Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantifiering av cirkulära RNA med hjälp av digital dropp-PCR

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64464
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1
1Institute of Life Sciences, 2School of Biotechnology, KIIT University
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver den detaljerade metoden för digital dropp-PCR (dd-PCR) för exakt kvantifiering av cirkulära RNA -nivåer (circRNA) i celler med hjälp av divergerande primers.

Abstract

Digital dropppolymeraskedjereaktion (dd-PCR) är en av de mest känsliga kvantifieringsmetoderna; det fraktionerar reaktionen i nästan 20 000 vatten-i-oljedroppar, och PCR förekommer i de enskilda dropparna. dd-PCR har flera fördelar jämfört med konventionell qPCR i realtid, inklusive ökad noggrannhet vid detektering av mål med låg förekomst, utelämnande av referensgener för kvantifiering, eliminering av tekniska replikat för prover och visning av hög motståndskraft mot hämmare i proverna. Nyligen har dd-PCR blivit en av de mest populära metoderna för att exakt kvantifiera mål-DNA eller RNA för genuttrycksanalys och diagnostik. Cirkulära RNA (circRNA) är en stor familj av nyligen upptäckta kovalent slutna RNA-molekyler som saknar 5 'och 3' ändar. De har visat sig reglera genuttryck genom att fungera som svampar för RNA-bindande proteiner och mikroRNA. Dessutom utsöndras circRNA i kroppsvätskor, och deras motståndskraft mot exonukleas gör att de fungerar som biomarkörer för sjukdomsdiagnos. Denna artikel syftar till att visa hur man utför divergerande primerdesign, RNA-extraktion, cDNA-syntes och dd-PCR-analys för att exakt kvantifiera specifika cirkulära RNA (circRNA) nivåer i celler. Sammanfattningsvis demonstrerar vi den exakta kvantifieringen av circRNA med hjälp av dd-PCR.

Introduction

De senaste framstegen inom RNA-sekvenseringsteknik och nya beräkningsalgoritmer har upptäckt en ny medlem av den växande familjen av icke-kodande RNA, kallat cirkulärt RNA (circRNA)1. Som namnet antyder är circRNA en familj av enkelsträngade RNA-molekyler utan fria ändar. De bildas av icke-kanonisk head-to-tail-skarvning som kallas back-skarvning, där uppströms skarvacceptorplatsen förenas kovalent med nedströms skarvdonatorstället för att bilda en stabil RNA-cirkel 1,2. Denna process kan förmedlas av flera faktorer, inklusive inverterade Alu-repetitiva element som finns i uppströms och nedströms cirkulära exoner, eller kan förmedlas av vissa skarvningsfaktorer eller RNA-bindande proteiner (RBP)2,3. Cirkulära RNA som genereras uteslutande från den exoniska eller introniska sekvensen klassificeras som exoniskt circRNA och cirkulära introniska RNA eller ci-RNA, medan vissa exoniska circRNA behåller intron och kallas exon-intron circRNA (EIcircRNA)3,4. CircRNA: s funktioner är mångfacetterade, inklusive sponging miRNA och / eller RBP, reglering av transkription och reglering av cellulär funktion genom att översätta till peptider 3,5,6,7. Flera rapporter har belyst betydelsen av circRNA i olika sjukdomar och fysiologiska processer8. Dessutom gör vävnadsspecifika uttrycksmönster och resistens mot exonukleassmältning det till en funktionell biomarkör för sjukdomsdiagnos och det kan också användas som ett lämpligt terapeutiskt mål8. Med tanke på dess betydelse för att reglera hälsa och sjukdomar är den exakta kvantifieringen av circRNA-uttryck behovet av timmen.

