Summary
هنا ، نصف نموذج الفأر التقويمي قبل السريري ل GBM ، الذي تم إنشاؤه عن طريق الحقن داخل الجمجمة للخلايا المشتقة من أورام نموذج الفئران المعدلة وراثيا. يعرض هذا النموذج السمات المميزة لمرض GBM البشري. بالنسبة للدراسات الانتقالية ، يتم تتبع ورم دماغ الفأر عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي وعلم أمراض الأنسجة.
Abstract
تعد نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) للورم الأرومي الدبقي البشري متعدد الأشكال (GBM) ضرورية لفهم تطور أورام الدماغ وتطورها. على عكس أورام xenograft ، في GEMs ، تنشأ الأورام في البيئة المكروية الأصلية في فأر مناعي. ومع ذلك ، فإن استخدام GBM GEMs في دراسات العلاج قبل السريري يمثل تحديا بسبب زمن انتقال الورم الطويل ، وعدم التجانس في تردد الأورام ، وتوقيت تطور الورم من الدرجة المتقدمة. الفئران المستحثة عن طريق الحقن التقويمي داخل الجمجمة هي أكثر قابلية للتتبع للدراسات قبل السريرية ، وتحتفظ بسمات أورام GEM. لقد أنشأنا نموذجا لورم الدماغ التقويمي مشتقا من نموذج GEM مع انحرافات Rb و Kras و p53 (TRP) ، والتي تطور أورام GBM التي تعرض بؤرا خطية للنخر بواسطة الخلايا الورمية ، والأوعية الدموية الكثيفة المماثلة ل GBM البشري. يتم حقن الخلايا المشتقة من أورام GEM GBM داخل الجمجمة في الفئران المتلقية من النوع البري والمتطابقة مع الإجهاد وتكاثر أورام الدرجة الرابعة ، وبالتالي تجاوز فترة كمون الورم الطويلة في الفئران GEM والسماح بإنشاء مجموعات كبيرة وقابلة للتكرار للدراسات قبل السريرية. يتم تلخيص السمات التكاثرية للغاية والغازية والأوعية الدموية لنموذج TRP GEM ل GBM في أورام تقويم العظام ، وتعكس علامات التشريح المرضي مجموعات فرعية GBM البشرية. تتم مراقبة نمو الورم عن طريق فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي التسلسلية. نظرا للطبيعة الغازية للأورام داخل الجمجمة في النماذج ذات الكفاءة المناعية ، فإن اتباع إجراء الحقن الموضح هنا بعناية أمر ضروري لمنع نمو الورم خارج الجمجمة.
Introduction
الورم الأرومي الدبقي (GBM ؛ الورم الدبقي من الدرجة الرابعة) هو ورم الدماغ الأكثر شيوعا والخبيث ، والعلاجات الحالية غير فعالة ، مما يؤدي إلى بقاء متوسط 15 شهرا1. تعد النماذج قبل السريرية الموثوقة والدقيقة التي تمثل مسارات الإشارات المعقدة المشاركة في نمو ورم الدماغ والتسبب في المرض ضرورية لتسريع التقدم في تقييم الأنظمة العلاجية الجديدة ل GBM. لا تعكس نماذج الفئران التي يتم فيها زرع خطوط خلايا ورم الدماغ البشري تحت الجلد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة البيئة المناعية الأصلية لأورام المخ ، ولا يمكن استخدامها لتقييم قدرة العلاجات على عبور الحاجز الدموي الدماغي2. من الناحية المثالية ، يجب أن تتكاثر نماذج الفئران قبل السريرية أيضا عن كثب في علم أمراض الأنسجة البشرية GBM ، بما في ذلك المستوى العالي من الغزو في الحمة المحيطة3. على الرغم من أن نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) تطور الأورام في سياق نظام مناعي سليم ، إلا أن خطط التكاثر المعقدة غالبا ما تكون مطلوبة ، وقد تتطور الأورام ببطء وبشكل غير متسق4. تعد نماذج الطعم الخيفي المشتقة من GEM أكثر ملاءمة للدراسات العلاجية قبل السريرية ، حيث تكون هناك حاجة إلى مجموعات كبيرة من الفئران الحاملة للورم في إطار زمني أقصر.
