Summary
במאמר זה אנו מתארים מודל עכבר אורתוטופי פרה-קליני עבור GBM, שהוקם על ידי הזרקה תוך-גולגולתית של תאים שמקורם בגידולי מודל עכבר מהונדסים גנטית. מודל זה מציג את סימני ההיכר של המחלה של GBM אנושי. עבור מחקרים תרגומיים, הגידול במוח העכבר נמצא במעקב על ידי MRI in vivo והיסטופתולוגיה.
Abstract
מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) עבור גליובלסטומה מולטיפורמה אנושית (GBM) הם קריטיים להבנת ההתפתחות וההתקדמות של גידולי מוח. שלא כמו גידולי xenograft, ב- GEMs, גידולים מתעוררים במיקרו-סביבה הטבעית בעכבר כשיר חיסון. עם זאת, השימוש ב- GBM GEMs במחקרי טיפול פרה-קליניים מאתגר בשל השהיות ארוכות של גידולים, הטרוגניות בתדירות הניאופלזמה ועיתוי התפתחות הגידול בדרגה מתקדמת. עכברים המושרים באמצעות הזרקה אורתוטופית תוך גולגולתית ניתנים יותר למחקרים פרה-קליניים, ושומרים על מאפיינים של גידולי GEM. יצרנו מודל גידול מוח אורתוטופי הנגזר ממודל GEM עם סטיות Rb, Kras ו-p53 (TRP), המפתח גידולי GBM המציגים מוקדים ליניאריים של נמק על ידי תאים ניאופלסטיים, וכלי דם צפופים המקבילים ל-GBM אנושי. תאים שמקורם בגידולי GBM מסוג GEM מוזרקים תוך גולגולתית לעכברים מושתלים מסוג בר ומותאמים לזנים ומרבים גידולים בדרגה IV, ובכך עוקפים את תקופת החביון הארוכה של הגידול בעכברי GEM ומאפשרים יצירת קבוצות גדולות וניתנות לשחזור למחקרים פרה-קליניים. המאפיינים הרבים, החודרניים וכלי הדם של מודל TRP GEM עבור GBM משוחזרים בגידולים האורתוטופיים, וסמנים היסטופתולוגיים משקפים תת-קבוצות GBM אנושיות. צמיחת הגידול מנוטרת על ידי סריקות MRI סדרתיות. בשל האופי הפולשני של גידולים תוך גולגולתיים במודלים חיסוניים, מעקב קפדני אחר הליך ההזרקה המתואר כאן חיוני למניעת צמיחת גידול מחוץ לגולגולת.
Introduction
גליובלסטומה (GBM; גליומה דרגה IV) היא הגידול השכיח והממאיר ביותר במוח, והטיפולים הנוכחיים אינם יעילים, וכתוצאה מכך הישרדות חציונית של 15 חודשים1. מודלים פרה-קליניים אמינים ומדויקים המייצגים את מסלולי האיתות המורכבים המעורבים בצמיחת גידולי מוח ופתוגנזה חיוניים כדי לזרז את ההתקדמות בהערכת משטרים טיפוליים חדשים עבור GBM. מודלים עכבריים שבהם שורות תאי גידול במוח האנושי מושתלים באופן תת-עורי בעכברים מדוכאי חיסון אינם משקפים את הסביבה החיסונית הטבעית של גידולי מוח, וגם לא ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את יכולתם של טיפולים לחצות את מחסום הדם-מוח2. באופן אידיאלי, מודלים פרה-קליניים של עכברים צריכים גם לשחזר מקרוב את ההיסטופתולוגיה האנושית של GBM, כולל הרמה הגבוהה של פולשניות לתוך פרנכימה3 שמסביב. למרות שמודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) מפתחים גידולים בהקשר של מערכת חיסון שלמה, לעתים קרובות נדרשות תוכניות רבייה מסובכות, וגידולים עלולים להתפתח לאט ולא באופן עקבי4. מודלים של אלוגרפט שמקורם ב-GEM מתאימים יותר למחקרים טיפוליים פרה-קליניים, שבהם יש צורך בקבוצות גדולות של עכברים נושאי גידול במסגרת זמן קצרה יותר.