Flera biokemiska metoder har utvecklats för att kvantifiera circRNA i biologiska prover9. En av de mest praktiska och allmänt accepterade metoderna för circRNA-kvantifiering är omvänd transkription följt av kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) med användning av divergerande primerpar10. Majoriteten av circRNA är dock i låg överflöd jämfört med linjära mRNA, vilket gör det utmanande att kvantifiera dem11. För att lösa detta problem försökte vi använda digital dropp-PCR (dd-PCR) för att kvantifiera antalet circRNA i ett givet prov exakt. dd-PCR är en avancerad PCR-teknik som följer mikrofluidikprincipen; det genererar flera vattenhaltiga droppar i olja, och PCR förekommer i varje droppe som en individuell reaktion12. Reaktionen sker i enskilda droppar och analyseras med hjälp av en droppläsare, vilket ger antalet positiva eller negativa droppar för genen av intresse12. Det är den mest känsliga tekniken för att exakt kvantifiera en gen av intresse, även om det bara finns en enda kopia i ett givet prov. Minskad känslighet för hämmare, bättre precision och utelämnande av referensgenen för kvantifiering gör den mer fördelaktig än konventionell qPCR13,14,15. Det har använts i stor utsträckning som ett forsknings- och diagnostiskt verktyg för absolut kvantifiering av en gen av intresse16,17. Här beskriver vi det detaljerade dd-PCR-protokollet för circRNA-kvantifiering vid differentiering av mus C2C12-myorör och prolifererande mus C2C12-myoblaster med hjälp av divergerande primers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

RNA är känsligt för RNaser; Därför bör alla reagenser, instrument och arbetsytor vara RNase-fria och hanteras med försiktighet.

1. Avvikande primerdesign för circRNA (se figur 1)

  1. Hämta den mogna sekvensen från circRNA-annoteringsdata med BEDTools eller från UCSC-genomwebbläsaren genom att gå med i exon / intron-sekvensen som finns mellan backsplice-korsningskoordinaterna18,19.
  2. Förbered en PCR-mallsekvens med 200 nukleotider i längd genom att sammanfoga de sista 100 nukleotiderna av den totala circRNA-sekvenslängden till de första 100 nukleotiderna i circRNA-sekvensen10.
    OBS: Om circRNA-längden är mindre än 200 nukleotider, dela den sedan i två lika stora halvor och gå med i nukleotiderna från den sista halvan till början av första halvåret.
  3. Använd ovanstående mallsekvens för primerdesign genom att använda Primer3-webbverktyget och ställa in en PCR-produktlängd som sträcker sig från 120-180 nukleotider i längd20.
  4. Använd standardinställningarna för Primer3 för andra parametrar som Tm och primerlängd. Primersekvenserna för circBnc2 listas i tabell 1.
  5. Beställ de divergerande primersekvenserna för syntes från alla oligosyntetiserande företag.

2. RNA-isolering

OBS: Isolera totalt RNA från musens C2C12-celler med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit eller intern RNA-isoleringsmetod. Den interna RNA-isoleringsmetoden som används här har beskrivits tidigare21. De magnetiska kiseldioxidpärlorna framställs i labbet med hjälp av det tidigare publicerade protokollet22. Dessa magnetiska pärlor kan också anskaffas från olika leverantörer.

  1. Ta en 10 cm skål som innehåller cirka 5 x 106 prolifererande C2C12 myoblastceller och en 4-dagars differentierad C2C12 myotube för RNA-isolering.
  2. Tvätta cellerna med 10 ml 1x PBS tre gånger och kassera PBS med en pipett.
  3. Skrapa cellerna i 1 ml 1x PBS med en cellskrapa, centrifugera dem vid 4 ° C i 5 minuter vid 750 x g och kassera PBS med en pipett.
  4. Tillsätt 1 ml RNA-isoleringsreagens (RIR) och lysera cellerna genom kraftig pipettering21.
  5. Tillsätt 200 μl (1/5 av volymen RIR) kloroform och virvel i 15 s. Centrifugera röret vid 4 °C i 10 minuter vid 12 000 x g.
  6. Ta 400 μl av det övre vattenskiktet, ladda det på en kiseldioxidkolonn och centrifugera i 1 min vid 12 000 x g vid rumstemperatur. Ta genomströmningen till ett nytt rör och tillsätt 600 μl 100% etanol.
  7. Tillsätt 20 μl magnetiska kiseldioxidpärlor och placera röret på en termomixer inställd på 25 °C och 1 200 rpm i 5 minuter.
    OBS: Pärlvolymen kan ökas eller minskas beroende på de ursprungliga cellnumren som tas för lys. Magnetiska kiseldioxidpärlor kan anskaffas från kommersiella leverantörer.
  8. Placera röret på ett magnetiskt stativ i 30 s eller tills lösningen blir klar. Kassera supernatanten försiktigt med en pipett.
  9. Återsuspendera de magnetiska kiseldioxidpärlorna i en tvättbuffert på 500 μl som innehåller 90 % etanol. Placera röret på magnetstativet i 30 s. Rotera röret två gånger på magnetstativet för att tvätta pärlorna. Låt pärlorna sätta sig mot magneten och kasta bufferten med en pipett.
  10. Upprepa steg 2.9 två gånger. Efter tvätten, snurra röret kort och placera det tillbaka på magnetstativet i 30 s. Kassera den återstående tvättbufferten. Lufttorka röret vid 50 °C i 3 min på en termomixer och håll locket öppet.
  11. Tillsätt 20 μl nukleasfritt vatten och återsuspendera pärlorna.
    OBS: RNA-elueringsvolymen kan minskas ner till 10 μL för att skala upp RNA-koncentrationen.
  12. Placera rören i 2-3 min vid rumstemperatur. Placera tillbaka röret på magnetstativet och låt det sitta i 30 s. Samla det upplösta RNA i ett nytt rör för kvantitets- och kvalitetsbedömning med hjälp av en spektrofotometer.
    OBS: RNA kan förvaras vid −20 °C eller −80 °C för långvarig lagring. För att få ett optimalt resultat rekommenderas att du fortsätter med cDNA-syntessteget nästa dag.