في تقرير سابق ، وصفنا نموذج فأر GBM التقويمي المشتق مباشرة من أورام GEM. يبدأ تكوين الورم في GEM من خلال الأحداث الجينية في مجموعات الخلايا (الخلايا النجمية في المقام الأول) التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، والتي تؤدي إلى التقدم إلى GBM. تحتوي هذه GEMs TRP على جين التحوير TgGZT121 (T) ، والذي يعبر عن T121 بعد التعرض لإعادة تجميع Cre التي يحركها GFAP. ينتج عن تعبير بروتين T121 قمع نشاط البروتين Rb (Rb1 و p107 و p103). يستهدف التعبير المشترك لجين التحوير Cre المدفوع ب GFAP (GFAP-CreERT2) التعبير للخلايا النجمية البالغة بعد تحريضه باستخدام عقار تاموكسيفين. تأوي فئران TRP أيضا Kras متحولة تعتمد على Cre (KrasG12D; R) أليل ، لتمثيل تنشيط مسار مستقبلات التيروزين كيناز ، وهي غير متجانسة الزيجوت لفقدان Pten (P) 5,6. الانحرافات الجينية المتزامنة في مستقبلات التيروزين كيناز (RTK) وشبكات PI3K و RB متورطة في 74٪ من التسبب في GBM7. لذلك ، يتم تمثيل مسارات الإشارات الأولية التي تم تغييرها في GBM البشري من خلال الطفرات المهندسة في الفئران TRP ، ولا سيما أورام GBM ، حيث يتم تنشيط أهداف المصب المشتركة ل RTKs5.
تم التحقق من صحة نموذج تقويم العظام الجيني المشتق من GEM كنموذج يلخص ميزات أورام الدماغ البشرية ، بما في ذلك الغزو ووجود المؤشرات الحيوية من النوع الفرعي ، لاستخدامه كمنصة لتقييم علاجات السرطان التي تستهدف المسارات الشاذة في GBM. تم استزراع الخلايا من الأورام التي تم حصادها من أدمغة TRP وإعادة زرعها في دماغ الفئران المتطابقة مع الإجهاد ، باستخدام معدات التوضيع التجسيمي للحقن داخل الجمجمة في القشرة. طور نموذج الفأر التقويمي قبل السريري هذا أوراما GBM كانت خلوية للغاية ، وغازية ، ومتعددة الأشكال مع معدل انقسام مرتفع ، وأظهرت بؤرا خطية للنخر بواسطة الخلايا الورمية والأوعية الدموية الكثيفة ، كما لوحظ بالنسبة ل GBM البشري. تم قياس حجم الورم ونموه بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي (MRI).
في هذا التقرير ، نصف التقنية المثلى للحقن داخل الجمجمة لخلايا GBM الأولية أو خطوط الخلايا في دماغ الفأر من النوع البري ، باستخدام أورام TRP كمثال. يمكن تكييف نفس البروتوكول للفئران التي تعاني من نقص المناعة وخطوط خلايا GBM الأخرى. يتم تقديم نصائح حاسمة لتجنب المزالق الشائعة ، مثل تحضير الخلايا دون المستوى الأمثل أو تسرب الخلايا في موقع الحقن ، ولاستخدام معدات التوضيع التجسيمي بشكل صحيح لضمان استنساخ النموذج وموثوقيته. لأغراض متعدية ، نقوم بالتحقق من صحة النموذج عن طريق الكشف بالرنين المغناطيسي عن نمو ورم المخ في الحيوانات الحية ، والتوصيف النسيجي ، وتقديم مثال على العلاج في الفئران الحاملة للورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة الموصوف هنا من قبل NCI في لجنة فريدريك لرعاية واستخدام الحيوان. تم اعتماد NCI-Frederick من قبل AAALAC International ويتبع سياسة خدمة الصحة العامة لرعاية واستخدام المختبر. تم توفير رعاية الحيوانات وفقا للإجراءات الموضحة في "دليل رعاية واستخدام المختبر (المجلس القومي للبحوث، 2011; مطبعة الأكاديميات الوطنية ، واشنطن العاصمة).
1. تحضير الخلايا للحقن
ملاحظة: تم عزل الخلايا الأولية لورم دماغ الفأر (MBRs) المستخدمة في هذا النموذج في الأصل من فئران TRP GEM التي يسببها عقار تاموكسيفين ، كما هو موضح في El Meskini et al.5. يمكن العثور على تفاصيل حول إعداد الخلية في هذا المرجع.
- نفذ الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية.
- زراعة خلايا ورم الدماغ الأولية في المختبر حتى تصل إلى مرحلة النمو الأسي.
- احصد الخلايا في 0.25٪ من التربسين ، وبمجرد فصلها ، قم بتخفيفها بوسط نمو لتعطيل التربسين.
- حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 × غرام وغسل مع وسائل الإعلام خالية من المصل. كرر مرة واحدة قبل العد.
- عد الخلايا يدويا أو باستخدام عداد خلايا آلي. أعد تعليق الخلايا في ميثيل سلولوز معقم بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) بالتركيز المطلوب ، بناء على حجم الحقن النهائي البالغ 2 ميكرولتر. قد يختلف تركيز الخلية المطلوب بناء على خط الخلية ونموذج ورم الدماغ. بالنسبة لخلايا GBM GEM TRP ، نقوم بحقن 2 ميكرولتر من محلول 25 × 106 خلايا / مل ، أو 50000 خلية.
2. سلالة الماوس
- تولد أو شراء سلالة الفئران المناسبة التي تتطابق مع خلفية سلالة خلايا ورم الدماغ. بالنسبة لخلايا TRP ، استخدم الفئران B6D2F1 / J البالغة من العمر 9 أسابيع (من تقاطع بين إناث C57BL / 6J [B6] وذكور DBA / 2J [D2]) كمتلقين للخلايا السرطانية.
3. إعداد المنطقة الجراحية
ملاحظة: يتم إجراء جميع الخطوات الجراحية باستخدام تقنية معقمة في بيئة نظيفة ومعقمة. يجب أن يرتدي الجراح الدعك ومعدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك القناع. يجب تعقيم الأدوات الجراحية بالحرارة قبل الاستخدام.
- ضع واقيات السطح تحت جهاز التجسيم وعلى سطح العمل.
- قم بتوصيل أنبوب الفينيل من آلة التخدير بمنفذ IN لمنصة التخدير الغازي لجهاز التجسيم ، وأنبوب آخر بمنفذ OUT.
- قم بتوصيل الشاشة الرقمية بمصدر طاقة وبالجهاز.
- قم بتوصيل وحدة تحكم micropump (الشكل 1A) بمصدر طاقة وقم بتوصيل المضخة الدقيقة (الشكل 1A) بذراع المعالج للجهاز (انظر أيضا تعليمات الشركة المصنعة).
- اضبط المضخة الدقيقة على 5.6 نانولتر / ثانية لحقن حجم 2000 نانولتر.
- قم بتشغيل معقم الخرزة الساخنة.
- قم بتوصيل وسادة تسخين الماوس بجهاز التحكم في درجة الحرارة وقم بتوصيله بمصدر طاقة. ضع اللوحة على منصة المسرح. اضبط درجة حرارة اللوحة على 37 درجة مئوية.
- قم بتحميل حقنة دقيقة 30 جرام ، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات. أدخل المكبس وأرفق الإبرة. تأكد من إمساك الإبرة من لوحة التحكم فقط. اضغط على المكبس حتى يتم توزيع قطرة من خليط خلية ميثيل سلولوز من خلال الإبرة. نظف الإبرة باستخدام وسادة تحضير كحول بنسبة 70٪ عن طريق مسح جوانب الإبرة بعناية ، أو عن طريق وضع وسادة شاش معقمة على سطح العمل ونشافها. احرص على عدم ثني أو كسر الإبرة.
- قم بتوصيل المحقنة الدقيقة بالمضخة الدقيقة وقم بتدوير ذراع المناور بعيدا عن المسرح ، لمنع إزاحة إبرة المحقنة قبل وضع الماوس على المسرح.
4. تحضير الفأر للجراحة
- تخدير الماوس عن طريق وضعه في غرفة الحث مع ضبط مبخر الأيزوفلوران على 2.5٪ ، أو وفقا للإرشادات المؤسسية. قم بتشغيل تدفق الأيزوفلوران إلى الأنف.
- انقل الماوس إلى الجهاز التجسيمي وثبته في مخروط الأنف ، مع وضع الأسنان العلوية على دعامة مخروط الأنف (الشكل 1 ب ، 9). شد المقبض الموجود على مخروط الأنف لتأمينه (الشكل 1 ب). تأكد من مستوى مناسب من التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم للتحقق من رد الفعل.
- راقب الأذنين والقدمين والأغشية المخاطية بحثا عن اللون (الوردي) لضمان الأوكسجين الكافي. أيضا ، راقب معدل التنفس (قد تشير الزيادة أو النقصان إلى الحاجة إلى ضبط مستويات الأيزوفلوران).
- أدخل قضبان الأذن (الشكل 1 ب) في كلتا الأذنين وشد المقبض لتأمين الرأس.