בדו"ח קודם, תיארנו מודל עכבר GBM אורתוטופי הנגזר ישירות מגידולי GEM. גידולים ב-GEM נובעים מאירועים גנטיים באוכלוסיות תאים (בעיקר אסטרוציטים) המבטאים חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), הגורמים להתקדמות לגליובלסטומה. אבני חן TRP אלה מכילות טרנסגן TgGZT121 (T), המבטא T121 לאחר חשיפה לרקומבינאז Cre מונע GFAP. ביטוי חלבון T121 גורם לדיכוי פעילות החלבון Rb (Rb1, p107 ו-p103). ביטוי משותף של טרנסגן Cre מונע GFAP (GFAP-CreERT2) מכוון ביטוי לאסטרוציטים בוגרים לאחר השראת טמוקסיפן. עכברי TRP מחזיקים גם בקראס מוטנטי תלוי Cre (KrasG12D; R) אלל, המייצגים הפעלה של מסלול הקולטן טירוזין קינאז, והם הטרוזיגוטיים לאובדן Pten (P)5,6. סטיות גנים מקבילות ברשתות הקולטן טירוזין קינאז (RTK), PI3K ו-RB מעורבות ב-74% מפתוגנזה7 של GBM. לכן, מסלולי האיתות העיקריים שהשתנו בגליובלסטומה אנושית מיוצגים על ידי המוטציות המהונדסות בעכברי TRP, במיוחד גידולי GBM, שבהם מופעלות מטרות משותפות במורד הזרם של RTK5.
המודל האורתוטופי הסינגני שמקורו ב-GEM אומת כמודל המשחזר מאפיינים של גידולי מוח אנושיים, כולל פולשניות ונוכחות של סמנים ביולוגיים תת-סוגיים, לשימוש כפלטפורמה להערכת טיפולים בסרטן המתמקדים במסלולים חריגים בגליובלסטומה. תאים גודלו בתרבית מגידולים שנקצרו ממוחות TRP והושתלו מחדש במוחם של עכברים מותאמי זן, תוך שימוש בציוד סטריאוטקטי להזרקה תוך גולגולתית בקליפת המוח. מודל עכבר אורתוטופי פרה-קליני זה פיתח גידולי GBM שהיו תאיים מאוד, פולשניים, פלאומורפיים עם קצב מיטוטי גבוה, והציגו מוקדים ליניאריים של נמק על ידי תאים ניאופלסטיים וכלי דם צפופים, כפי שנצפה עבור GBM אנושי. נפחי הגידול וצמיחתו נמדדו על ידי דימות תהודה מגנטית in vivo (MRI).
בדו"ח זה, אנו מתארים את הטכניקה האופטימלית להזרקה תוך גולגולתית של תאי GBM ראשוניים או קווי תאים לתוך מוח עכבר מסוג פראי, תוך שימוש בגידולי TRP כדוגמה. אותו פרוטוקול עשוי להיות מותאם לעכברים מדוכאי חיסון ולקווי תאים אחרים של GBM. טיפים חיוניים ניתנים למניעת מלכודות נפוצות, כגון הכנת תאים תת-אופטימלית או דליפת תאים באתר ההזרקה, ולשימוש נכון בציוד הסטריאוטקטי כדי להבטיח שחזור ואמינות של המודל. למטרות תרגומיות, אנו מאמתים את המודל על ידי זיהוי MRI של גידול גידולי מוח בבעלי חיים חיים, אפיון היסטולוגי, ומציגים דוגמה לטיפול בעכברים נושאי גידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול המחקר המתואר כאן אושר על ידי NCI בוועדת פרדריק לטיפול ושימוש בבעלי חיים. NCI-Frederick מוכר על ידי AAALAC International ועוקב אחר מדיניות שירותי בריאות הציבור לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הטיפול בבעלי חיים ניתן בהתאם לנהלים המפורטים ב"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המועצה הלאומית למחקר, 2011; The National Academies Press, וושינגטון די.סי).
1. הכנת תאים להזרקה
הערה: תאים ראשוניים של גידול במוח עכבר (MBR) ששימשו למודל זה בודדו במקור מעכברי TRP GEM המושרים על ידי טמוקסיפן, כמתואר ב- El Meskini et al.5. פרטים על הכנת התא ניתן למצוא בהפניה זו.
- בצע את השלבים הבאים בטכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית.
- תרבית תאי גידול ראשוניים במוח במבחנה עד שהם מגיעים לשלב הצמיחה המעריכי.
- קצרו את התאים ב -0.25% טריפסין, ולאחר שהם התנתקו, דללו אותם עם מדיום צמיחה כדי להשבית את הטריפסין.
