Summary
Este trabajo tiene como objetivo evaluar y revisar el procedimiento de bioensayo de letalidad de Artemia salina , también identificado como ensayo de letalidad de camarones en salmuera. Este método simple y barato proporciona información sobre la toxicidad general (considerada como una evaluación preliminar de la toxicidad) de las muestras, es decir, los productos naturales.
Abstract
Los productos naturales se han utilizado desde la antigüedad para producir medicamentos. Hoy en día, hay un montón de fármacos quimioterapéuticos obtenidos de fuentes naturales y utilizados contra una gran cantidad de enfermedades. Desafortunadamente, la mayoría de estos compuestos a menudo muestran toxicidad sistémica y efectos adversos. Con el fin de evaluar mejor la tolerabilidad de muestras potencialmente bioactivas seleccionadas, el camarón de salmuera (Artemia salina) se utiliza generalmente como modelo en estudios de letalidad. La prueba de A. salina se basa en la capacidad de los compuestos bioactivos estudiados para matar a los microcrustáceos en su etapa larvaria (nauplios). Este método representa un punto de partida conveniente para los estudios de citotoxicidad, así como para el cribado de toxicidad general de productos sintéticos, semisintéticos y naturales. Puede considerarse un ensayo simple, rápido y de bajo costo, en comparación con muchos otros ensayos (células in vitro o cepas de levadura, pez cebra, roedores) generalmente adecuados para los fines antes mencionados; Además, se puede realizar fácilmente incluso sin ningún entrenamiento específico. En general, el ensayo de A. salina representa una herramienta útil para la evaluación preliminar de la toxicidad de compuestos seleccionados y el fraccionamiento bioguiado de extractos de productos naturales.
Introduction
Los productos naturales de plantas, animales o microorganismos han sido un área de creciente interés a lo largo de los años en el desarrollo de nuevas moléculas bioactivas debido a su variada gama de actividades biológicas y farmacológicas1. Sin embargo, los efectos secundarios asociados, la resistencia a los medicamentos o la especificidad inadecuada de los agentes, especialmente cuando se usan como medicamentos contra el cáncer, representan los principales factores que pueden conducir a un tratamiento ineficaz 1,2.
En las últimas décadas, se han descubierto varios agentes citotóxicos derivados de plantas, algunos de ellos utilizados como agentes anticancerígenos 1,2,3. En este contexto, el paclitaxel es reportado como uno de los fármacos quimioterapéuticosde origen natural más conocidos y activos 3,4. Actualmente, se estima que más del 35% de todos los medicamentos en el mercado se derivan o están inspirados en productos naturales5. La alta toxicidad potencial de estos compuestos requiere consideración durante todas las fases de estudio, ya que diferentes tipos de contaminantes o incluso componentes metabólicos de la propia planta pueden causar efectos tóxicos. Por esta razón, los perfiles farmacológicos y toxicológicos deben realizarse en la fase preliminar, para evaluar la actividad biológica y la seguridad de nuevos tratamientos potenciales a base de plantas. Para evaluar la toxicidad de nuevas muestras bioactivas, los animales invertebrados pueden considerarse como los mejores modelos para estudiar. Exigen requisitos éticos mínimos y permiten ensayos preliminares in vitro, para priorizar los productos más prometedores para la próxima ronda de ensayos en vertebrados 1,6.
Comúnmente conocido como camarón de salmuera, A. salina es un pequeño invertebrado halófilo perteneciente al género Artemia (familia Artemiidae, orden Anostraca, subfilo Crustacea; Figura 1). En los ecosistemas salinos marinos y acuáticos, los camarones de salmuera desempeñan un papel nutricional importante, ya que se alimentan de microalgas y son constituyentes del zooplancton utilizado para alimentar a los peces. Además, sus larvas (conocidas como nauplios) son ampliamente utilizadas en la evaluación de la toxicidad general durante los estudios preliminares 1,3,7.
Artemia spp. son ampliamente utilizadas en estudios de letalidad y también son un punto de partida conveniente para las evaluaciones de toxicidad, al rastrear la toxicidad de compuestos potencialmente bioactivos en función de su capacidad para matar nauplios cultivados en el laboratorio 1,8. Por esta razón, el uso de A. salina ganó atracción en los estudios de toxicidad general, ya que es un método muy eficiente y fácil de usar, en comparación con otras pruebas en modelos animales9.