3. cDNA-syntes

  1. Mät RNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer och ta 1 μg RNA för cDNA-syntes.
  2. Blanda 1 μg totalt RNA med 1 μL dNTP-blandning (10 mM vardera av dATP, dTTP, dGTP och dCTP), 4 μL 5x omvänd transkriptas (RT) buffert, 2 μL 10x RT slumpmässig primer, 0,25 μL omvänd transkriptasenzym (200 U / μL) och 0,5 μL RNas-hämmare (40 U / μL) och fyll upp volymen upp till 20 μL med nukleasfritt vatten.
    OBS: Den omvända transkriptasenzymvolymen kan ändras beroende på den initiala RNA-koncentrationen som tas för cDNA-syntes.
  3. Tryck på röret för att blanda reaktionen och snurra kort. Placera röret vid 25 °C i 10 minuter följt av vid 50 °C i 1 timme.
  4. För att inaktivera enzymet, placera röret vid 85 °C i 5 minuter.
  5. Iskyl röret i 2 minuter och tillsätt 480 μl nukleasfritt vatten till röret för att göra cDNA-koncentrationen till 2 ng/μl.
    OBS: cDNA kan lagras vid -20 °C eller användas omedelbart för dd-PCR-analys.

4. Arbetsflöde för digital dropp-PCR (dd-PCR)

OBS: Arbetsflödet för dd-PCR involverar flera steg, från provberedning, följt av droppgenerering, PCR-förstärkning, droppräkning och dataanalys. Varje steg är avgörande för korrekt datagenerering eftersom dd-PCR involverar absolut kvantifiering av produkter och inte behöver någon standardkurva. Därför har vart och ett av de olika stegen i dd-PCR beskrivits nedan.

