14,15. Он широко использовался в качестве исследовательского и диагностического инструмента для абсолютной количественной оценки интересующего гена16,17. Здесь мы описываем подробный протокол dd-PCR для количественной оценки циркРНК в дифференциации миотубок C2C12 мыши и пролиферирующих миобластов C2C12 мыши с использованием расходящихся праймер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
РНК чувствительна к РНКазам; поэтому все реагенты, инструменты и рабочие места должны быть свободны от РНКазы и обрабатываться с осторожностью.
1. Дивергентная конструкция грунтовки для циркРНК (см. Рисунок 1)
- Извлеките зрелую последовательность из данных аннотации циркРНК с помощью BEDTools или из браузера генома UCSC, соединив последовательность экзон/интрон, присутствующую между координатами стыкового соединения18,19.
- Подготовьте шаблонную последовательность ПЦР длиной 200 нуклеотидов, соединив последние 100 нуклеотидов общей длины последовательности циркРНК с первыми 100 нуклеотидами последовательности10 циркРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если длина циркРНК меньше 200 нуклеотидов, то разделите ее на две равные половины и присоедините нуклеотиды от последней половины до начала первой половины. - Используйте приведенную выше последовательность шаблонов для проектирования праймера с помощью веб-инструмента Primer3 и установки длины продукта ПЦР в диапазоне от 120 до 180 нуклеотидов в длину20.
- Используйте настройки primer3 по умолчанию для других параметров, таких как Tm и длина грунтовки. Последовательности праймеров для circBnc2 приведены в таблице 1.
- Закажите расходящиеся последовательности праймеров для синтеза у любой олигосинирующей компании.
2. Выделение РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Изолируйте общую РНК из клеток C2C12 мыши, используя любые коммерчески доступные наборы или собственный метод выделения РНК. Внутренний метод изоляции РНК, используемый здесь, был описан ранее21. Магнитные кварцевые шарики получают в лаборатории с использованием ранее опубликованного протокола22. Эти магнитные бусины также могут быть приобретены у различных поставщиков.
- Возьмите одну чашку размером 10 см, содержащую около 5 х 106 пролиферирующих клеток миобластов C2C12 и одну 4-дневную дифференцированную миотубу C2C12 для выделения РНК.
- Промыть ячейки 10 мл 1x PBS три раза и выбросить PBS с помощью пипетки.
- Соскоблите ячейки в 1 мл 1x PBS с помощью клеточного скребка, центрифугируйте их при 4 °C в течение 5 мин при 750 x g и выбросьте PBS с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл реагента выделения РНК (RIR) и лизируйте клетки путем энергичного пипетирования21.
- Добавьте 200 мкл (1/5 объема RIR) хлороформа и вихря в течение 15 с. Центрифугируйте трубку при 4 °C в течение 10 мин при 12 000 х г.
- Возьмите 400 мкл верхнего водного слоя, загрузите его на кремнеземную колонну и центрифугируйте в течение 1 мин при 12 000 х г при комнатной температуре. Возьмите проточную трубу в новую трубку и добавьте 600 мкл 100% этанола.
- Добавьте 20 мкл магнитных кварцевых шариков и поместите трубку на термомикшер, установленный при 25 °C и 1 200 об/мин в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем шарика может быть увеличен или уменьшен в зависимости от начальных чисел клеток, взятых для лизиса. Магнитные кварцевые шарики могут быть приобретены у коммерческих поставщиков. - Поместите трубку на магнитную подставку на 30 с или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Осторожно выбросьте супернатант с помощью пипетки.
- Повторное суспендирование шариков магнитного кремнезема в буфере промывки объемом 500 мкл, содержащем 90% этанола. Поместите трубку на магнитную подставку на 30 с. Дважды поверните трубку на магнитной подставке, чтобы вымыть бусины. Дайте бусинам осесть к магниту и выбросьте буфер с помощью пипетки.