Debido a su anatomía simple, tamaño pequeño y ciclo de vida corto, se puede estudiar una gran cantidad de invertebrados en un solo experimento. Como tales, combinan la racionalidad genética y la compatibilidad de bajo costo con exámenes a gran escala1. En este contexto, el uso de camarones de salmuera en un ensayo de toxicidad general muestra varias ventajas, como el rápido crecimiento (se necesitan 28-72 h desde la eclosión hasta los primeros resultados), la rentabilidad y la larga vida útil de los huevos comerciales, que se pueden usar durante todo el año 3,10. Por otro lado, dado que los invertebrados tienen un sistema de órganos primitivo y carecen de un sistema inmune adaptativo, no representan un modelo perfecto y confiable para las células humanas1.
Sin embargo, proporciona un método de evaluación preliminar para la toxicidad general de las muestras seleccionadas. Dado que es ampliamente utilizado como un ensayo de letalidad, puede proporcionar indicaciones provisionales sobre los efectos tóxicos de los posibles agentes anticancerígenos. A menudo también se utiliza para obtener información sobre la toxicidad general de los compuestos dotados de cualquier otra actividad biológica para la cual es esencial mostrar la tasa de mortalidad más baja posible entre los camarones Artemia .
En un estudio en curso de nuestro grupo, diferentes extractos de especies de Plectranthus mostraron actividades antioxidantes y antimicrobianas (resultados no publicados). Paralelamente, se obtuvieron compuestos aislados mediante purificación de los extractos y luego se modificaron químicamente. Los extractos, compuestos puros y derivados semisintéticos se probaron en términos de toxicidad general. En este contexto, el presente trabajo tiene como objetivo dar una visión general del uso del bioensayo de letalidad de Artemia para la evaluación de la toxicidad general y la actividad citotóxica potencial de extractos bioactivos y compuestos aislados de diferentes plantas del género Plectranthus11.
Figura 1: Artemia salina bajo el microscopio. Nauplios recién nacidos de A. salina vistos bajo el microscopio (aumento 12x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
1. Preparación del equipo
- Adquirir equipos de incubación disponibles comercialmente. Seleccione un lugar adecuado para instalar el equipo de eclosión (Figura 2A). Coloque el recipiente en forma de embudo en el soporte negro (incluido en el conjunto) y gire el embudo en una dirección adecuada para ver la marca de nivel y el grifo.
- Para hacer equipos de migración hechos a mano, corte la parte superior de dos botellas de plástico de 0,5 L (5,8 cm de diámetro) para obtener una altura final de 12 cm. Cree un orificio de 1,5 cm de diámetro en un lado a 7 cm de la parte inferior de cada botella e inserte un tubo de goma de 13 cm (1,3 cm exterior y 0,9 cm de diámetro interior) entre las dos aberturas. Sellar las aberturas con pegamento caliente (Figura 2B) y dejar secar durante 15 min; Coloque las botellas sobre una superficie plana y llénelas con agua para verificar que no haya fugas.
2. Preparación de solución salina artificial
- En un vaso de precipitados de vidrio, prepare una solución de sal artificial (sal de camarones en salmuera) a una concentración de 35 g / L. Para hacer esto, agregue 28 g de sal a 800 ml de agua del grifo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar con una varilla de agitación hasta que toda la sal se disuelva completamente.
NOTA: Ajuste el volumen de la solución salina preparada de acuerdo con el tamaño de los recipientes disponibles.
3. Preparación de la muestra
- Preparar todas las muestras en un tubo de microcentrífuga disolviendo una cantidad adecuada de extractos (extractos de Plectranthus , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; y Pe- P. ecklonii) o compuestos 1-5 (dos compuestos naturales [1 y 2] obtenidos de Plectranthus spp. y tres derivados semisintéticos [3, 4, 5]; Figura 3) en dimetilsulfóxido (DMSO)12, para obtener una concentración final de 10 mg/ml (si la muestra es soluble en agua, no es necesario el uso de DMSO).