  1. Framställning av dd-PCR-reaktionen.
    1. Ställ in PCR-reaktionen på 22 μL i 0,2 ml PCR-rör eller remsor tillsammans med ett negativt kontrollrör och NTC-rör (icke-mallkontroll).
      OBS: Varje olika divergerande primerpar för detektion av olika circRNA måste ha en NTC-reaktion tillsammans med testprover.
    2. Tillsätt 11 μL dd-PCR master-mix (t.ex. EvaGreen Supermix) och 11 μl nukleasfritt vatten för att ställa in det negativa kontrollreaktionsröret.
      OBS: Tina dd-PCR-master-mixen vid rumstemperatur följt av en kort virvel för att göra en homogen blandning. Använd samma nukleasfria vatten för att ställa in det negativa kontrollreaktionsröret och NTC-rören som användes för att späda ut cDNA.
    3. Tillsätt 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-specifik framåt- och bakåtprimerblandning med en koncentration på 1 μM och 5,5 μL nukleasfritt vatten för att ställa in NTC-reaktionsrören.
      OBS: Späd de framåt- och bakåtriktade cirkulära RNA-specifika divergerande primersna med 100 μM stam och blanda för att förbereda en 1 μM arbetskoncentration av framåt- och bakåtcirklerRNA-primerblandning; således är den slutliga primerkoncentrationen 250 nM i 22 μl-reaktionen.
    4. Tillsätt 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-specifik framåt- och bakåtprimerblandning med 1 μM-koncentration och 5,5 μL cDNA (2 ng/μL) för att ställa in provreaktionsrören.
    5. Vortex noggrant följt av kort centrifugering av alla reaktionsrör för att få en homogen reaktionsblandning i botten av rören.
  2. Droppgenerering.
    1. Överför 20 μl PCR-blandningen från 0,2 ml PCR-rör till droppgeneratorpatronens provbrunnar.
    2. Tillsätt 70 μl droppgenereringsolja till droppgeneratorpatronens oljebrunnar försiktigt med en flerkanalig pipett.
      OBS: Inkubera droppgenereringsoljan vid rumstemperatur i 15 minuter före användning.
    3. Täck droppgeneratorpatronen med gummipackningen och placera den i droppgeneratormaskinen för att få provoljedroppblandningen, genererad i patronens droppbrunnar.
  3. PCR-förstärkning.
    1. Överför 40 μl av provoljedroppblandningen från droppbrunnarna i droppgeneratorpatronen till en PCR-platta med 96 brunnar med hjälp av en flerkanalig pipett.
      OBS: Överför försiktigt provoljedroppblandningen medan du gör en vinkel mot brunnarna genom spetsarna på flerkanalspipetten för att undvika att dropparna bryts medan de överförs till dd-PCR 96-brunnsplattan.
    2. Försegla PCR-plattan med 96 brunnar med aluminiumfolieförseglaren, placera den i plattförseglarens maskinblock förvärmd vid 80 ° C och klicka på tätningen för att täta PCR-plattan.
    3. Placera nu plattan i dd-PCR termisk cykler och ställ in programmet som nämns i tabell 2 med locktemperaturen inställd på 105 ° C och en ramphastighet på 2 ° C / s.
  4. Droppräkning.
    1. När PCR är över, placera plattan på dd-PCR-droppräknaren med platthållaren i rätt läge för att räkna dropparna.
    2. Öppna droplet-analysprogramvaran och ställ in körningen genom att ge indata för exempelinformationen.
    3. Klicka på installationsalternativet. Klicka sedan på mallalternativet för att öppna en ny mall.
    4. Definiera varje brunn genom att sätta detaljerna i experimentet, såsom provnamn (cDNA används eller negativ kontroll eller NTC), målnamn (circRNA-primernamn) och typ (okänd), och experimenttyp som ABS (absolut kvantifiering) och Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) som används, etc.
    5. Slutligen spara mallen och starta körningen genom att klicka på köralternativet och välj räkna efter rad eller kolumnvis. Låt maskinen slutföra droppräkningen, vilket tar cirka 1 min/brunn.
    6. Klicka på knappen Analysera för att analysera data efter avslutad droppläsning.
    7. Klicka på 1D-amplitudknappen för att se de positiva och negativa dropparna
    8. För att separera de positiva dropparna från de negativa dropparna, sätt en gemensam tröskellinje för alla prover med samma mål.
      Anmärkning: Det totala antalet droppar i varje prov bör vara över 10 000 för att beaktas för absolut kvantifiering. NTC bör inte visa positiva droppantal. Närvaron av positiva droppar i NTC indikerar förorening av reagenserna eller förstärkning av primerdimererna. Det är svårt att ta reda på om de positiva dropparna har primerdimerer eller icke-specifika produkter i NTC. Det rekommenderas att kontrollera primers och undvika kontaminering av reagenserna som en allmän praxis för någon PCR inklusive dd-PCR.
    9. Klicka på Exportera för att exportera circRNA räknar data som en .csv fil. De exporterade data visar antalet circRNA som finns i varje prov.
    10. Beräkna manuellt antalet circRNA i varje prov per nanogram RNA genom att ta hänsyn till den totala mängden cDNA som används i varje reaktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det absoluta antalet circRNA i varje prov kan härledas från exporterade dd-PCR-data. Kvantitativ PCR-analys i realtid föreslog differentiellt uttryck av circBnc2 i de differentierade C2C12-myorören (data visas inte). Här ville vi kontrollera det absoluta kopieringsnumret för circBnc2 i prolifererande C2C12-myoblaster och myotubes. Eftersom uttrycket av circBnc2 jämförs under två förhållanden är det verkligen viktigt att bearbeta alla prover för RNA-isolering, cDNA-syntes och PCR samtidigt med samma reagens och procedur. För att utföra den absoluta kvantifieringen av circRNA med hjälp av dd-PCR-reaktionen bör en lika stor mängd initialt totalt RNA användas för cDNA-syntes för att beräkna det exakta antalet mål-RNA-molekyler per nanogram totalt RNA. Till exempel användes 1 μg totalt RNA för cDNA-syntes och späddes till 500 μL med nukleasfritt vatten för att få en slutlig koncentration på 2 ng/μL innan dd-PCR-analysen utfördes (figur 1).