- Повторите шаг 2.9 дважды. После стирки ненадолго раскрутите трубку и поместите ее обратно на магнитную подставку на 30 с. Отбросьте оставшийся буфер для стирки. Высушите трубку на воздухе при 50 °C в течение 3 мин на термомиксаторе, держа крышку открытой.
- Добавьте 20 мкл воды без нуклеазы и повторно суспендируйте шарики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем элюирования РНК может быть уменьшен до 10 мкл для увеличения концентрации РНК. - Поместите в тубы на 2-3 мин при комнатной температуре. Поместите трубку обратно на магнитную подставку и дайте ей постоять в течение 30 с. Соберите растворенную РНК в новую трубку для оценки количества и качества с помощью спектрофотометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: РНК может храниться при −20 °C или −80 °C для длительного хранения. Для получения оптимального результата рекомендуется приступить к этапу синтеза кДНК на следующий день.
3. Синтез кДНК
- Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра и возьмите 1 мкг РНК для синтеза кДНК.
- Смешайте 1 мкг общей РНК с 1 мкл смеси dNTP (по 10 мМ каждого из dATP, dTTP, dGTP и dCTP), 4 мкл буфера 5x обратной транскриптазы (RT), 2 мкл 10x RT случайного праймера, 0,25 мкл фермента обратной транскриптазы (200 Ед / мкл) и 0,5 мкл ингибитора РНКАЗЫ (40 Ед / мкл) и составляйте объем до 20 мкл с использованием воды без нуклеазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем фермента обратной транскриптазы может быть изменен в зависимости от исходной концентрации РНК, взятой для синтеза кДНК. - Постучите по трубке, чтобы перемешать реакцию и ненадолго вращать. Поместите тубу при температуре 25 °C в течение 10 мин, а затем при 50 °C в течение 1 ч.
- Чтобы инактивировать фермент, поместите трубку при 85 °C в течение 5 мин.
- Лед охлаждает трубку в течение 2 мин и добавляет в трубку 480 мкл воды без нуклеазы, чтобы концентрация кДНК достигла 2 нг/мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: кДНК может храниться при -20 °C или немедленно использоваться для анализа dd-PCR.
4. Рабочий процесс цифровой капельной ПЦР (dd-PCR)
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс dd-PCR включает в себя несколько этапов, начиная с подготовки образца, за которым следует генерация капель, амплификация ПЦР, подсчет капель и анализ данных. Каждый шаг имеет решающее значение для точной генерации данных, поскольку dd-PCR включает в себя абсолютную количественную оценку продуктов и не нуждается в какой-либо стандартной кривой. Следовательно, каждый из различных этапов ДД-ПЦР был описан ниже.
- Получение реакции дд-ПЦР.
- Настройте реакцию ПЦР 22 мкл в ПЦР-трубках или полосках 0,2 мл вместе с отрицательной контрольной трубкой и трубками NTC (нешаблонный контроль).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая отдельная расходящаяся пара праймеров для обнаружения различных циркРНК должна иметь реакцию NTC вместе с тестовыми образцами. - Добавьте 11 мкл мастер-микса dd-PCR (например, EvaGreen Supermix) и 11 мкл воды без нуклеазы, чтобы создать отрицательную контрольную реакционную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте мастер-смесь dd-PCR при комнатной температуре с последующим коротким вихрем, чтобы получить однородную смесь. Используйте ту же воду без нуклеаз для установки отрицательной контрольной реакционной трубки и трубок NTC, которые использовались для разбавления кДНК. - Добавьте 11 мкл мастер-микса dd-PCR, 5,5 мкл циркРНК-специфической прямой и обратной праймерной смеси концентрации 1 мкМ и 5,5 мкл воды без нуклеазы для создания реакционных трубок NTC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавить прямые и обратные круговые РНК-специфические расходящиеся праймеры запаса 100 мкМ и перемешать для получения рабочей концентрации 1 мкМ прямой и обратной циркрнК-праймерной смеси; таким образом, конечная концентрация праймера составляет 250 нМ в реакции 22 мкл. - Добавьте 11 мкл мастер-микса dd-PCR, 5,5 мкл циркРНК-специфической прямой и обратной праймерной смеси концентрации 1 мкМ и 5,5 мкл кДНК (2 нг/мкл) для создания пробирок.