- ضع مرهم العين لتليين العينين أثناء تخدير الفأر.
- استخدم ملقط منحني لنتف الشعر على رأس الفأر إلى منطقة أكبر بنسبة 150٪ من الشق المخطط له ، لضمان ظروف معقمة مناسبة.
- حقن 0.5-1 ملغ/كغ من تسكين البوبرينورفين SR تحت الجلد، أو استخدم مسكنا آخر معتمدا من البروتوكول.
- ضع مسبار المستقيم للفأر لمراقبة درجة الحرارة الداخلية ومنع انخفاض حرارة الجسم بسبب التخدير. حافظ على درجة حرارة جسم الفأر بين 36.5 و 38.5 درجة مئوية.
- تعقيم المجال الجراحي باستخدام الدوائر الخارجية ، بالتناوب بين فرك الجراحية والإيثانول ثلاث مرات.
- باستخدام ملقط لسحب الجلد مشدود ، قم بعمل شق حوالي 1 سم بشفرة المشرط ، بدءا من بين العينين. يجب أن تكون bregma مرئية من خلال شق.
ملاحظة: للحصول على تقنية معقمة مناسبة ، المس موقع الجراحة فقط بأطراف الأدوات المعقمة ، وضع أطراف الأدوات على سطح معقم فقط (مثل الجزء الداخلي من حزمة أدوات التعقيم). - استخدمي الطرف الخشبي للقضيب ذي الرؤوس القطنية لكشط الأنسجة الضامة الزائدة ، ثم الطرف القطني لقضيب آخر حتى يجف.
5. حقن الخلايا
- أعد ذراع المعالج مع ملحق المحقنة فوق الماوس ، مع شد المقبض لتأمينه. استخدم المقابض X و Y في المستوى الأفقي لتحريك حامل المحقنة فوق bregma. اخفض الإبرة باستخدام مقبض Z لتأكيد موضع البريغما. اضبط وحدة تحكم القراءة الرقمية على الصفر.
- استخدم مقابض X و Y والقراءات الرقمية المقابلة لتحريك الإبرة إلى الموضع المطلوب. بالنسبة لموقع القشرة القشرية ، تكون الإحداثيات المناسبة 3 مم خلفية ، و 2 مم جانبية يمين إلى بريجما ، وعمق 2 مم من الأم الجافية. استخدم مقبض Z لتحريك الإبرة إلى سطح الجمجمة.
- ثقب ثقب في الجمجمة باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 25 G المرفقة. ضع شطبة الإبرة باتجاه المحقنة والإبرة الدقيقة 30 جم ، وقم بتدوير ذراع المعالج بعناية إلى الجانب. باستخدام الإبهام والإصبع ، لف الإبرة ذهابا وإيابا ببطء مع ضغط لطيف حتى يخترق طرف الإبرة غطاء الجمجمة.
- استخدم أداة تطبيق قطنية لمسح أي دم بعيدا عن فتحة الإبرة. استبدل ذراع المناور إلى الموضع المناسب بإبرة حقنة دقيقة محملة فوق الفتحة. قم بمحاذاة طرف الإبرة مع الفتحة ، باستخدام مقبض Z لخفض الإبرة وصولا إلى الجافية الدماغية ، واضبط وحدة التحكم في القراءة الرقمية على الصفر.
- باستخدام مقبض Z ، اخفض الإبرة 1 مم ، ثم انتظر دقيقة واحدة. كرر حتى يتم الوصول إلى العمق المطلوب (2 مم كما هو موضح).
ملاحظة: يتم خفض الإبرة ببطء لمنع حدوث تلف إضافي لأنسجة المخ المحيطة والتدفق العكسي لمحلول الخلية. - ابدأ تشغيل المضخة الدقيقة ، ثم راقبها للتأكد من توقف المضخة عند حقن 2 ميكرولتر. يجب أن تستغرق هذه العملية حوالي 6 دقائق بالسرعة المحددة. ثم انتظر 1 دقيقة قبل تحريك الإبرة.
6. إزالة الإبرة وإغلاق الجرح
- ارفع الإبرة 1 مم ثم انتظر دقيقة واحدة. كرر حتى تصبح الإبرة خالية تماما من الجمجمة.
- إذا لزم الأمر ، استخدم قضيبا برأس قطني لمسح أي دم بعيدا عن موقع الحقن.
- باستخدام الطرف الخشبي لقضيب ذو رأس قطني ، خذ قطعة صغيرة من شمع العظام (~ 1 مم) وشكلها على شكل مخروط. ضعه في الفتحة في الجمجمة ، وادفع الشمع في الحفرة.