Som visas i figur 2A användes cDNA från 10 ng RNA från prolifererande C2C12-myoblastceller (MB) och en 4-dagars differentierad myotube (MT) för att kontrollera skillnaden i uttryck av circBnc2 under dessa två tillstånd. Proverna bearbetades för att generera droppen och utföra PCR, följt av att räkna de positiva och negativa dropparna med hjälp av droppanalysprogramvaran enligt tillverkarens instruktioner (figur 2B). Eftersom primers kan förstärka icke-specifika produkter och bilda primerdimerer, bör NTC användas för alla primeruppsättningar. Helst bör NTC inte ha några positiva droppantal.

Som visas i figur 3A visade alla prover utom MT1 mer än 12 000 droppantal. Eftersom det totala antalet droppar var lågt i MT1 beaktades inte detta urval för slutlig dataanalys. Det låga totala antalet droppar kan bero på ett fel i droppgenerering, brott i dropparna under överföring till PCR-plattan eller pipetteringsproblem. Intressant nog fanns det en tydlig skillnad i uttrycksmönstret för circBnc2 i det 4-dagars differentierade myotube-tillståndet jämfört med myoblastcellerna. Analysen av circBnc2-överflöd i termer av kopieringsnummer indikerade att de tre replikaten av C2C12-myoblaster hade 76,8, 67 och 46 kopior / ng av RNA, medan de två myotubeproverna hade 558 och 610 kopior / ng RNA (figur 3B). Eftersom ett myotube-prov inte fungerade bra är det bättre att ha ett större antal biologiska replikat för att studera de statistiska skillnaderna i deras uttrycksmönster under de två förhållandena.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av den divergerande primerdesignen för PCR-förstärkning av circBnc2. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: dd-PCR-arbetsflödet för circRNA-kvantifiering. Det kompletta dd-PCR-arbetsflödet innehåller många steg: (A) RNA-isolering och cDNA-beredning från C2C12-myoblast och 4-dagars differentierade myotubeceller, PCR-blandningsberedning, (B) droppgenerering, PCR-förstärkning, droppräkning och dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Dataanalys med quantaSoft-programvara. (A) Dataanalys inkluderar identifiering av positiva och negativa droppar med hjälp av kvantifieringsprogramvaran. (B) Beräkning av antalet circRNA/ng av RNA i C2C12-myoblaster (MB) och myorör (MT). Data i stapeldiagrammet på panel B representerar medelvärdet ± STDEV för två till tre biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Primer namn Sekvens
circBnc2 Framåt primer AAAGAGATGCACGTCTGCAC
circBnc2 Omvänd primer AACCGCAGAAACTGCTGAAG

Tabell 1: Divergerande primersekvenser som används för förstärkning av circBnc2.

Steg Temperatur (°C) Tid Antal cykler Ramp hastighet
Aktivering av enzym 95 10 minuter 1 ~ 2 °C/s
Denaturering 94 30 sekunder 40 ~ 2 °C/s
Glödgning/förlängning 60 1 minuter 40 ~ 2 °C/s
Signalstabilisering 4 5 minuter 1 ~ 2 °C/s
Signalstabilisering 90 5 minuter 1 ~ 2 °C/s

Tabell 2: Villkor för PCR-förstärkning av circBnc2 på en termisk cykler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CircRNA-forskningen har vuxit under det senaste decenniet med upptäckten av sekvenseringsteknik med hög genomströmning. Som ett resultat har det ansetts vara en potentiell molekyl för framtida RNA-terapier. Dessutom är det känt att fungera som en biomarkör vid flera sjukdomar, inklusive cancer och hjärt-kärlsjukdomar 4,8. Identifieringen av circRNA är dock knepig på grund av dess låga överflöd och den har bara en specifik backsplice-korsningssekvens som skiljer den från föräldra-mRNA9. RT-PCR med divergerande primers har varit guldstandardtekniken för att validera circRNA sedan upptäckten 9,10. Även om flera molekylära metoder har utvecklats för circRNA-kvantifiering är det utmanande att mäta circRNA-uttryck exakt på grund av deras låga överflöd. Eftersom dd-PCR kan förstärka mycket lågrikliga RNA / DNA-molekyler från ett givet prov14, är det en av de bästa metoderna för exakt kvantifiering av circRNA.

