Summary
このプロトコルでは、ダイバージェントプライマーを使用して細胞内の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量するためのデジタルドロップレットPCR(dd-PCR)の詳細な方法について説明します。
Abstract
デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(dd-PCR)は、最も感度の高い定量方法の1つです。反応を約20,000個の油中水滴に分画し、PCRは個々の液滴で行われます。dd-PCRは、低存在量のターゲットの検出精度の向上、定量のための参照遺伝子の省略、サンプルの技術的な複製の排除、サンプル中の阻害剤に対する高い回復力を示すなど、従来のリアルタイムqPCRに比べていくつかの利点があります。最近、dd-PCRは、遺伝子発現解析および診断のために標的DNAまたはRNAを正確に定量するための最も一般的な方法の1つになっています。環状RNA(circRNA)は、最近発見された共有結合的に閉じたRNA分子の大きなファミリーで、5'末端と3'末端を欠いています。それらは、RNA結合タンパク質およびマイクロRNAのスポンジとして作用することによって遺伝子発現を調節することが示されている。さらに、circRNAは体液中に分泌され、エキソヌクレアーゼに対する耐性があるため、疾患診断のバイオマーカーとして機能します。本稿では、ダイバージェントプライマー設計、RNA抽出、cDNA合成、およびdd-PCR分析を実行して、細胞内の特定の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量する方法を示すことを目的としています。結論として、dd-PCRを用いたcircRNAの正確な定量を実証する。
Introduction
RNAシーケンシング技術と新しい計算アルゴリズムの最近の進歩により、環状RNA(circRNA)1と呼ばれるノンコーディングRNAファミリーの新しいメンバーが発見されました。名前が示すように、circRNAは自由末端を持たない一本鎖RNA分子のファミリーです。これらは、バックスプライシングと呼ばれる非標準的なヘッドツーテールスプライシングによって形成され、上流のスプライスアクセプター部位が下流のスプライスドナー部位と共有結合して安定したRNAサークルを形成します1,2。このプロセスは、環状エクソンの上流および下流に存在する逆Alu反復要素を含むいくつかの要因によって媒介されるか、またはいくつかのスプライシング因子またはRNA結合タンパク質(RBP)によって媒介される可能性があります2,3。エキソン配列またはイントロニック配列のみから生成された環状RNAは、エキソンcircRNAおよび環状イントロニックRNAまたはci-RNAに分類されますが、一部のエキソンcircRNAはイントロンを保持し、エクソン-イントロンcircRNA(EIcircRNA)と呼ばれます3,4。circRNAの機能は、miRNAおよび/またはRBPのスポンジング、転写の調節、ペプチドへの翻訳による細胞機能の調節など、多面的です3,5,6,7。いくつかの報告は、さまざまな疾患や生理学的プロセスにおけるcircRNAの重要性を強調しています8。さらに、組織特異的な発現パターンとエキソヌクレアーゼ消化に対する耐性は、疾患診断のための機能的なバイオマーカーとなり、適切な治療標的としても使用することができます8。健康と病気の調節におけるその重要性を考えると、circRNA発現の正確な定量は時間の必要性です。
生物学的サンプル中のcircRNAを定量するために、いくつかの生化学的方法が開発されている9。circRNA定量のための最も便利で広く受け入れられている方法の1つは、逆転写とそれに続くダイバージェントプライマーペア10を使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)です。しかし、circRNAの大部分は直鎖状mRNAに比べて存在量が少ないため、定量することは困難です11。この問題を克服するために、デジタルドロップレットPCR(dd-PCR)を使用して、特定のサンプル中のcircRNAの数を正確に定量することを目指しました。dd-PCRは、マイクロフルイディクスの原理に従った高度なPCR技術です。油中に複数の水性液滴を生成し、個々の反応12として各液滴中でPCRが起こる。反応は個々の液滴で起こり、液滴リーダーを使用して分析され、目的の遺伝子に対する正または負の液滴の数が得られます12。これは、特定のサンプルにコピーが1つしかない場合でも、目的の遺伝子を正確に定量するための最も感度の高い手法です。阻害剤に対する感度の低下、精度の向上、定量のための参照遺伝子の省略により、従来のqPCR13,14,15よりも有利になります。これは、目的の遺伝子の絶対定量のための研究および診断ツールとして広く使用されています16,17。ここでは、ダイバージェントプライマーを用いたマウスC2C12筋細胞および増殖マウスC2C12筋芽細胞の分化におけるcircRNA定量のための詳細なdd-PCRプロトコルについて説明します。