- Diluir 10 μL de cada muestra (y DMSO para el control negativo) en un nuevo tubo de microcentrífuga utilizando 990 μL de solución salina artificial preparada en la etapa 2.1, para obtener una concentración final de 0,1 mg/ml.
- Bajo una campana extractora, en un erlenmeyer, preparar una solución de dicromato potásico (K 2 Cr2O7)en agua destilada a una concentración de 1 mg/ml13,14,15.
4. Bioensayo de letalidad de camarones de salmuera
NOTA: Este ensayo se desarrolla a partir de los trabajos de varios autores con modificaciones 1,16,17,18,19.
- Llene el recipiente de incubación con el medio preparado en el paso 2.1 hasta la marca de nivel (500 ml) (figura 2C).
- Coloque una cucharada (aproximadamente 0,75 g) de quistes de camarones de salmuera en la solución salina y luego cierre el recipiente. Coloque una lámpara (lámpara de mesa, 40 W, 230 V, 50 Hz, con una bombilla LED de 8 W, 4.000 K, 830 lm) que apunte directamente hacia el equipo (Figura 2A) y enciéndalo.
- Conecte el sistema de suministro de aire (salida de 3 W, 50 Hz, 230 V) al conector colocado en la parte superior del equipo y encienda la bomba.
- Mantener la temperatura ambiente a 25 ± 3 °C. Los quistes de camarones de salmuera eclosionan en la solución salina artificial, bajo aireación vigorosa, iluminación continua y temperatura estable, después de 24 h a 48 h.
NOTA: Alternativamente, se puede utilizar una incubadora vertical. - Una vez que los huevos hayan eclosionado, apague la bomba de aire y espere hasta que los nauplios (que se mueven hacia la parte inferior del embudo) se separen de las cajas de huevos vacías (flotando en la parte superior).
- Para separar los huevos no eclosionados de los nauplios vivos, abra el grifo de salida en la parte inferior y descargue el contenido del embudo en uno de los contenedores del contenedor del equipo de migración hecho a mano (descrito en el paso 1.2). Asegúrese de que la solución que contiene los nauplios y los huevos residuales no eclosionados esté por debajo del nivel del tubo. En el segundo recipiente, añadir la solución salina residual del paso 2.1 por encima de la altura del tubo.
- Cubra el recipiente con los nauplios y los huevos residuales no eclosionados con papel de aluminio. Coloque la lámpara en el segundo recipiente con solo la solución salina. Los camarones de salmuera serán atraídos por la luz y migrarán de un contenedor a otro (contenedor de cosecha), lo que lleva a una separación eficiente entre los huevos (sedimentados lentamente hasta el fondo) y Artemia viva.
- A continuación, coloque el equipo en la incubadora en las mismas condiciones utilizadas en el paso 4.4 durante 4 h (Figura 2E). Del recipiente de recolección, recoger 900 μL de solución salina que contiene de 10 a 15 nauplios. Coloque la solución salina con nauplios en cada pocillo de una placa de 24 pocillos (Figura 2F); Todas las muestras se analizan en cuadruplicados.
- Añadir 100 μL cada uno del control negativo (DMSO), el control positivo (K 2Cr2O7, dicromato de potasio), la solución salina artificial y cada una de las muestras al pocillo respectivo (Figura 2F)13,14.
NOTA: Las muestras en cada pocillo estarán a una concentración de 0.01 mg/mL. La concentración final del control positivo en solución salina será de 0,1 mg/ml, para asegurarse de que todos los nauplios del pozo estén expuestos al efecto tóxico del dicromato de potasio y mueran. La solución salina artificial actuará como en blanco. - Incubar la placa a 25 ± 3 °C bajo iluminación durante 24 h (Figura 2G). Después de 24 h, registrar el número de larvas muertas (nauplios no móviles durante 5 s) en cada pocillo bajo un microscopio binocular (12x)20 (Figura 2H). Alternativamente, use una lente de mano.