- За вихрем следует кратковременное центрифугирование всех реакционных трубок для получения однородной реакционной смеси в нижней части трубок.
- Настройте реакцию ПЦР 22 мкл в ПЦР-трубках или полосках 0,2 мл вместе с отрицательной контрольной трубкой и трубками NTC (нешаблонный контроль).
- Генерация капель.
- Перенесите 20 мкл ПЦР-смеси из ПЦР-пробирок 0,2 мл в пробоотборники картриджа генератора капель.
- Осторожно добавьте 70 мкл масла для генерации капель в нефтяные скважины картриджа генератора капель с помощью многоканальной пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте масло для образования капель при комнатной температуре в течение 15 мин перед использованием. - Накройте картридж генератора капель резиновой прокладкой и поместите его в машину генератора капель, чтобы получить пробно-масляную капельную смесь, образующуюся в капельных колодцах картриджа.
- ПЦР-амплификация.
- Перенесите 40 мкл смеси образцов и капель масла из капельных колодцев картриджа генератора капель на 96-луночную ПЦР-пластину с помощью многоканальной пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно переложите пробу масляной капельной смеси, делая угол к скважинам через кончики многоканальной пипетки, чтобы избежать разрушения капель при переносе их на 96-луночную пластину dd-PCR. - Запечатайте 96-луночную ПЦР-пластину герметизатором из алюминиевой фольги, поместите ее в машинный блок пластинчатого герметика, предварительно нагретый при 80 °C, и нажмите на уплотнение для уплотнения пластины ПЦР.
- Теперь поместите пластину в термоциклер dd-PCR и установите программу, как указано в таблице 2 , с температурой крышки, установленной на уровне 105 ° C, и скоростью рампы 2 ° C / с.
- Перенесите 40 мкл смеси образцов и капель масла из капельных колодцев картриджа генератора капель на 96-луночную ПЦР-пластину с помощью многоканальной пипетки.
- Подсчет капель.
- После того, как ПЦР закончится, поместите пластину на аппарат для счетчика капель dd-PCR с держателем пластины в правильном положении для подсчета капель.
- Откройте программное обеспечение для анализа капель и настройте запуск, предоставив входные данные для информации образца.
- Нажмите на опцию настройки. Затем нажмите на опцию шаблона , чтобы открыть новый шаблон.
- Определите каждую скважину, указав детали эксперимента, такие как название образца (используемая кДНК или отрицательный контроль или NTC), целевое имя (название праймера циркРНК) и тип (неизвестно), а также тип эксперимента как ABS (абсолютная количественная оценка) и Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) и т. Д.
- Наконец, сохраните шаблон и начните запуск, щелкнув опцию запуска и выбрав подсчет по строкам или столбцам. Позвольте машине завершить подсчет капель, который занимает около 1 мин/лунку.
- Нажмите кнопку Анализ , чтобы проанализировать данные после завершения считывания капель.
- Нажмите кнопку 1D Amplitude , чтобы увидеть положительные и отрицательные капли
- Чтобы отделить положительные капли от отрицательных капель, поставьте общую пороговую линию для всех образцов с одной и той же мишенью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество капель в каждом образце должно превышать 10 000, чтобы считаться абсолютным количественным показателем. NTC не должен показывать положительное количество капель. Наличие положительных капель в НТК свидетельствует о загрязнении реагентов или усилении праймерных димеров. Трудно выяснить, имеют ли положительные капли праймерные димеры или неспецифические продукты в НТЦ. Рекомендуется проверять праймеры и избегать любого загрязнения реагентов в качестве общей практики для любой ПЦР, включая dd-PCR. - Нажмите кнопку Экспорт , чтобы экспортировать данные о подсчете циркРНК в виде файла .csv. Экспортированные данные показывают количество циркРНК, присутствующих в каждом образце.