- משחררים את התאים בצנטריפוגה ב 400 x גרם ושוטפים עם מדיה ללא סרום. יש לחזור על הפעולה פעם אחת לפני הספירה.
- ספור את התאים באופן ידני או באמצעות מונה תאים אוטומטי. להשהות מחדש את התאים במתילצלולוז סטרילי 5% במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS) בריכוז הרצוי, בהתבסס על נפח הזרקה סופי של 2 μL. ריכוז התאים הרצוי עשוי להשתנות בהתאם לקו התא ולמודל הגידול במוח. עבור תאי GBM GEM TRP, אנו מזריקים 2 μL של תמיסת 25 x 106 תאים/מ"ל, או 50,000 תאים.
2. מתח עכבר
- לגדל או לרכוש זן עכבר מתאים התואם את רקע הזן של תאי הגידול במוח. עבור תאי TRP, השתמש בעכברי B6D2F1/J בני 9 שבועות (מהכלאה בין נקבות C57BL/6J [B6] וזכרי DBA/2J [D2]) כמושתלי תאים סרטניים.
3. הקמת אזור הניתוח
הערה: כל שלבי הניתוח מתבצעים בטכניקה אספטית בסביבה נקייה ומחוטאת. פילינג וציוד מגן אישי, כולל מסכה, צריכים להילבש על ידי המנתח. כלי ניתוח חייבים להיות מעוקרים בחום לפני השימוש.
- הניחו את מגיני המשטחים מתחת למנגנון הסטריאוטקסי ועל משטח העבודה.
- חבר את צינור הוויניל ממכונת ההרדמה ליציאת IN של פלטפורמת ההרדמה בגז של המנגנון הסטריאוטקסי, וצינור נוסף ליציאת Out.
- חבר את הצג הדיגיטלי למקור חשמל ולמנגנון.
- חברו את בקר המיקרו-משאבה (איור 1A) למקור חשמל וחברו את המיקרו-משאבה (איור 1A) לזרוע המניפולטורית של המכשיר (ראו גם הוראות היצרן).
- הגדר את המיקרו-משאבה ל- 5.6 nL/s עבור הזרקת נפח של 2,000 nL.
- הפעל את מעקר החרוזים החם.
- חבר את כרית החימום של העכבר לבקר הטמפרטורה וחבר למקור חשמל. מניחים את הצלחת על במת הבמה. כוונו את טמפרטורת הצלחת ל-37°C.
- טען בחזרה מזרק מדויק 30 גרם, נזהר לא להכניס בועות. הכנס את הבוכנה וחבר את המחט. הקפד לאחוז את המחט על ידי הרכזת בלבד. לחץ על הבוכנה עד שטיפה של תערובת תאי מתילצלולוז יוצאת דרך המחט. נקו את המחט עם פד להכנת אלכוהול 70% על ידי ניגוב זהיר של דפנות המחט, או על ידי הנחת פד גזה סטרילי על משטח העבודה והכתמתו. היזהר לא לכופף או לשבור את המחט.
- חבר את המזרק המדויק למיקרו-משאבה וסובב את זרוע המניפולטור הרחק מהבמה, כדי למנוע תזוזה של מחט המזרק לפני הנחת העכבר על הבמה.
4. הכנת העכבר לניתוח
- הרדימו את העכבר על ידי הכנסתו לתא האינדוקציה עם וופורייזר איזופלורן המוגדר ל -2.5%, או על פי הנחיות מוסדיות. הפעל את זרימת האיזופלורן אל חרוט האף.
- העבירו את העכבר למנגנון הסטריאוטקסי והצמידו אותו לקונוס האף, כשהשיניים העליונות ממוקמות על תמיכת חרוט האף (איור 1B, 9). הדקו את הידית על חרוט האף כדי לאבטח (איור 1B). ודא רמה מתאימה של הרדמה על ידי ביצוע צביטת בוהן כדי לבדוק רפלקס.
- עקוב אחר צבע האוזניים, כפות הרגליים והריריות (ורוד) כדי להבטיח חמצון הולם. כמו כן, לפקח על קצב הנשימה (עלייה או ירידה יכולה להצביע על הצורך להתאים את רמות isoflurane).
- הכניסו מוטות אוזניים (איור 1B) לשתי האוזניים והדקו את הידית כדי לאבטח את הראש.
- החל משחת עיניים כדי לשמן את העיניים בזמן העכבר תחת הרדמה.