- Agregue 100 μL de solución de dicromato de potasio, para inducir la muerte de las larvas vivas restantes, y espere 6 h. Cuente el total de larvas muertas en cada pocillo bajo un microscopio. Determine la tasa de mortalidad de acuerdo con la siguiente ecuación.
- Realizar todo el ensayo por triplicado. Calcule las desviaciones estándar (DE) y exprese los resultados como la media de tres experimentos independientes, cada uno con cuadruplicados internos (n = 12), ± DE. Como lo mencionaron Meyer et al., considere tóxicos los extractos crudos y compuestos puros con LC50< 1,000 μg / ml; Además, tenga en cuenta que la tasa de mortalidad del camarón en salmuera es proporcional a la concentración de las muestras analizadas21.
Figura 2: Método de bioensayo de letalidad de Artemia salina. (A) Equipo disponible comercialmente empleado para la incubación de quistes de camarón de salmuera; B) Equipo de migración hecho a mano; (C) Recipiente para incubar lleno de solución salina; D) Recolección de huevos y nauplios no eclosionados; (E) Equipo hecho a mano en la incubadora durante la etapa de migración. El recipiente lejos de la lámpara debe cubrirse con papel de aluminio; Sin embargo, para una mejor vista de la instalación del conjunto aquí se eliminó; (F) Recolección de Artemia en pozos antes de realizar el ensayo. Los compuestos deben colocarse como se muestra: - se refiere al control negativo (DMSO), + al control positivo (K 2 Cr2O7), sal a la solución salina artificial, y 1 a 3 a las muestras a probar (en este caso compuestos 1-3); G) Incubación de la placa de 24 pocillos que contiene Artemia y las muestras seleccionadas; (H) Recuento de artemia bajo el microscopio binocular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estructuras de compuestos seleccionados. Estructura de los compuestos 1-2, extraídos de especies de Plectranthus , y compuestos 3-5, obtenidos por semisíntesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
La toxicidad general de algunos productos naturales recientemente estudiados por nuestro grupo se evaluó a través del bioensayo de letalidad de camarones en salmuera. Cuatro extractos (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; y Pe- P. ecklonii) del género Plectranthus , conocidos por su actividad antioxidante (resultados no publicados), fueron probados. Adicionalmente, dos compuestos naturales (1 y 2) obtenidos de Plectranthus spp., y tres derivados semisintéticos (3, 4, 5; Figura 3), todos descritos en otro trabajo3, también fueron investigados. En este documento, se informa su evaluación preliminar en términos de actividad citotóxica potencial.
Todos los extractos analizados mostraron resultados muy alentadores, con tasas de mortalidad muy bajas, comparables a las registradas para el blanco (solución salina) y el control negativo (DMSO; Figura 4). Por el contrario, entre los compuestos puros 1-5, sólo la derivada 5 mostró una baja tasa de mortalidad (2,30% a una concentración de 100 ppm) sin toxicidad general (Figura 5).
Figura 4: Letalidad de extractos sobre Artemia salina. Tasa de mortalidad de A. salina (%) después de 24 h de exposición a cuatro extractos metanólicos de Plectranthus spp., a 0,1 mg/ml (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Todos los extractos fueron aceptables en términos de toxicidad general utilizando este ensayo. La sal corresponde a la solución salina (en blanco); K2 Cr2O7 se utilizó como control positivo y DMSO como control negativo. Los resultados se expresaron como la media de tres experimentos independientes, cada uno con cuadruplicados internos (n = 12) ± DE. Las comparaciones se realizaron dentro de los grupos mediante el análisis de varianza, utilizando el ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Dunnett. Las diferencias significativas entre los grupos control y experimental se evaluaron utilizando un software comercial de análisis estadístico. Se consideró un nivel de probabilidad p < 0,01 para indicar significación estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Letalidad de compuestos sobre Artemia salina. Tasa de mortalidad de A. salina (%) después de 24 h de exposición a cinco compuestos puros a 0,1 mg/ml (1 y 2 son productos naturales y 3-5 son derivados preparados a partir de 1 y 2). Es evidente que sólo 5 muestra una toxicidad muy limitada utilizando este ensayo. La sal corresponde a la solución salina (en blanco); K2 Cr2O7 se utilizó como control positivo y DMSO como control negativo. Los resultados se expresaron como la media de tres experimentos independientes, cada uno con cuadruplicados internos (n = 12) ± DE. Las comparaciones se realizaron dentro de los grupos mediante el análisis de varianza, utilizando el ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Dunnett. Las diferencias significativas entre los grupos control y experimental se evaluaron utilizando un software comercial de análisis estadístico. Se consideró un nivel de probabilidad p < 0,01 para indicar significación estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los productos naturales 1 y 2 mostraron letalidad moderada (36,68% y 30,95% a 100 ppm, respectivamente), mientras que los derivados semisintéticos 3 y 4, obtenidos de 1 y 2, respectivamente, fueron más tóxicos que el andamio original (64,02% y 36,64% a 100 ppm, respectivamente; Figura 5).