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Protocol
RNAはRNaseに敏感です。したがって、すべての試薬、機器、およびワークスペースはRNaseを含まず、取り扱いには注意が必要です。
1. circRNAのダイバージェントプライマー設計( 図1参照)
- BEDToolsを使用してcircRNAアノテーションデータから、またはバックスプライス接合座標18,19の間に存在するエクソン/イントロン配列を結合することにより、UCSCゲノムブラウザーから成熟配列を取得します。
- 全長のcircRNA配列の最後の100ヌクレオチドを10のcircRNA配列の最初の100ヌクレオチドに結合することにより、長さ200ヌクレオチドのPCR鋳型配列を調製する。
注:circRNAの長さが200ヌクレオチド未満の場合は、それを2つの等しい半分に分割し、後半から前半の初めまでヌクレオチドを結合します。 - Primer3ウェブツールを使用して、120〜180ヌクレオチド長20の範囲のPCR産物長を設定することにより、プライマー設計に上記のテンプレート配列を使用します。
- Primer3 のデフォルト設定は、Tmやプライマー長などの他のパラメータに使用します。circBnc2のプライマー配列を 表1に列挙する。
- 合成用の異なるプライマー配列を任意のオリゴ合成会社に注文してください。
2. RNA単離
注:市販のキットまたは社内のRNA単離法を使用して、マウスC2C12細胞からトータルRNAを単離します。ここで用いられる社内RNA単離法については、既に説明した21。磁性シリカビーズは、以前に公開されたプロトコル22を使用してラボで調製されます。これらの磁気ビーズは、さまざまなベンダーから調達することもできます。
- RNA単離のために、約5 x 106 増殖C2C12筋芽細胞と4日間分化したC2C12筋管を含む10 cmディッシュ1つを取ります。
- 10 mLの1x PBSで細胞を3回洗浄し、ピペットを使用してPBSを廃棄します。
- セルスクレーパーを使用して1 mLの1x PBSで細胞をスクレイピングし、750 x gで4°Cで5分間遠心分離し、ピペットを使用してPBSを廃棄します。
- RNA単離試薬(RIR)1mLを添加し、激しいピペッティング21により細胞を溶解する。
- 200 μL(RIRの体積の1/5)のクロロホルムとボルテックスを15秒間加えます。チューブを4°Cで12,000 x gで10分間遠心分離します。
- 400 μLの上水層を取り、シリカカラムにロードし、室温で12,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを新しいチューブに持ち込み、600 μLの100%エタノールを加えます。
- 20 μLの磁性シリカビーズを加え、チューブを25°C、1,200 rpmに設定したサーモミキサーに5分間置きます。
注:ビーズの体積は、溶解のために採取された初期細胞数に応じて増減できます。磁性シリカビーズは、商業ベンダーから調達できます。 - チューブを磁気スタンドに30秒間、または溶液が透明になるまで置きます。ピペットを使用して上清を慎重に廃棄します。
- 磁性シリカビーズを90%エタノールを含む500 μLの洗浄バッファーに再懸濁します。チューブを磁気スタンドに30秒間置きます。磁気スタンドでチューブを2回回転させて、ビーズを洗浄します。ビーズを磁石に向かって落ち着かせ、ピペットを使用してバッファーを廃棄します。
- 手順 2.9 を 2 回繰り返します。洗浄後、チューブを短時間回転させ、磁気スタンドに30秒間戻します。残りの洗浄バッファーを廃棄します。チューブをサーモミキサーで50°Cで3分間風乾し、蓋を開けたままにします。
- ヌクレアーゼフリーの水20 μLを加え、ビーズを再懸濁します。
注:RNA溶出量を10 μLまで減らして、RNA濃度をスケールアップすることができます。 - チューブを室温で2〜3分間置きます。チューブを磁気スタンドに戻し、30秒間放置します。溶解したRNAを新しいチューブに集め、分光光度計を使用して量と質を評価します。
注:RNAは、長期保存のために-20°Cまたは-80°Cで保存できます。最適な結果を得るには、翌日にcDNA合成ステップに進むことをお勧めします。
3. cDNA合成
- 分光光度計を使用してRNA濃度を測定し、cDNA合成のために1μgのRNAを採取します。
- 1 μgのトータルRNAを1 μLのdNTPミックス(dTP、DTTP、DGTP、DCTPの各10 mM)、4 μLの5x逆転写酵素(RT)バッファー、2 μLの10x RTランダムプライマー、0.25 μLの逆転写酵素(200 U/μL)、および0.5 μLのRNase阻害剤(40 U/μL)と混合し、ヌクレアーゼフリーの水を使用して最大20 μLの容量を構成します。
注:逆転写酵素の量は、cDNA合成のために採取された初期RNA濃度に応じて変化させることができます。 - チューブをタップして反応を混合し、短時間回転させます。チューブを25°Cで10分間置き、続いて50°Cで1時間置きます。