- השתמש במלקחיים מעוקלים כדי למרוט את השיער על ראשו של העכבר לאזור גדול בכ -150% מהחתך המתוכנן, כדי להבטיח תנאים אספטיים נאותים.
- הזריקו 0.5-1 מ"ג/ק"ג buprenorphine SR analgesia תת עורית, או השתמשו במשכך כאבים אחר שאושר על ידי פרוטוקול.
- מקם את הבדיקה הרקטלית של העכבר כדי לפקח על הטמפרטורה הפנימית ולמנוע היפותרמיה עקב הרדמה. שמור על טמפרטורת גוף העכבר בין 36.5 ל 38.5 ° C.
- לחטא את שדה הניתוח באמצעות עיגולים חיצוניים, לסירוגין בין קרצוף כירורגי אתנול שלוש פעמים.
- באמצעות מלקחיים כדי למשוך את העור מתוח, לעשות חתך של כ 1 ס"מ עם להב אזמל, החל בין העיניים. הברגמה צריכה להיות גלויה דרך החתך.
הערה: לטכניקה סטרילית נכונה, גע באתר הניתוח רק עם קצות הכלים המעוקרים, והנח את קצות הכלים על משטח סטרילי בלבד (כגון החלק הפנימי של חבילת כלים אוטומטית). - השתמשו בקצה העץ של אפליקטור עם קצוות כותנה כדי לגרד רקמת חיבור עודפת, ולאחר מכן בקצה הכותנה של אפליקטור אחר לייבוש.
5. הזרקת תאים
- החזר את זרוע המניפולטור עם חיבור המזרק מעל העכבר, הידוק הידית כדי לאבטח. השתמש בידיות X ו- Y במישור האופקי כדי להזיז את תושבת המזרק מעל ברגמה. הורידו את המחט באמצעות ידית Z כדי לאשר את מיקום הברגמה. הגדר את מסוף הקריאה הדיגיטלי לאפס.
- השתמש בידיות X ו- Y ובקריאה הדיגיטלית המתאימה כדי להזיז את המחט למיקום הרצוי. עבור מיקום קליפת המוח, הקואורדינטות המתאימות הן 3 מ"מ אחורית, 2 מ"מ לרוחב ימינה לברגמה, ועומק 2 מ"מ מהדורה מאטר. השתמש בידית Z כדי להזיז את המחט לפני השטח של הגולגולת.
- נקב חור בגולגולת באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G מחובר. מניחים את שיפוע המחט לכיוון מזרק ומחט מדויקים 30 G, ובזהירות לסובב את זרוע מניפולטור הצידה. בעזרת האגודל והאצבע, גלגלו את המחט קדימה ואחורה באיטיות ובלחץ עדין עד שקצה המחט פשוט חודר את כובע הגולגולת.
- השתמש אפליקטור עם קצוות כותנה כדי לטפוח כל דם מחור המחט. החלף את זרוע המניפולטור למיקום המתאים עם מחט מזרק מדויקת טעונה מעל החור. יישרו את קצה המחט עם החור, השתמשו בידית Z כדי להוריד את המחט מטה אל הדורא של המוח, והגדירו את מסוף הקריאה הדיגיטלי לאפס.
- באמצעות ידית Z, להוריד את המחט 1 מ"מ, ולאחר מכן לחכות 1 דקה. חזור על הפעולה עד לקבלת העומק הרצוי (2 מ"מ כפי שצוין).
הערה: המחט מונמכת באיטיות כדי למנוע נזק נוסף לרקמת המוח שמסביב ולזרימה האחורית של תמיסת התא. - הפעל את המיקרו-משאבה ולאחר מכן עקוב כדי לוודא שהמשאבה מפסיקה כאשר הוזרק 2 מיקרוליטר. תהליך זה אמור להימשך כ -6 דקות במהירות שצוינה. לאחר מכן, המתן דקה לפני הזזת המחט.
6. הסרת המחט וסגירת הפצע
- הרימו את המחט 1 מ"מ ולאחר מכן המתינו דקה. חזור על הפעולה עד שהמחט נקייה לחלוטין מהגולגולת.
- במידת הצורך, השתמש במוליך עם קצוות כותנה כדי לטפוח כל דם הרחק מאתר ההזרקה.