- Вручную рассчитайте количество циркРНК в каждом образце на нанограмм РНК, учитывая общее количество кДНК, используемой в каждой реакции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Абсолютное число циркРНК в каждом образце может быть получено из экспортированных данных ДД-ПЦР. Количественный анализ ПЦР в реальном времени показал дифференциальную экспрессию circBnc2 в дифференцированных миотрубах C2C12 (данные не показаны). Здесь мы хотели проверить абсолютное число копий circBnc2 в пролиферирующих миобластах и миотубах C2C12. Поскольку экспрессия circBnc2 сравнивается в двух условиях, очень важно обрабатывать все образцы для выделения РНК, синтеза кДНК и ПЦР одновременно с использованием одних и тех же реагентов и процедуры. Для выполнения абсолютной количественной оценки циркРНК с использованием реакции dd-PCR для синтеза кДНК следует использовать равное количество исходной общей РНК для расчета точного количества молекул целевой РНК на нанограмм общей РНК. Например, 1 мкг общей РНК использовали для синтеза кДНК и разбавляли до 500 мкл без нуклеазной воды для получения конечной концентрации 2 нг/мкл перед выполнением анализа dd-PCR (рисунок 1).
Как показано на рисунке 2A, кДНК из 10 нг РНК из пролиферирующих клеток миобласт C2C12 (MB) и 4-дневной дифференцированной миотрубы (MT) использовали для проверки разницы в экспрессии circBnc2 в этих двух условиях. Образцы обрабатывали для генерации капель и выполнения ПЦР с последующим подсчетом положительных и отрицательных капель с использованием программного обеспечения для анализа капель в соответствии с инструкциями производителя (рисунок 2B). Поскольку грунтовки могут усиливать неспецифические продукты и образовывать димеры грунтовки, NTC следует использовать для всех наборов грунтовок. В идеале NTC не должен иметь положительного количества капель.
Как показано на рисунке 3A, все образцы, кроме MT1, показали более 12 000 капель. Поскольку общее количество капель в МТ1 было низким, эта выборка не рассматривалась для окончательного анализа данных. Низкое общее количество капель может быть связано с ошибкой в генерации капель, разрывом капель во время переноса на пластину ПЦР или проблемами с пипеткой. Интересно, что наблюдалась явная разница в структуре экспрессии circBnc2 в 4-дневном дифференцированном состоянии миотуба по сравнению с клетками миобластов. Анализ обилия circBnc2 с точки зрения числа копий показал, что три реплики миобласт C2C12 имели 76,8, 67 и 46 копий / нг РНК, в то время как два образца миотрубок имели 558 и 610 копий / нг РНК (рисунок 3B). Поскольку один образец миотубей не работал хорошо, лучше иметь большее количество биологических реплик для изучения статистических различий в их паттернах экспрессии в двух условиях.
Рисунок 1: Схематическое изображение дивергентной конструкции грунтовки для ПЦР-амплификации circBnc2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рабочий процесс dd-PCR для количественной оценки циркРНК. Полный рабочий процесс dd-PCR включает в себя множество этапов: (A) выделение РНК и подготовка кДНК из миобласта C2C12 и 4-дневных дифференцированных клеток миотубы, приготовление смеси ПЦР, (B) генерация капель, амплификация ПЦР, подсчет капель и анализ данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ данных с использованием программного обеспечения QuantaSoft. (A) Анализ данных включает идентификацию положительных и отрицательных капель с помощью программного обеспечения для количественного определения. (B) Расчет количества циркРНК/нг РНК в миобластах C2C12 (МБ) и миотрубах (МТ). Данные на панели B гистограммы представляют собой среднее ± STDEV двух-трех биологических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Название букваря | Последовательность |
| circBnc2 Прямая грунтовка | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2 Обратная грунтовка | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
Таблица 1: Дивергентные праймерные последовательности, используемые для усиления circBnc2.