- 酵素を不活性化するには、チューブを85°Cで5分間置きます。
- チューブを2分間氷冷し、480 μLのヌクレアーゼフリー水をチューブに加えて、cDNA濃度を2 ng/μLにします。
注:cDNAは-20°Cで保存することも、dd-PCR分析にすぐに使用することもできます。
4. デジタルドロップレットPCR(dd-PCR)ワークフロー
注:dd-PCRのワークフローには、サンプル調製から始まり、液滴の生成、PCR増幅、液滴カウント、およびデータ分析に続く複数のステップが含まれます。dd-PCRは産物の絶対定量を含み、検量線を必要としないため、各ステップは正確なデータ生成に不可欠です。したがって、dd-PCRの異なるステップのそれぞれを以下に説明しました。
- dd-PCR反応の調製。
- 0.2 mL PCRチューブまたはストリップに22 μLのPCR反応を、ネガティブコントロールチューブおよびNTC(非テンプレートコントロール)チューブとともにセットアップします。
注:異なるcircRNAを検出するための異なる発散プライマーペアは、それぞれテストサンプルとともにNTC反応を起こす必要があります。 - 11 μLのdd-PCRマスターミックス(エバグリーンスーパーミックスなど)と11 μLのヌクレアーゼフリー水を加えて、ネガティブコントロール反応チューブをセットアップします。
注:dd-PCRマスターミックスを室温で解凍した後、短時間渦を流して均一な混合物を作ります。cDNAの希釈に使用したのと同じヌクレアーゼフリーの水を使用して、ネガティブコントロール反応チューブとNTCチューブをセットアップします。 - 11 μLのdd-PCRマスターミックス、5.5 μLの1 μM濃度のcircRNA特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーミックス、および5.5 μLのヌクレアーゼフリー水を加えて、NTC反応チューブをセットアップします。
注:100 μMストックの正環状および逆環状RNA特異的ダイバージェントプライマーを希釈して混合し、1 μMの作業濃度の順方向および逆方向のcircRNAプライマー混合物を調製します。したがって、22 μL反応における最終的なプライマー濃度は250 nMです。 - 11 μLのdd-PCRマスターミックス、5.5 μLの1 μM濃度のcircRNA特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーミックス、および5.5 μLのcDNA(2 ng / μL)を加えて、テスト反応チューブをセットアップします。
- ボルテックスに続いて、すべての反応チューブを短時間遠心分離して、チューブの底部に均一な反応混合物を得ました。
- 0.2 mL PCRチューブまたはストリップに22 μLのPCR反応を、ネガティブコントロールチューブおよびNTC(非テンプレートコントロール)チューブとともにセットアップします。
- 液滴の生成。
- 20 μLのPCR混合物を0.2 mL PCRチューブから液滴発生器カートリッジのサンプルウェルに移します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、液滴発生カートリッジの油井に70μLの液滴生成オイルを慎重に加えます。
注意: 使用前に、液滴生成オイルを室温で15分間インキュベートします。 - 液滴発生器カートリッジをゴム製ガスケットで覆い、液滴発生機に入れて、カートリッジの液滴ウェルで生成されたサンプルと油滴の混合物を取得します。
- PCR増幅。
- マルチチャンネルピペットを使用して、液滴発生器カートリッジの液滴ウェルから96ウェルPCRプレートに40 μLのサンプルオイル液滴混合物を移します。
注:dd-PCR 96ウェルプレートに移す際に液滴が壊れないように、マルチチャンネルピペットの先端からウェルに角度を付けながら、サンプルと油滴の混合物を慎重に移します。 - 96ウェルPCRプレートをアルミホイルシーラーで密封し、80°Cに予熱したプレートシーラーマシンブロックに入れ、PCRプレートをシールするためにクリック シール します。
- 次に、プレートをdd-PCRサーマルサイクラーに入れ、蓋の温度を105°C、ランプレートを2°C / sに設定して 、表2 に記載されているようにプログラムを設定します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、液滴発生器カートリッジの液滴ウェルから96ウェルPCRプレートに40 μLのサンプルオイル液滴混合物を移します。
- 液滴カウント。
- PCRが終了したら、プレートホルダーを正しい位置にしてプレートをdd-PCRドロップレットカウンターマシンに置きます。
- 液滴分析ソフトウェアを開き、サンプル情報を入力してランを設定します。
- セットアップオプションをクリックします。次に、テンプレートオプションをクリックして、新しいテンプレートを開きます。