- בעזרת קצה העץ של מוליך כותנה, לוקחים חתיכה קטנה של שעוות עצם (~ 1 מ"מ) ומעצבים אותה לחרוט. מניחים אותו לתוך הפתח בגולגולת, דוחפים את השעווה לתוך החור.
- מחממים מלקחיים באמצעות מעקר חרוזים ומשתמשים בהם כדי להמיס את שאריות השעווה על הגולגולת ולהחליק אותה.
- יש לטפטף כשתי טיפות של תמיסת בופיוואקאין (חומר הרדמה) לתוך החתך ולהשתמש במלקחיים כדי למשוך את קצוות העור יחד.
- משכו את העור מתוח והניחו קליפס פצע אחד או שניים כדי לסגור את העור.
- הניחו את העכבר בכלוב התאוששות נקי על כרית חימום באזור ללא טיוטות, והתבוננו בעכבר מקרוב. אפשר לעכבר להתעורר באופן מלא מההרדמה, לחזור לפעילות רגילה, לפני החזרתו לדיור רגיל.
- בדוק את העכבר מדי יום לאחר ההליך הכירורגי ונהל טיפול בכאב, בהתאם להנחיות המוסדיות.
- אם buprenorphine SR (שלב 4.6) משמש לשיכוך כאבים, נוסחת שחרור מושהה נמשכת 72 שעות. חזור על הזריקה רק אם קיים כאב או אי נוחות נראים לעין לאחר 72 שעות. כאשר מבוצע כראוי, העכברים להתאושש היטב מן זריקות תוך גולגולתי ומשככי כאבים נוספים אין צורך.
- הסר את הסיכות 7-10 ימים לאחר הניתוח.
- מעקב אחר צמיחת הגידול על ידי הדמיה חיה של בעלי חיים (MRI).
- הרדימו את העכברים כאשר מגיעים לנקודות קצה אנושיות (כלומר, אם בעל החיים מאבד 20% ממשקל גופו או הופך להיפותרמי).
- בשל האופי החודרני של גידולי מוח אלה, צפו בעכברים לתסמינים נוירולוגיים, כגון הליכה לא אחידה, שיתוק חלקי, ספינינג או הטיית ראש. הרדימו עכבר אם נצפים אחד מהסימנים הקליניים הללו לצמיחת גידול מתקדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכברים המוזרקים עם תאי גידול במוח צריכים להיות במעקב יומי עבור סימנים של צמיחת הגידול כגון התקפים, אטקסיה, או ירידה במשקל. גידול במוח עשוי להיות מנוטר גם על ידי סריקת MRI במרווחי זמן קבועים. סריקות MRI שבועיות מאפשרות הדמיה של עומס הגידול הגובר במוח ומדידות נפח הגידול (איור 1C). בפרט, גידולי TRP מציגים צמיחה אגרסיבית, ונפחי הגידול התלת-ממדיים ניתנים למדידה על ידי MRI תוך שבועיים עד שלושה שבועות לאחר הזרקה תוך גולגולתית (עם נפח ממוצע של 30 עד 40 מ"מ3). במחקר מייצג אחד, קבוצה של עכברים נושאי גידולי מוח חולקה לשתי קבוצות לבקרה לעומת הקרנות; מדידת נפח הגידול ב-MRI חשפה חוסר דיכוי צמיחת הגידול לאחר טיפול קרינתי (איור 2A), וכתוצאה מכך לא הייתה עלייה בהישרדות של העכברים שטופלו (איור 2B).
בנקרופסיה, גידולים עשויים להופיע כנקודה כהה במוח בתוך המיספרה ימנית נפוחה (איור 3A, פאנל אמצעי), או במקרה של גידולים גדולים יותר, כאזור מורם וחשוך. לצורך ניתוח היסטופתולוגיה, חתך קשת דרך אזור אתר ההזרקה (איור 3A) מאפשר הערכה אופטימלית של צמיחת הגידול ומידת הפלישה לרקמת מוח שאינה ממאירה. גידולי GBM במודלים סינגניים עשויים לגדול באגרסיביות ולפרוץ את הגולגולת על ידי נקודת הקצה הסופית, אשר ניתן לראות בנקרופסי. לעומת זאת, גדילה חוץ-גולגולתית זמן קצר לאחר השתלת תאים מצביעה ככל הנראה על דליפה של תאים במהלך ההזרקה, שניתן לצפות בה בסריקות MRI (איור 3B), או בעכבר חי ליד אזור כיפה בראש. ייתכן שהמחט הוצאה ממקום ההזרקה מהר מדי (ראה סעיף 6). גידול מחוץ לגולגולת מאושר כדליפה באתר ההזרקה על ידי הערכה היסטולוגית.