Los datos generales sugirieron que todos los extractos probados, conocidos por su actividad antioxidante y que no muestran toxicidad general, pueden considerarse candidatos para estudios adicionales de actividad in vitro y toxicidad en líneas celulares seleccionadas. Si también se demuestra la ausencia de toxicidad en modelos cutáneos, se puede llevar a cabo el desarrollo de nuevos productos bioactivos para aplicación cutánea. Por otro lado, los efectos tóxicos observados para los compuestos 1-4 podrían hacerlos candidatos adecuados para evaluaciones adicionales como agentes anticancerígenos.
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Discussion
Durante los últimos años, la comunidad científica ha aumentado su atención hacia modelos alternativos para el cribado de toxicidad21. Además del bioensayo de letalidad de A. salina, generalmente se realizan otras metodologías para la evaluación de la tolerabilidad de la muestra e incluyen bioensayos de vertebrados (como roedores), invertebrados (como el pez cebra), métodos in vitro utilizando cepas o células de levadura, y métodos in silico 22,23,24,25 . Todos estos métodos tienen claras ventajas y desventajas, en consideración del dinero y el tiempo gastados, la reproducibilidad de los resultados y el tipo de muestra a analizar. Por ejemplo, los enfoques in silico representan una metodología estandarizada de bajo costo, que requiere un equipo mínimo. Sin embargo, cuando tales estudios se centran en un solo objetivo, se obtienen resultados de mala calidad, lo que hace que esta alternativa esté fuera del alcance de los exámenes preliminares, como presentamos en este estudio25,26. Cuando se trata de microorganismos, Saccharomyces cerevisiae es considerado uno de los modelos más utilizados para la evaluación de compuestos tóxicos23. De hecho, el uso de levadura in vitro es generalmente rápido y fácil de llevar a cabo; Sin embargo, puede ser costoso, ya que requiere productos y equipos químicos específicos, y muestra baja sensibilidad a dosis mínimas de compuestos citotóxicos27. En un enfoque alternativo, se pueden emplear células humanas, de una manera rápida, simple y económica. Aun así, estos no pueden representar un organismo completo; Así, las interacciones entre diferentes tipos celulares y las perturbaciones sistémicas que tienen lugar en condiciones fisiológicas no se tienen debidamente en cuenta25,26. Por otro lado, los ensayos in vivo tienen la gran ventaja de tener en cuenta todo el organismo, pero los modelos animales (como los roedores) requieren más tiempo para la ejecución del ensayo, son más caros e implican consideraciones éticas complejas25. Por el contrario, los ensayos in vivo que emplean organismos acuáticos para la detección de toxicidad son generalmente bien aceptados, considerando también que el uso de invertebrados marinos sufre menos preocupaciones éticas, y la metodología es fácil de realizar, rápida y barata21,24. En este contexto, el uso del pez cebra para el estudio de la toxicidad general a menudo representa la primera opción en el campo. De hecho, en comparación con otras pruebas con animales, puede considerarse una opción de bajo costo, ya que el pez cebra se desarrolla rápidamente y alcanza la etapa larvaria temprana alrededor de 72 h a 13 días después de la fertilización21,28. Sin embargo, el mantenimiento de un pez cebra requiere operadores bien entrenados y condiciones específicas, como una pecera con un sistema de circulación, capaz de airear y filtrar el agua del sistema, para mantener la calidad general; además, son necesarias varias tapas y tapas de drenaje, ya que el pez cebra puede saltar, así como condiciones de iluminación específicas (14 h de luz, 10 h de oscuridad), y los niveles de pH deben verificarse diariamente, entre otros29,30. En conjunto, estas consideraciones hacen que los modelos de pez cebra consuman más tiempo y sean más costosos que el modelo de Artemia reportado aquí, ya que estos microcrustáceos son más fáciles de manejar y viables para el cultivo en grandes poblaciones utilizando métodos de laboratorio. Esto hace que A. salina sea sin duda una de las herramientas de cribado más empleadas, utilizada principalmente para probar la toxicidad general de diferentes muestras, como medicamentos y extractos de plantas medicinales1.