- サンプル名(使用または陰性対照またはNTC)、ターゲット名(circRNAプライマー名)およびタイプ(不明)、およびABS(絶対定量)およびスーパーミックス(dd-PCR EvaGreenスーパーミックス)として使用する実験タイプなど、実験の詳細を入力して各ウェルを定義します。
- 最後に、テンプレートを保存し、実行オプションをクリックして 実行 を開始し、 行単位または列単位のカウントを選択します。機械が液滴カウントを完了できるようにしますが、これには約1分/ウェルかかります。
- [分析]ボタンをクリックして、液滴の読み取りが完了した後にデータを 分析 します。
- 1D振幅ボタンをクリックして、正と負の液滴を確認します
- 陽性の液滴を負の液滴から分離するには、同じターゲットを持つすべてのサンプルに共通のしきい値線を配置します。
注:絶対定量を検討するには、各サンプルの総液滴が10,000を超える必要があります。NTCは正の液滴数を表示しないでください。NTC中の陽性液滴の存在は、試薬の汚染またはプライマー二量体の増幅を示す。陽性液滴がNTCにプライマーダイマーまたは非特異的生成物を有するかどうかを調べることは困難である。dd-PCRを含むPCRの一般的な慣行として、プライマーをチェックし、試薬の汚染を避けることをお勧めします。 - [エクスポート] ボタンをクリックして、circRNA カウント データを.csv ファイルとしてエクスポートします。エクスポートされたデータは、各サンプルに存在するcircRNAの数を示しています。
- 各反応で使用されるcDNAの総量を考慮して、RNAナノグラムあたりの各サンプル中のcircRNAの数を手動で計算します。
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Representative Results
各サンプル中のcircRNAの絶対数は、エクスポートされたdd-PCRデータから導き出すことができます。リアルタイム定量PCR分析は、分化したC2C12筋管細胞における circBnc2 の差次的発現を示唆した(データは示さず)。ここでは、増殖するC2C12筋芽細胞および筋管における circBnc2 の絶対コピー数を確認したいと考えました。 circBnc2 の発現は2つの条件で比較されるため、同じ試薬と手順を使用して、RNA単離、cDNA合成、およびPCRのためにすべてのサンプルを同時に処理することが非常に重要です。dd-PCR反応を用いてcircRNAの絶対定量を行うには、cDNA合成に等量の初期総RNAを使用して、全RNAナノグラムあたりの標的RNA分子の正確な数を計算する必要があります。例えば、cd-PCRアッセイを実行する前に、cDNA合成に1 μgの総RNAを使用し、ヌクレアーゼフリー水を使用して500 μLに希釈して最終濃度2 ng/μLを得ました(図1)。
図2Aに示すように、増殖したC2C12筋芽細胞由来の10ngのRNA由来のcDNA(MB)と4日間分化した筋管細胞(MT)を用いて、これら2つの条件におけるcircBnc2の発現差を調べた。サンプルを処理して液滴を生成し、PCRを実行し、続いて、製造元の指示に従って液滴分析ソフトウェアを使用して陽性および陰性の液滴をカウントしました(図2B)。プライマーは非特異的産物を増幅し、プライマーダイマーを形成する可能性があるため、NTCはすべてのプライマーセットに使用する必要があります。理想的には、NTCは正の液滴数を持たないはずです。
図3Aに示すように、MT1を除くすべてのサンプルは12,000を超える液滴数を示しました。MT1では総液滴数が少なかったため、このサンプルは最終データ分析には考慮されませんでした。総液滴数が少ないのは、液滴生成のエラー、PCRプレートへの転送中の液滴の破裂、またはピペッティングの問題が原因である可能性があります。興味深いことに、筋芽細胞と比較して、4日間分化した筋管状態でcircBnc2の発現パターンに明らかな違いがありました。コピー数の観点からcircBnc2の存在量を分析したところ、C2C12筋芽細胞の3つの反復では76.8、67、および46コピー/ngのRNAがあり、2つの筋管サンプルには558および610コピー/ ngのRNAがありました(図3B)。1つの筋管サンプルがうまく機能しなかったため、2つの条件での発現パターンの統計的差異を調べるには、生物学的複製の数を増やすことをお勧めします。
図1:circBnc2のPCR増幅のための発散プライマーデザインの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:サークRNA定量のためのdd-PCRワークフロー。 完全なdd-PCRワークフローには、(A)C2C12筋芽細胞および4日間分化筋管細胞からのRNA単離およびcDNA調製、PCR混合物調製、(B)液滴生成、PCR増幅、液滴カウント、およびデータ解析の多くのステップが含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:QuantaSoft ソフトウェアを使用したデータ分析。 (A)データ解析には、定量ソフトウェアを使用した陽性および陰性の液滴の識別が含まれます。(B)C2C12筋芽細胞(MB)および筋管細胞(MT)におけるRNAのcircRNA/ngの数を計算する。パネル B の棒グラフのデータは、2〜3回の生物学的反復の平均±STDEVを表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| プライマー名 | 順序 |