במודל האורתוטופי TRP, היסטופתולוגיה אישרה את נוכחותה של אסטרוציטומה/GBM דרגה IV, כולל שחזור של המאפיינים הייחודיים שנצפו בגידולי TRP GEM כגון פסאודופליסדינג ונמק (איור 4). תאי גזע עצביים של GBM וסמני אב שתוארו עבור תת-סיווג GBM אנושי הוערכו על-ידי אימונוהיסטוכימיה (איור 5). ביטוי נרחב של חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) מצביע על גידול מתפשט ממוצא אב אסטרוציטי, בעוד נסטין וסוקס-2 הם סמנים עצביים מבוססים, וביטוי אוליג-2 מאשר את נוכחותם של תאים ממוצא אוליגודנדרוציטי 5,7. כל ארבעת הסמנים באים לידי ביטוי גבוה בתת-סוגים של GBM8 בבני אדם.
איור 1: הגדרת מנגנון השתל התוך גולגולתי וצמיחתו של גידולי TRP GBM בהדגמה באמצעות MRI טורי. (A) התקנת מכשיר עם אלמנטים שונים הדרושים לשתל תוך גולגולתי (1 עד 11 מתואר); מיקום ראש עכבר ספציפי ויחידת הרדמה באינהלציה מוגדלים ב-(B). הדמיה שבועית בוצעה על סורק קליני MRI 3.0T עם סליל משטח SENSE 5,9 מותאם אישית של מערךSENSE בן ארבעה עכברים. רצף הד ספין טורבו משוקלל T2 (T2w-TSE): (TR/TE (4437/100 אלפיות השנייה), ברזולוציית מישור (0.12 x 0.15 מ"מ), עובי פרוסה (0.5 מ"מ), גורם תאוצה SENSE (4) תמונות נרכשו במישור הצירי כדי לכסות את כל מוח העכבר. מוצגים קטעי קורונל מגידולים 3, 4 ו -5 שבועות לאחר השתל. סרגל קנה מידה מייצג עבור תמונות MRI מצוין בפינה השמאלית התחתונה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מחקר יעילות מייצג של מודל GBM אורתוטופי עם טיפול קרינתי. (A) נפחי גידול תלת-ממדיים המחושבים מסריקות MRI, המתאימים לשבועות 2, 3 ו-4 שתלים לאחר הגידול. נפחי גידולי המוח נמדדו באמצעות ניתוח תמונות MRI. לאחר העלאת תמונת MRI לתוכנית ITK_SNAP, הותאמו ניגודיות התמונה ומסנן אזור עוצמת התמונה. לאחר אתחול קווי המתאר הפעילים ופילוח התמונה, נפח הגידול נמדד במילימיטרים מעוקבים. ביקורת פרטנית (לא מטופלת) עכברים ועכברים המטופלים על ידי הקרנה (3 Gy ליום במשך 5 ימים עבור סך של 15 Gy) הם מתוכננים. (B) הישרדות עכברים שטופלו בקרינה בהשוואה לקבוצת ביקורת. אחוז ההישרדות חושב באמצעות תוכנת גרפים (ראו טבלת חומרים) מ-n = 11 עכברים שלא טופלו ו-n = 12 עכברים שטופלו בקרינה. עכברי המחקר הומתו כאשר הושגו נקודות קצה הומניות, בהתבסס על ההנחיות המוסדיות שלנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיקום הגידול במוח בנקרופסיה. (A) מיקום נכון של צמיחת הגידול בהמיספרה הימנית של העכבר. הפאנל השמאלי מראה דוגמה לגידול במוח מסריקת MRI בסיום המחקר; החץ האדום מציין את מיקום הגידול. מוח העכבר המנותח מוצג בתוך הגולגולת (הפאנל האמצעי) ומוסר מחלל הגולגולת (פאנל ימני). בלוח האמצעי, חצים כחולים מציינים את השפעת המחט של אתר ההזרקה, וחצים דו-ראשיים מציינים את המיקום המומלץ של חתך הקשת במוח להיסטולוגיה, המפצל את ההמיספרה הימנית לשני חלקים. שני חלקי המוח משובצים בפרפין בצורת "ספר פתוח". הקו המקווקו מציין את הסדק האורכי החציוני המפריד בין שתי המיספרות המוח כנקודת ייחוס. בחלונית הימנית, האזור התחום בקו מקווקו מייצג את אזור הגידול הנראה בנקרופסי. (B) דוגמה לגידול במוח שגדל מחוץ לגולגולת העכבר מוצגת בסריקת MRI. סרגל קנה מידה מייצג עבור שתי תמונות ה-MRI מוצג באיור 3A. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: היסטופתולוגיה של גידולי GBM אורתוטופיים TRP משחזרת את סימני ההיכר של GBM אנושי. המטוקסילין ואאוזין (H&E) מוכתמים באזורי קשת במוח כולו הוערכו על ידי פתולוג וטרינרי מוסמך מטעם ACVP, והגידולים דורגו על סמך הסיווג הנוכחי של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לאסטרוציטומות אנושיות10,11. גידולי GBM אורתוטופיים הם בעלי שגשוג רב, פולשניים (I) וכלי דם (V), ומציגים סימני היכר של היסטופתולוגיה של GBM אנושי, כולל נמק (N) ופסאודופליסדינג (P) על ידי תאים ניאופלסטיים12. קווים מקווקווים מראים הגדלה של האזורים בתוך גידול המוח ובפריפריה, הסמוכים לרקמת מוח תקינה (למעלה ולמטה מימין, בהתאמה). נוגדנים ושיטות לאימונוהיסטוכימיה מתוארים ב- El Meskini et al.5. סרגל קנה מידה לתמונות H&E מוצג להגדלות נמוכות וגבוהות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סמנים ביולוגיים של GBM המבוטאים במודל האורתוטופי. ביטוי סמן האב הרב-עוצמה SOX-2 (גורם שעתוק SRY-Box 2), האבות העצביים נסטין ואוליג-2, והסמן האסטרוציטי של חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) מצביעים על הטרוגניות תאית, תכונה נפוצה של GBM 7,8 אנושי. סרגל קנה מידה מייצג עבור כל תמונות IHC מוצג ב- Olig2 (גורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2; מימין למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים פרה-קליניים חיוניים להערכת מטרות טיפוליות חדשות ואסטרטגיות טיפול חדשניות בגליובלסטומה. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית עבור GBM הם בעלי יתרון של הופעת הגידול באתר האוטוכתוני, אך לעתים קרובות עם חביון ארוך וצמיחת גידול בלתי צפויה13. גידולי מודל GEM מציגים שיהוי של 4-5 חודשים, וחלון הזמן האידיאלי להדמיה, גיוס וטיפול משתנה בקרב עכברים בודדים. למודל האורתוטופי יש ציר זמן מבוסס היטב ומתמשך של צמיחה וטיפול של 4-5 שבועות, וגידולים מזוהים באופן אמין על ידי MRI לאחר השתלה. השימוש במודלים אורתוטופיים הנגזרים מ-GEM מאפשר למקם את הגידול במיקום המדויק בכל עכבר, כמו גם בקרה זמנית על התחלת צמיחת הגידול, תוך שמירה על היתרון של מיקרו-סביבת המוח הסובבת. במודל האורתוטופי TRP, מסלולי RTK, PTEN ו- RB מופעלים מייצרים מודל גידול המשחזר את התכונות ההיסטולוגיות של GBM אנושי. בדומה לגליובלסטומה אנושית, גידולי GBM אורתוטופיים TRP מציגים תכונות של צמיחה אגרסיבית, כגון מוקדים נמקיים המוקפים בתאים ניאופלסטיים פסאודופליסאדיים וניאו-וסקולריזציה. גידולים פולשניים גם לתוך פרנכימה המוח שמסביב. לכן, סוכנים שעשויים לדכא חדירת הגידול והגירה בחולים ניתן להעריך באופן טרום קליני בגידולים אורתוטופיים TRP. תהליך הזרקת תאים מגידולי GEM פולשניים לעכברים סינגניים דורש זהירות מיוחדת, כדי למנוע דליפה לא מכוונת וצמיחה של תאים מחוץ לאזור היעד. השיטה המתוארת כאן, כאשר היא מיושמת באופן שגרתי, יכולה לשמש ליצירת קבוצות גדולות של עכברים נושאי גידול עם צמיחה עקבית של הגידול.