En el protocolo, los nauplios de A. salina se han criado, recolectado e incubado con muestras adecuadas durante 24 h, para estimar la tasa de mortalidad por nauplios inducida por cada muestra. En el primer paso, la eclosión de huevos se lleva a cabo en un recipiente de cría en forma de embudo disponible comercialmente, en el que se introdujo un burbujeo vigoroso (Figura 2A). Esta aireación forzada es necesaria ya que permite que la eclosión de camarones en salmuera ocurra con el mayor éxito posible. La eclosión ocurre alrededor de las 24 h a 25 ± 3 °C, mientras que hasta 48 h podría ser necesaria a temperaturas más bajas. Una vez que los huevos eclosionan, la bomba se apaga para permitir que las cajas de huevos vacías floten en la parte superior, mientras que los nauplios y los huevos no eclosionados se recogen fácilmente abriendo el grifo del embudo en la parte inferior. Durante nuestros experimentos, nunca se logró la eclosión completa de los huevos, con la consiguiente presencia de nauplios y huevos no maduros en la solución recolectada. Por esta razón, para separar eficientemente las dos formas de Artemia, se prepara un equipo hecho a mano para la migración de camarones en salmuera (paso 1.2). Un recipiente se llena con los organismos cosechados y luego se cubre con papel de aluminio, mientras que el otro recipiente se expone a la luz directa de una lámpara. En estas condiciones, los huevos no eclosionados tienden a asentarse, mientras que los nauplios vivos son atraídos por la luz que golpea el contenedor adyacente, favoreciendo la migración de un lado a otro a través de la conexión del puente. Después de 4 h, casi todos los nauplios vivos están dentro del recipiente expuestos a la luz y listos para ser recogidos para la ejecución del ensayo. En esta etapa, porciones de la solución de agua salada, que contiene de diez a quince nauplios, se eliminan y se incuban con cada una de las muestras a analizar.
En este trabajo, se ha demostrado cómo el método es eficiente, económico y fácil de llevar a cabo. Sin embargo, algunos puntos críticos deben ser reconocidos al realizar este ensayo.
El ensayo generalmente se realiza con agua del grifo. Dependiendo de factores geográficos y físico-químicos, el agua del grifo exhibe una distribución de dureza diferente, lo que influye en la reproducibilidad del ensayo y, en particular, en la etapa de eclosión del huevo. Por la misma razón, el uso de agua de mar podría influir en la reproducibilidad de la prueba. La concentración variable de sal, la presencia de contaminantes, microplásticos y otros corpúsculos obligarían al operador a someterse a pasos adicionales, como filtraciones y otros tipos de purificación, que harían que el experimento fuera más complejo y menos fácil de manejar. Considerando todo, las condiciones óptimas deben establecerse en función de las características y la disponibilidad del agua del grifo, especialmente mediante una regulación cuidadosa de la cantidad de sal artificial agregada, que crea un ambiente adecuado y actúa como alimento para los nauplios, también.
Las amplias variaciones en las temperaturas pueden resultar en tasas de eclosión más bajas. Como consecuencia, se pudieron observar bajos niveles de Artemia viva, mezclada con un alto número de huevos sin eclosionar. Claramente, tales condiciones no son adecuadas para el desarrollo de ensayos confiables, por lo que se debe considerar una climatización controlada de la habitación o el uso de incubadoras verticales apropiadas.