| circBnc2フォワードプライマー | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2リバースプライマー | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
表 1: circBnc2の増幅に使用される多様なプライマー配列。
| 歩 | 気温(°C) | 時間 | サイクル数 | ランプレート |
| 酵素活性化 | 95 | 10 ミン | 1 | ~ 2 °C/s |
| 変性 | 94 | 30秒 | 40 | ~ 2 °C/s |
| アニーリング/伸長 | 60 | 1 ミン | 40 | ~ 2 °C/s |
| 信号安定化 | 4 | 5 ミン | 1 | ~ 2 °C/s |
| 信号安定化 | 90 | 5 ミン | 1 | ~ 2 °C/s |
表 2: サーマルサイクラーでの circBnc2 のPCR増幅の条件。
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Discussion
CircRNAの研究は、ハイスループットシーケンシング技術の発見により、過去10年間で成長しました。その結果、将来のRNA治療薬の潜在的な分子と見なされています。さらに、癌や心血管疾患を含むいくつかの疾患においてバイオマーカーとして作用することが知られている4,8。しかしながら、circRNAの同定は、その存在量が少なく、親mRNA9と区別する1つの特異的バックスプライス接合配列しか持たないため、難しい。ダイバージェントプライマーを用いたRT-PCRは、その発見以来、circRNAを検証するためのゴールドスタンダード技術となっています9,10。circRNAの定量にはいくつかの分子法が開発されていますが、circRNAの発現は存在量が少ないため、正確に測定することは困難です。dd-PCRは、特定のサンプル14から非常に少量のRNA/DNA分子を増幅できるため、circRNAを正確に定量するための最良の方法の1つです。
dd−PCRは、標的遺伝子15の絶対定量を与えるエンドポイントアッセイである。従来のqPCRとは異なり、時間がかかり、面倒で、費用がかかるため、発見から10年経ってもリアルタイムPCRと比較して受け入れられていません15。しかし、遺伝子発現の変化を研究するために広く使用されているqPCRに比べていくつかの利点があります13,23。まず、dd-PCRは、特定のサンプルに存在するDNAの正確なコピー数を提供できます。第二に、ハウスキーピング遺伝子発現の変化は、所与のサンプルにおける標的遺伝子集団の計算を変化させる。これは、標的DNA15を定量するための標準曲線またはハウスキーピング遺伝子に依存しないdd-PCRで回避できます。第三に、PCR反応は小さなコンパートメントで起こるため、非特異的阻害剤またはバックグラウンドDNAの存在に対してより高い柔軟性を提供し、標的遺伝子を定量するためのより正確な方法になります23,24。
dd-PCR技術を用いて、増殖するC2C12筋芽細胞および分化筋管における circBnc2 発現を、分岐プライマーを用いて定量化しました。ただし、プライマーダイマーを含まない分岐プライマーペアによる特異的circRNA増幅は、dd-PCRを実行する前に通常のPCRで確認する必要があります。また、circRNA発現を正確に測定するには、dd-PCRプロトコルに注意深く従う必要があります。ここで紹介するワークフローは、目的の任意のcircRNAの定量に簡単に適合させることができます。最近の研究では、疾患の検出のために組織や体液中に存在するcircRNAの診断値が強調されています8。一緒に、この方法は研究および診断業界で不可欠なツールとなり、circRNA研究を加速します。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、生命科学研究所からの壁内資金、DBT研究助成金(BT / PR27622 / MED/30/1961/2018)、およびウェルカムトラスト/ DBTインドアライアンスフェローシップ[IA / I / 18/2/504017]によってサポートされましたアマレシュC.パンダに授与されました。論文を校正してくださった他の研究室メンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
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