| Шаг | Температура (°C) | Время | Количество циклов | Скорость рампы |
| Активация ферментов | 95 | 10 мин | 1 | ~ 2 °С/с |
| Денатурация | 94 | 30 с | 40 | ~ 2 °С/с |
| Отжиг/Расширение | 60 | 1 мин | 40 | ~ 2 °С/с |
| Стабилизация сигнала | 4 | 5 мин | 1 | ~ 2 °С/с |
| Стабилизация сигнала | 90 | 5 мин | 1 | ~ 2 °С/с |
Таблица 2: Условия ПЦР-амплификации circBnc2 на термоциклере.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования CircRNA выросли в последнее десятилетие с открытием высокопроизводительных технологий секвенирования. В результате он был рассмотрен как потенциальная молекула для будущей РНК-терапии. Кроме того, известно, что он действует как биомаркер при нескольких заболеваниях, включая рак и сердечно-сосудистые заболевания 4,8. Тем не менее, идентификация циркРНК сложна из-за ее низкого содержания и наличия только одной специфической последовательности обратных соединений, которая отличает ее от родительской мРНК9. ОТ-ПЦР с использованием расходящихся праймеров был золотым стандартом для проверки циркРНК с момента ее открытия 9,10. Хотя для количественной оценки циркРНК было разработано несколько молекулярных методов, трудно точно измерить экспрессию циркРНК из-за их низкого содержания. Поскольку дд-ПЦР может амплифицировать молекулы РНК/ДНК с очень низким содержанием из данного образца14, это один из лучших методов точной количественной оценки циркРНК.
dd-PCR - это анализ конечной точки, который дает абсолютную количественную оценку гена-мишени15. В отличие от обычной qPCR, она занимает много времени, утомительна и дорога, что делает ее менее приемлемой по сравнению с ПЦР в реальном времени даже через десять лет после ее открытия15. Тем не менее, он предлагает несколько преимуществ по сравнению с широко используемым qPCR для изучения изменений экспрессии генов13,23. Во-первых, dd-PCR может обеспечить точное количество копий ДНК, присутствующих в данном образце. Во-вторых, изменение экспрессии генов домашнего хозяйства изменяет расчет целевой популяции генов в данном образце. Этого можно избежать при дд-ПЦР, которая не зависит от стандартных кривых или генов ведения хозяйства для количественной оценки целевой ДНК15. В-третьих, поскольку реакция ПЦР происходит в небольших компартментах, она обеспечивает более высокую гибкость в отношении присутствия неспецифических ингибиторов или фоновой ДНК, что делает ее более точным методом количественной оценки генов-мишеней23,24.
Мы использовали технологию dd-PCR для количественной оценки экспрессии circBnc2 в пролиферирующих миобластах C2C12 и дифференцировали миотубы с использованием расходящихся праймеров. Однако специфическая амплификация циркРНК с расходящимися парами праймеров без праймер-димеров должна быть проверена в регулярной ПЦР перед выполнением dd-PCR. Кроме того, протокол dd-PCR должен тщательно соблюдаться для точного измерения экспрессии циркРНК. Рабочий процесс, представленный здесь, может быть легко адаптирован для количественной оценки любой циркРНК, представляющей интерес. Недавние исследования выявили диагностические значения циркрнК, присутствующих в тканях и жидкостях организма для выявления заболеваний8. Вместе этот метод станет важным инструментом в индустрии исследований и диагностики и ускорит исследования циркРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана внутренним финансированием института наук о жизни, исследовательским грантом DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) и стипендией Wellcome Trust/DBT India Alliance Fellowship [IA/I/18/2/504017], присужденной Амарешу К. Панде. Мы благодарим других членов лаборатории за корректуру статьи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L.
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C.
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