Se requiere una aireación vigorosa de la solución dentro del recipiente de incubación. La presencia de burbujeo continuo favorece el contacto entre los huevos y acelera el proceso de eclosión.
La recolección de huevos no eclosionados y nauplios durante la cosecha puede influir fuertemente en la confiabilidad del ensayo. Esto se debe a la posibilidad de eclosión durante la incubación con las muestras. En este caso, no todos los nauplios habrán estado expuestos durante el mismo período de tiempo, con las consiguientes tasas de mortalidad erróneas. Como los huevos y los nauplios son demasiado pequeños para ser separados eficientemente, se necesitan tiempos de incubación más altos en el equipo de incubación o el uso del equipo de migración hecho a mano.
Cada pocillo debe contener 10-15 nauplios para la etapa de incubación, cuidadosamente contados mediante el uso de un microscopio binocular (aumento de 12x). La presencia de demasiados nauplios en el mismo pozo puede hacer que el conteo final sea difícil, o incluso erróneo, debido a la superposición. Por otro lado, pequeñas cantidades de camarones conducirían a resultados sin significación estadística.
Como es evidente, la mayoría de los problemas de este método están relacionados con las etapas de eclosión y crecimiento, donde se requiere más atención para evitar problemas de confiabilidad. Aun así, el método puede tolerar modificaciones, especialmente en relación con los puntos más críticos descritos anteriormente. Por supuesto, cuando se cambia uno de estos parámetros, podría ser necesario realizar varios intentos para optimizar el método original. Por ejemplo, cambiar la temperatura puede ayudar a controlar el tiempo total del ensayo: aumentar la temperatura hasta 28-29 °C también aumentará la velocidad de eclosión y acelerará todo el proceso.
Algunas limitaciones del bioensayo de A. salina también están relacionadas con la estabilidad de las muestras a las condiciones y el tiempo de prueba. El ensayo solo puede llevarse a cabo utilizando muestras estables a temperatura ambiente y bajo luz visible. Además, debe tenerse en cuenta que todo el procedimiento dura al menos 4 días, y si la tasa de eclosión es baja, el ensayo podría necesitar un día adicional para la etapa de eclosión.
En general, en este estudio, destacamos dos ejemplos de la aplicación de la evaluación general de toxicidad a través del método de A. salina. Se ha establecido toxicidad general para todas las muestras analizadas. Los extractos de plantas de Plectranthus y el compuesto 5 no mostraron toxicidad general, mientras que los compuestos 1-4 demostraron ser moderadamente o incluso altamente tóxicos en camarones de salmuera. En particular, el efecto negativo de los compuestos 1 y 2 sobre Artemia fue demostrado previamente por Sitarek y Matias por ensayos MTT y SRB/MTT, respectivamente31,32. Al mismo tiempo, los análogos benzoilados, compuestos 3 y 4, muestran valores de toxicidad más altos que sus precursores 1 y 2, destacando que la funcionalización del éster podría tener un papel importante en términos de citotoxicidad, como lo confirmó para el compuesto 4 en la línea celular de cáncer de NSCLC MDR humano por García et al.33. Sin embargo, se necesitan otros ensayos para confirmar que tal actividad citotóxica podría explotarse en la terapia del cáncer. Por otro lado, la derivada 5, junto con todos los extractos ensayados, no mostró toxicidad y aparece como el compuesto puro más prometedor de la serie. Sin embargo, se necesitan más estudios para evaluar la actividad biológica potencial para la aplicación cutánea.
Aquí demostramos cómo el uso del método basado en Artemia salina como herramienta de cribado podría permitir ahorrar tiempo y dinero, en comparación con otras metodologías conocidas. Representa una forma eficiente y ventajosa de ser explotada en contextos preliminares de toxicidad. Se puede utilizar en presencia de muestras diferentes y complejas, drogas sintéticas y semisintéticas, así como para el fraccionamiento bioguiado de extractos y muestras de productos naturales.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses, financieros o de otro tipo.
Acknowledgments
En memoria del profesor Amílcar Roberto.
Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) bajo los proyectos UIDB/04567/2020 y UIDP/04567/2020 atribuidos a CBIOS y beca de doctorado SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
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