- قم بتسخين الملقط باستخدام معقم الخرزة واستخدمه لإذابة الشمع المتبقي على الجمجمة وتنعيمه.
- ضع ما يقرب من قطرتين من محلول بوبيفاكايين (مخدر) في الشق واستخدم ملقط لسحب حواف الجلد معا.
- اسحب الجلد مشدودا وضع مشبكا أو اثنين من مشبك الجرح لإغلاق الجلد.
- ضع الماوس في قفص استرداد نظيف على وسادة تدفئة في منطقة خالية من السحب ، وراقب الماوس عن كثب. اسمح للفأر بالاستيقاظ تماما من التخدير ، واستئناف النشاط الطبيعي ، قبل إعادته إلى السكن العادي.
- تحقق من الماوس يوميا بعد الإجراء الجراحي وقم بإدارة الألم ، وفقا للإرشادات المؤسسية.
- إذا تم استخدام البوبرينورفين SR (الخطوة 4.6) للتسكين ، فإن تركيبة الإطلاق المستدام تستمر لمدة 72 ساعة. كرر الحقن فقط في حالة وجود ألم أو إزعاج مرئي بعد 72 ساعة. عند إجراؤها بشكل صحيح ، تتعافى الفئران جيدا من الحقن داخل الجمجمة ولا تكون هناك حاجة إلى تسكين إضافي.
- قم بإزالة الدبابيس بعد 7-10 أيام من الجراحة.
- مراقبة نمو الورم عن طريق تصوير الحيوانات الحية (MRI).
- القتل الرحيم للفئران عند الوصول إلى نقاط النهاية الإنسانية (أي إذا فقد الحيوان 20٪ من وزن الجسم أو أصبح منخفض الحرارة).
- نظرا للطبيعة الغازية لأورام المخ هذه ، راقب الفئران بحثا عن أعراض عصبية ، مثل المشية غير المتساوية أو الشلل الجزئي أو الدوران أو إمالة الرأس. القتل الرحيم للفأر إذا لوحظت أي من هذه العلامات السريرية لنمو الورم المتقدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب مراقبة الفئران المحقونة بخلايا ورم المخ يوميا بحثا عن علامات نمو الورم مثل النوبات أو الرنح أو فقدان الوزن. يمكن أيضا مراقبة نمو ورم الدماغ عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي على فترات منتظمة. تسمح فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي الأسبوعية بتصور زيادة عبء الورم داخل الدماغ وقياسات حجم الورم (الشكل 1C). على وجه الخصوص ، تظهر أورام TRP نموا عدوانيا ، ويمكن قياس أحجام الورم ثلاثية الأبعاد عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في غضون 2 إلى 3 أسابيع بعد الحقن داخل الجمجمة (بمتوسط حجم 30 إلى 40 مم3). في إحدى الدراسات التمثيلية ، تم تقسيم مجموعة من الفئران الحاملة لأورام المخ إلى مجموعتين للسيطرة مقابل العلاج الإشعاعي. كشف قياس حجم الورم بالرنين المغناطيسي عن نقص في قمع نمو الورم بعد العلاج الإشعاعي (الشكل 2 أ) ، مما أدى إلى عدم وجود زيادة في البقاء على قيد الحياة للفئران المعالجة (الشكل 2 ب).
عند التشريح ، قد تظهر الأورام كبقعة داكنة على الدماغ داخل نصف الكرة الأيمن المتورم (الشكل 3 أ ، اللوحة الوسطى) ، أو في حالة الأورام الكبيرة ، كمنطقة مرتفعة مظلمة. لتحليل التشريح المرضي ، يسمح التقسيم السهمي عبر منطقة موقع الحقن (الشكل 3 أ) بالتقييم الأمثل لنمو الورم ومدى الغزو في أنسجة المخ غير الخبيثة. قد تنمو أورام GBM في النماذج التخليقية بقوة وتخترق الجمجمة من نقطة النهاية الطرفية ، والتي يمكن ملاحظتها عند التشريح. في المقابل ، من المحتمل أن يشير النمو خارج الجمجمة بعد فترة وجيزة من زرع الخلايا إلى تسرب الخلايا أثناء الحقن ، والذي يمكن ملاحظته في فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي (الشكل 3 ب) ، أو في فأر حي بواسطة منطقة مقببة على الرأس. ربما تمت إزالة الإبرة من موقع الحقن بسرعة كبيرة (انظر القسم 6). يتم تأكيد النمو خارج الجمجمة على أنه تسرب في موقع الحقن عن طريق التقييم النسيجي.
في نموذج تقويم TRP ، أكد علم أمراض الأنسجة وجود الورم النجمي من الدرجة الرابعة / GBM ، بما في ذلك تلخيص السمات المميزة التي لوحظت في أورام TRP GEM مثل الشلل الكاذب والنخر (الشكل 4). تم تقييم الخلايا الجذعية العصبية GBM وعلامات السلف الموصوفة للتصنيف الفرعي GBM البشري بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية (الشكل 5). يشير التعبير الواسع النطاق للبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) إلى وجود ورم تكاثري من أصل سلف نجمي ، في حين أن Nestin و Sox-2 هما علامتان سلف عصبية راسخة ، ويؤكد تعبير Olig-2 وجود خلايا من أصل oligodendrocytic 5,7. يتم التعبير عن جميع العلامات الأربعة بشكل كبير في الأنواع الفرعية من GBM8 البشرية.
الشكل 1: إعداد جهاز الزرع داخل الجمجمة ونمو أورام TRP GBM التي يتم تصورها بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي التسلسلي. (أ) إعداد الجهاز بعناصر مختلفة ضرورية للزرع داخل الجمجمة (1 إلى 11 موصوفة) ؛ يتم تكبير وحدة التخدير المحددة لوضع رأس الماوس واستنشاقه في (B). تم إجراء التصوير الأسبوعي على ماسح ضوئي سريري MRI 3.0T مع ملف سطح صفيف SENSE بأربعة ماوس مصمم خصيصا 5,9. تسلسل صدى الدوران التوربيني متعدد الشرائح T2 (T2w-TSE): (TR / TE (4437/100 مللي ثانية) ، بدقة المستوى (0.12 × 0.15 مم) ، سمك الشريحة (0.5 مم) ، عامل تسريع SENSE (4) تم الحصول على صور في المستوى المحوري لتغطية دماغ الماوس بالكامل. تظهر المقاطع الإكليلية من الأورام في 3 و 4 و 5 أسابيع بعد الزرع. يشار إلى شريط مقياس تمثيلي لصور التصوير بالرنين المغناطيسي في أسفل اليمين (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: دراسة فعالية تمثيلية لنموذج GBM التقويمي مع العلاج الإشعاعي. (أ) أحجام الورم ثلاثية الأبعاد المحسوبة من فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي ، المقابلة للأسابيع 2 و 3 و 4 من غرسات ما بعد الورم. تم قياس أحجام أورام المخ من خلال تحليل صور التصوير بالرنين المغناطيسي. بعد تحميل صورة التصوير بالرنين المغناطيسي في برنامج ITK_SNAP ، تم ضبط تباين الصورة ومرشح منطقة كثافة الصورة. بعد التهيئة الكنتورية النشطة وتجزئة الصورة ، تم قياس حجم الورم بالميليميترات المكعبة. يتم رسم الفئران والفئران الضابطة الفردية (غير المعالجة) المعالجة بالإشعاع (3 جراي يوميا لمدة 5 أيام ليصبح المجموع 15 غراي). ب: بقاء الفئران المعالجة بالإشعاع مقارنة بالمجموعة الضابطة. تم حساب نسبة البقاء على قيد الحياة باستخدام برنامج الرسوم البيانية (انظر جدول المواد) من إجمالي n = 11 فأرا غير معالج و n = 12 فأرا معالجا بالإشعاع. تم القتل الرحيم لفئران الدراسة عند الوصول إلى نقاط النهاية الإنسانية ، بناء على إرشاداتنا المؤسسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: موقع الورم في الدماغ عند التشريح. أ: الموقع الصحيح لنمو الورم في نصف الكرة الأيمن للفأر. تظهر اللوحة اليسرى مثالا على ورم داخل الدماغ من فحص التصوير بالرنين المغناطيسي عند إنهاء الدراسة. يشير السهم الأحمر إلى موقع الورم. يظهر دماغ الفأر المشريح داخل الجمجمة (اللوحة الوسطى) ويتم إزالته من تجويف الجمجمة (اللوحة اليمنى). في اللوحة الوسطى ، تشير الأسهم الزرقاء إلى تأثير الإبرة لموقع الحقن ، وتشير الأسهم ذات الرأسين إلى الموقع الموصى به للقطع السهمي الدماغي للأنسجة ، وتقسيم نصف الكرة الأيمن إلى قسمين. يتم تضمين كلا جزأين من الدماغ في البارافين بطريقة "الكتاب المفتوح". يشير الخط المتقطع إلى الشق الطولي المتوسط الذي يفصل بين نصفي الكرة المخية كمرجع. في اللوحة اليمنى ، تمثل المنطقة المحاطة بالخط المتقطع منطقة الورم المرئية عند التشريح. (ب) يظهر مثال على نمو ورم في الدماغ خارج جمجمة الفأر في فحص التصوير بالرنين المغناطيسي. يوضح الشكل 3 أ شريط مقياس تمثيلي لصورتي التصوير بالرنين المغناطيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: علم أمراض الأنسجة لأورام TRP GBM التقويمية يلخص السمات المميزة ل GBM البشري. تم تقييم الهيماتوكسيلين واليوزين (H&E) الملون بالأجزاء السهمية من الدماغ بأكمله من قبل أخصائي علم الأمراض البيطري المعتمد من ACVP ، وتم تصنيف الأورام بناء على تصنيف منظمة الصحة العالمية الحالي (WHO) للأورام النجمية البشرية10،11. أورام GBM التقويمية هي تكاثرية للغاية ، غازية (I) والأوعية الدموية (V) ، وتظهر السمات المميزة لأمراض الأنسجة البشرية GBM بما في ذلك النخر (N) و pseudopalisading (P) بواسطة الخلايا الورمية12. تظهر الخطوط المتقطعة تكبير المناطق داخل ورم المخ وفي المحيط ، بجوار أنسجة المخ الطبيعية (أعلى وأسفل اليمين ، على التوالي). تم وصف الأجسام المضادة وطرق الكيمياء الهيستولوجية المناعية في El Meskini et al.5. يتم عرض شريط مقياس لصور H&E لكل من التكبير المنخفض والعالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: المؤشرات الحيوية ل GBM معبرا عنها في النموذج التقويمي. يشير التعبير عن علامة السلف متعددة القدرات SOX-2 (عامل نسخ SRY-Box 2) ، والأسلاف العصبية Nestin و Olig-2 ، والعلامة النجمية للبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) إلى عدم التجانس الخلوي ، وهي سمة مشتركة للإنسان GBM 7,8. يظهر شريط مقياس تمثيلي لجميع صور IHC في Olig2 (عامل نسخ الخلايا قليلة التغصن 2 ؛ أسفل اليمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النماذج قبل السريرية ضرورية لتقييم الأهداف العلاجية الجديدة واستراتيجيات العلاج الجديدة في GBM. تتمتع نماذج الفئران المعدلة وراثيا ل GBM بميزة حدوث الورم في الموقع الأصلي ، ولكن غالبا مع زمن انتقال طويل ونمو ورم لا يمكن التنبؤ به13. تظهر أورام نموذج GEM زمن انتقال من 4-5 أشهر ، والنافذة الزمنية المثالية للتصوير والتوظيف والعلاج متغيرة بين الفئران الفردية. يحتوي نموذج تقويم العظام على جدول زمني راسخ للنمو والعلاج من 4-5 أسابيع ، ويتم اكتشاف الأورام بشكل موثوق بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الزرع. يسمح استخدام النماذج التقويمية المشتقة من GEM بوضع الورم في الموقع الدقيق في كل فأر ، بالإضافة إلى التحكم الزمني في بدء نمو الورم ، مع الحفاظ على ميزة البيئة المكروية المحيطة بالدماغ. في نموذج تقويم TRP ، تنتج مسارات RTK و PTEN و RB المنشطة نموذجا للورم يلخص السمات النسيجية ل GBM البشري. على غرار GBM البشري ، تظهر أورام TRP GBM التقويمية ميزات النمو العدواني ، مثل البؤر الميتة المحاطة بالخلايا الورمية الكاذبة والأوعية الدموية الجديدة. الأورام هي أيضا الغازية في حمة الدماغ المحيطة بها. لذلك ، يمكن تقييم العوامل التي قد تمنع تسلل الورم والهجرة في المرضى قبل السريرية في أورام تقويم TRP. تتطلب عملية حقن الخلايا من أورام GEM الغازية في الفئران الاصطناعية الحذر بشكل خاص ، لتجنب التسرب غير المقصود ونمو الخلايا خارج المنطقة المستهدفة. يمكن استخدام الطريقة الموصوفة هنا ، عند ممارستها بشكل روتيني ، لتوليد مجموعات كبيرة من الفئران الحاملة للورم مع نمو الورم بشكل ثابت.
تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي قد تؤثر على حقن الورم الناجح إزالة الإبرة من الدماغ بعد حقن الخلايا واستخدام شمع العظام. يجب إدخال الإبرة وإزالتها 1 مم في المرة الواحدة (كما هو موضح في الخطوتين 5 و 6) ، لمنع حدوث تلف إضافي لأنسجة المخ المحيطة وتسرب الخلايا المتبقية أو ارتجاع المعلق المحقون14. إن استخدام شمع العظام المذاب لسد ثقب الإبرة وختمه يخلق حاجزا لمنع تسرب الخلايا ، كما يفعل زرع الخلايا في تعليق ميثيل سلولوز. الأهم من ذلك ، يجب خلط ميثيل سلولوز في محلول مخزن مثل PBS (أو بدلا من ذلك ، وسائط خالية من المصل) قبل تعليق خلايا الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، يفضل استخدام التخدير بالاستنشاق على التخدير عن طريق الحقن ، لتقصير وقت الشفاء.
لاحظ أن حجم الرأس قد يختلف قليلا بين سلالات الفئران ، أو حسب العمر والجنس ؛ وبالتالي ، قد تحتاج معدات التوجيه التجسيمي إلى إعادة معايرتها عند التغيير من نوع فوج فأر إلى آخر. نوصي أيضا بتحسين رقم الخلية للحقن لكل خط خلية مهم في عدد صغير من الفئران قبل المتابعة مع مجموعة كبيرة. بالمقارنة مع الطعوم الخارجية البشرية ، قد تنمو أورام الفئران بقوة عند إعادة زرعها في الفئران المتطابقة مع الإجهاد وتتطلب خلايا أقل للحقن ، كما لاحظنا مع خطوط TRP.
تتمثل الميزة الرئيسية لحقن الدماغ التقويمي مقارنة ببدء ونمو الورم الأرومي الدبقي في نموذج GEM في أن الأنسجة المحيطة بالورم المحقون طبيعية ، ويمكن تقييم الغزو الموضعي من خلال علم أمراض الأنسجة. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد التغييرات في البيئة المكروية بسبب جرح الحقن نفسه ، مما قد يؤدي إلى استجابة التهابية محلية أو اضطراب في الحاجز الدموي الدماغي.
في الختام ، تسمح النماذج التقويمية بدراسة GBM ، مع جدول زمني معقول للعلاج وفي سياق موقع الورم الأصلي. يلخص نموذجنا ميزات GBM البشرية ولكن في فأر مناعي. لذلك ، يمكن تحليل البيئة المكروية المناعية بالنسبة لنمو الورم ، أو استجابة للعلاج المناعي. نمو الورم عدواني وغازي ، على عكس العديد من نماذج GBM للطعم الخارجي لخط الخلايا حيث يظل الورم مغلفا ولا يظهر السمات النسيجية للإنسان GBM13،15،16. عند إجراء الإجراء الموصوف هنا بشكل صحيح ، يؤدي إلى نمو موثوق للورم دون تسرب الخلايا أو الانتشار خارج الجمجمة.
أخيرا ، على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تحسينه في سياق GBM كنموذج للفأر التقويمي ، إلا أنه يمكن تكييف دقته وتطبيقه الموثوق به في الترجمة قبل السريرية مع نماذج الفئات الفرعية الأخرى لأورام المخ. يمكن استخدام الطرق والكواشف في هذا البروتوكول لأنواع الخلايا المختلفة التي تحمل طفرات لنموذج ورم الدماغ محل الاهتمام (على سبيل المثال ، الورم الدبقي المنتشر في خط الوسط17) ، مع تعديل الإحداثيات المجسمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
كولاغا على المساعدة التقنية الممتازة وللسيدة ميشيل ل. غومبريخت على صقل التقنيات الجراحية. نشكر الدكتور فيليب إل مارتن على تحليل علم الأمراض والسيدة ليليا إليفا والدكتور جوزيف كالين من برنامج تصوير الحيوانات الصغيرة في مختبر فريدريك الوطني لإجراء فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي.
تم تمويل هذا المشروع كليا أو جزئيا بأموال اتحادية من المعهد الوطني للسرطان ، المعاهد الوطنية للصحة ، بموجب العقد رقم HHSN261201500003I. لا يعكس محتوى هذا المنشور بالضرورة آراء أو سياسات وزارة الصحة والخدمات الإنسانية ، ولا يعني ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات موافقة حكومة الولايات المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al.
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G.
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , Exon Publications. (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J.
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