שלבים קריטיים בפרוטוקול שעשויים להשפיע על הזרקת גידול מוצלחת כוללים הסרת המחט מהמוח לאחר הזרקת תאים ושימוש בשעוות עצם. יש להחדיר ולהסיר את המחט 1 מ"מ בכל פעם (כמתואר בשלבים 5 ו-6), כדי למנוע נזק נוסף לרקמת המוח שמסביב ודליפה של תאים שיוריים או זרימה חוזרת של התרחיף המוזרק14. השימוש בשעוות עצם מותכת כדי לסתום ולאטום את חור המחט יוצר מחסום למניעת דליפת תאים, וכך גם השתלת תאים בתרחיף מתילצלולוז. חשוב לציין, יש לערבב מתילצלולוז בתמיסה חוצצת כגון PBS (או לחילופין, מדיה נטולת סרום) לפני השעיית תאי המוח. בנוסף, השימוש בהרדמה באינהלציה עדיף על פני הרדמה בהזרקה, כדי לקצר את זמן ההחלמה.
שימו לב שגודל הראש עשוי להשתנות מעט בין זני עכברים, או לפי גיל ומין; לכן, ייתכן שיהיה צורך לכייל מחדש את הציוד הסטריאוטקטי בעת מעבר מסוג קבוצת עכבר אחת לאחרת. אנו ממליצים גם על אופטימיזציה של מספר התא להזרקה עבור כל קו תאים שמעניין מספר קטן של עכברים לפני שממשיכים עם קבוצה גדולה. בהשוואה לקסנוגרפטים אנושיים, גידולי מורין עשויים לגדול באגרסיביות כאשר הם מושתלים מחדש בעכברים תואמי זן ודורשים פחות תאים להזרקה, כפי שראינו עם קווי TRP.
יתרון מרכזי של הזרקת מוח אורתוטופית בהשוואה לייזום וצמיחה של גליובלסטומה במודל GEM הוא שהרקמה המקיפה את הגידול המוזרק היא תקינה, וניתן להעריך פולשניות מקומית על ידי היסטופתולוגיה. עם זאת, איננו יכולים לשלול שינויים במיקרו-סביבה עקב פצע ההזרקה עצמו, אשר עשויים לגרום לתגובה דלקתית מקומית או הפרעה של מחסום הדם-מוח.
לסיכום, מודלים אורתוטופיים מאפשרים מחקר של GBM, עם לוח זמנים סביר לטיפול ובהקשר של מיקום הגידול הטבעי. המודל שלנו משחזר תכונות GBM אנושיות אך בעכבר כשיר חיסון; לכן, ניתן לנתח את המיקרו-סביבה החיסונית ביחס לצמיחת הגידול, או בתגובה לאימונותרפיה. צמיחת הגידול היא אגרסיבית ופולשנית, בניגוד למודלים רבים של קסנוגרפט GBM שבהם הגידול נשאר עטוף ואינו מציג את המאפיינים ההיסטולוגיים של GBM 13,15,16 אנושי. כאשר מבוצע כראוי, ההליך המתואר כאן מביא לגידול אמין ללא דליפת תאים או התפשטות מחוץ לגולגולת.
לבסוף, למרות שפרוטוקול זה עבר אופטימיזציה בהקשר של GBM כמודל עכבר אורתוטופי, ניתן להתאים את הדיוק והיישום האמין שלו בתרגום פרה-קליני למודלים של תת-מחלקות אחרות של גידולי מוח. שיטות וריאגנטים בפרוטוקול זה יכולים לשמש עבור שתלים מסוג תאים שונים הנושאים מוטציות עבור מודל הגידול במוח המעניין (למשל, גליומה מפושטת בקו האמצע17), עם התאמה של קואורדינטות סטריאוטקסיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה למר אלן א. קולאגה על הסיוע הטכני המצוין ולגב' מישל ל. גומפרכט על שליטוש טכניקות הניתוח. אנו מודים לד"ר פיליפ ל. מרטין על ניתוח פתולוגיה ולגב' ליליה אילבה וד"ר ג'וזף קלן מהתוכנית הלאומית לדימות בעלי חיים קטנים במעבדה הלאומית פרדריק עבור סריקות MRI.
פרויקט זה מומן במלואו או בחלקו במימון פדרלי מהמכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת חוזה מס' HHSN261201500003I. התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, וגם אזכור שמות מסחריים, מוצרים מסחריים או ארגונים אינו מרמז על תמיכה מצד ממשלת ארה"ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al.
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G.
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , Exon Publications. (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J.
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