dd-PCR är en slutpunktsanalys som ger absolut kvantifiering av målgenen15. Till skillnad från konventionell qPCR är det tidskrävande, tråkigt och dyrt, vilket gör det mindre accepterat jämfört med PCR i realtid även ett decennium efter upptäckten15. Det erbjuder dock flera fördelar jämfört med den allmänt använda qPCR för att studera genuttrycksförändringar13,23. För det första kan dd-PCR ge det exakta antalet kopior av DNA som finns i ett givet prov. För det andra förändrar en förändring i hushållningsgenuttryck beräkningen av målgenpopulationen i ett givet prov. Detta kan undvikas i dd-PCR, som inte är beroende av standardkurvor eller hushållningsgener för att kvantifiera mål-DNA15. För det tredje, eftersom PCR-reaktionen sker i små fack, ger den högre flexibilitet mot närvaron av icke-specifika hämmare eller bakgrunds-DNA, vilket gör det till en mer exakt metod för att kvantifiera målgener23,24.

Vi använde dd-PCR-tekniken för att kvantifiera circBnc2-uttryck i prolifererande C2C12-myoblaster och differentierade myotubes med hjälp av divergerande primers. Specifik circRNA-förstärkning med divergerande primerpar utan primer-dimers måste dock kontrolleras i vanlig PCR innan dd-PCR utförs. Dessutom måste dd-PCR-protokollet följas noggrant för noggrann mätning av circRNA-uttryck. Arbetsflödet som presenteras här kan enkelt anpassas för kvantifiering av alla circRNA av intresse. Nya studier har belyst de diagnostiska värdena för circRNA som finns i vävnad och kroppsvätskor för detektion av sjukdomar8. Tillsammans kommer denna metod att vara ett viktigt verktyg i forsknings- och diagnostikindustrin och kommer att påskynda circRNA-forskningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av intramural finansiering från Institute of Life Sciences, DBT-forskningsbidraget (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) och Wellcome Trust/DBT India Alliance Fellowship [IA/I/18/2/504017] som tilldelades Amaresh C. Panda. Vi tackar andra labbmedlemmar för korrekturläsning av artikeln.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentifuge tube Tarson 500010
0.2 ml tube strips with cap Tarson 610020, 510073
Filter Tips Tarson 528104
DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific 10977023
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P4417
Cell scrapper HiMedia TCP223
Chloroform SRL 96764
DNA diluent HiMedia MB228
Random primers Thermo Fisher Scientific 48190011
dNTP set Thermo Fisher Scientific R0181
Murine RNase inhibitor NEB M0314S
Maxima reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix Bio-Rad 1864033
Droplet generation oil for Evagreen Bio-Rad 1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio-Rad 1814040
DG8 Cartridges and Gaskets Bio-Rad 1864007
DG8 Cartridge holder Bio-Rad 1863051
QX200 Droplet Generator Bio-Rad 1864002
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad 12001925
PX1 PCR Plate Sealer Bio-Rad 1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module Bio-Rad 1851197
QX200 Droplet Reader Bio-Rad 1864003
Quantasoft Software Bio-Rad 1864011
Silica column Umbrella Life Science 38220090
UCSC Genome Browser https://genome.ucsc.edu/
Primer 3 https://primer3.ut.ee/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
  2. Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
  3. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  4. Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
  5. Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
  6. Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
  7. Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).
  8. Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
  9. Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
  10. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
  11. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  12. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  13. Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
  14. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
  15. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  16. Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
  17. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  18. Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  21. Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
  22. Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
  23. Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
  24. Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).

Tags

Biologi utgåva 187 cirkulärt RNA RT-PCR divergerande primers absolut kvantifiering
Kvantifiering av cirkulära RNA med hjälp av digital dropp-PCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Das, A., Das, D., Panda, A. C.… More

Das, A., Das, D., Panda, A. C. Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR. J. Vis. Exp. (187), e64464, doi:10.3791/64464 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter