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Cancer Research

ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म के ट्रांसलेशनल ऑर्थोटोपिक मॉडल

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64482
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Advanced Preclinical Research, Frederick National Laboratory for Cancer Research, National Cancer Institute

Summary

यहां, हम जीबीएम के लिए एक प्रीक्लिनिकल ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल का वर्णन करते हैं, जो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं के इंट्राक्रैनील इंजेक्शन द्वारा स्थापित है। यह मॉडल मानव जीबीएम के रोग हॉलमार्क प्रदर्शित करता है। ट्रांसलेशनल अध्ययन के लिए, माउस ब्रेन ट्यूमर को विवो एमआरआई और हिस्टोपैथोलॉजी में ट्रैक किया जाता है।

Abstract

मानव ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म (जीबीएम) के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल मस्तिष्क ट्यूमर के विकास और प्रगति को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। जेनोग्राफ्ट ट्यूमर के विपरीत, जीईएम में, ट्यूमर एक इम्यूनोसक्षम माउस में देशी माइक्रोएन्वायरमेंट में उत्पन्न होते हैं। हालांकि, प्रीक्लिनिकल उपचार अध्ययनों में जीबीएम जीईएम का उपयोग लंबे ट्यूमर लेटेंसी, नियोप्लाज्म आवृत्ति में विषमता और उन्नत ग्रेड ट्यूमर के विकास के समय के कारण चुनौतीपूर्ण है। इंट्राक्रैनील ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के माध्यम से प्रेरित चूहे प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए अधिक साध्य हैं, और जीईएम ट्यूमर की विशेषताओं को बनाए रखते हैं। हमने आरबी, क्रास और पी 53 विपथन (टीआरपी) के साथ जीईएम मॉडल से प्राप्त एक ऑर्थोटोपिक ब्रेन ट्यूमर मॉडल उत्पन्न किया, जो नियोप्लास्टिक कोशिकाओं द्वारा नेक्रोसिस के रैखिक फॉसी को प्रदर्शित करने वाले जीबीएम ट्यूमर विकसित करता है, और मानव जीबीएम के अनुरूप घने वैस्कुलराइजेशन को प्रदर्शित करता है। जीईएम जीबीएम ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं को जंगली-प्रकार, तनाव-मिलान प्राप्तकर्ता चूहों में इंट्राक्रैनियल रूप से इंजेक्ट किया जाता है और ग्रेड IV ट्यूमर को पुन: पेश किया जाता है, इसलिए जीईएम चूहों में लंबी ट्यूमर विलंबता अवधि को दरकिनार किया जाता है और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए बड़े और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य समूहों के निर्माण की अनुमति मिलती है। जीबीएम के लिए टीआरपी जीईएम मॉडल की अत्यधिक प्रोलिफ़ेरेटिव, इनवेसिव और संवहनी विशेषताओं को ऑर्थोटोपिक ट्यूमर में पुन: प्रस्तुत किया जाता है, और हिस्टोपैथोलॉजी मार्कर मानव जीबीएम उपसमूहों को दर्शाते हैं। सीरियल एमआरआई स्कैन द्वारा ट्यूमर के विकास की निगरानी की जाती है। इम्यूनोसक्षम मॉडल में इंट्राक्रैनील ट्यूमर की आक्रामक प्रकृति के कारण, एक्स्ट्राक्रैनियल ट्यूमर के विकास को रोकने के लिए यहां उल्लिखित इंजेक्शन प्रक्रिया का सावधानीपूर्वक पालन करना आवश्यक है।

Introduction

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम; ग्रेड IV ग्लियोमा) सबसे आम और घातक मस्तिष्क ट्यूमर है, और वर्तमान उपचार अप्रभावी हैं, जिसके परिणामस्वरूप 15 महीने का औसत अस्तित्वहै। विश्वसनीय और सटीक प्रीक्लिनिकल मॉडल जो मस्तिष्क ट्यूमर के विकास और रोगजनन में शामिल जटिल सिग्नलिंग मार्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जीबीएम के लिए नए चिकित्सीय आहार के मूल्यांकन में प्रगति में तेजी लाने के लिए आवश्यक हैं। माउस मॉडल जिसमें मानव मस्तिष्क ट्यूमर सेल लाइनों को इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है, मस्तिष्क ट्यूमर के मूल प्रतिरक्षा वातावरण को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, न ही उनका उपयोग रक्त-मस्तिष्क बाधा2 को पार करने के लिए चिकित्सीय की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। आदर्श रूप से, प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल को मानव जीबीएम हिस्टोपैथोलॉजी को भी बारीकी से पुन: पेश करना चाहिए, जिसमें आसपास के पैरेन्काइमा3 में आक्रामकता का उच्च स्तर शामिल है। यद्यपि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली के संदर्भ में ट्यूमर विकसित करते हैं, जटिल प्रजनन योजनाओं की अक्सर आवश्यकता होती है, और ट्यूमर धीरे-धीरेऔर असंगत रूप से विकसित हो सकते हैं। जीईएम-व्युत्पन्न एलोग्राफ्ट मॉडल प्रीक्लिनिकल चिकित्सीय अध्ययनों के लिए बेहतर अनुकूल हैं, जहां कम समय सीमा में ट्यूमर-असर चूहों के बड़े समूहों की आवश्यकता होती है।

पिछली रिपोर्ट में, हमने जीईएम ट्यूमर से सीधे प्राप्त एक ऑर्थोटोपिक जीबीएम माउस मॉडल का वर्णन किया। जीईएम में ट्यूमरजेनिसिस कोशिका आबादी (मुख्य रूप से एस्ट्रोसाइट्स) में आनुवंशिक घटनाओं से शुरू होता है जो ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) को व्यक्त करता है, जिसके परिणामस्वरूप जीबीएम की प्रगति होती है। इन टीआरपी जीईएम में एक टीजीजीजेडटी 121 ट्रांसजीन (टी) होता है, जो जीएफएपी-संचालित क्रे रिकोम्बिनेस के संपर्क में आने के बाद टी 121 को व्यक्त करता है। टी 121 प्रोटीन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप आरबी (आरबी 1, पी 107, और पी 103) प्रोटीन गतिविधि का दमन होता है। जीएफएपी-संचालित क्रे ट्रांसजेन (जीएफएपी-सीआरईआरटी 2) की सह-अभिव्यक्ति टैमोक्सीफेन के साथ प्रेरण के बाद वयस्क एस्ट्रोसाइट्स को अभिव्यक्ति को लक्षित करती है। टीआरपी चूहों में क्रे-निर्भर उत्परिवर्ती क्रास (क्रास जी 12 डी; क्रासजी 12 डी) भी होता है। आर) एलील, रिसेप्टर टायरोसिन किनेज मार्ग के सक्रियण का प्रतिनिधित्व करने के लिए, और पीटीएन (पी) 5,6 के नुकसान के लिए विषम युग्मित हैं। रिसेप्टर टायरोसिन किनेज (आरटीके), पीआई 3 के और आरबी नेटवर्क में समवर्ती जीन विपथन जीबीएम रोगजनन7 के 74% में फंसे हुए हैं। इसलिए, मानव जीबीएम में परिवर्तित प्राथमिक सिग्नलिंग मार्गों को टीआरपी चूहों में इंजीनियर उत्परिवर्तन द्वारा दर्शाया जाता है, विशेष रूप से जीबीएम ट्यूमर, जिसमें आरटीके के साझा डाउनस्ट्रीमलक्ष्य सक्रिय होते हैं।

जीईएम-व्युत्पन्न सिंजेनिक ऑर्थोटोपिक मॉडल को एक मॉडल के रूप में मान्य किया गया था जो जीबीएम में असामान्य मार्गों को लक्षित करने वाले कैंसर चिकित्सीय का मूल्यांकन करने के लिए एक मंच के रूप में उपयोग के लिए इनवेसिवनेस और उपप्रकार बायोमार्कर की उपस्थिति सहित मानव मस्तिष्क ट्यूमर की विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करता है। कोशिकाओं को टीआरपी दिमाग से काटे गए ट्यूमर से सुसंस्कृत किया गया था और कॉर्टेक्स में इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के लिए स्टीरियोटैक्टिक उपकरण का उपयोग करके तनाव-मिलान वाले चूहों के मस्तिष्क में फिर से प्रत्यारोपित किया गया था। इस प्रीक्लिनिकल ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल ने जीबीएम ट्यूमर विकसित किए जो उच्च माइटोटिक दर के साथ अत्यधिक सेलुलर, इनवेसिव, प्लियोमॉर्फिक थे, और नियोप्लास्टिक कोशिकाओं और घने वैस्कुलराइजेशन द्वारा नेक्रोसिस के रैखिक फॉसी को प्रदर्शित करते थे, जैसा कि मानव जीबीएम के लिए देखा गया था। ट्यूमर की मात्रा और विकास को विवो चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) में मापा गया था।

इस रिपोर्ट में, हम एक उदाहरण के रूप में टीआरपी ट्यूमर का उपयोग करते हुए, जंगली प्रकार के माउस मस्तिष्क में प्राथमिक जीबीएम कोशिकाओं या सेल लाइनों के इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के लिए इष्टतम तकनीक का वर्णन करते हैं। एक ही प्रोटोकॉल इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों और अन्य जीबीएम सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सामान्य नुकसान से बचने के लिए महत्वपूर्ण सुझाव दिए जाते हैं, जैसे कि इंजेक्शन साइट पर सबऑप्टिमल सेल तैयारी या सेल रिसाव, और मॉडल प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए स्टीरियोटैक्टिक उपकरण का सही ढंग से उपयोग करने के लिए। ट्रांसलेशनल उद्देश्यों के लिए, हम जीवित जानवरों में मस्तिष्क ट्यूमर के विकास का एमआरआई पता लगाने, हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन, और ट्यूमर-असर चूहों में उपचार का एक उदाहरण प्रस्तुत करके मॉडल को मान्य करते हैं।

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Protocol

यहां वर्णित अध्ययन प्रोटोकॉल फ्रेडरिक पशु देखभाल और उपयोग समिति में एनसीआई द्वारा अनुमोदित किया गया था। एनसीआई-फ्रेडरिक एएएलएसी इंटरनेशनल द्वारा मान्यता प्राप्त है और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति का पालन करता है। पशु देखभाल "प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड (राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद, 2011) में उल्लिखित प्रक्रियाओं के अनुसार प्रदान की गई थी। राष्ट्रीय अकादमियों प्रेस, वाशिंगटन डीसी)।

1. इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं की तैयारी

नोट: इस मॉडल के लिए उपयोग किए जाने वाले माउस ब्रेन ट्यूमर प्राथमिक कोशिकाओं (एमबीआर) को मूल रूप से टैमोक्सीफेन प्रेरित टीआरपी जीईएम चूहों से अलग किया गया था, जैसा कि एल मेस्किनी एट अल.5 में वर्णित है। सेल की तैयारी पर विवरण इस संदर्भ में पाया जा सकता है।

  1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ तकनीक का उपयोग करके निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
  2. विट्रो में प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं को तब तक कल्चर करें जब तक कि वे घातीय विकास चरण तक नहीं पहुंच जाते।
  3. कोशिकाओं को 0.25% ट्रिप्सिन में काट लें, और एक बार जब वे अलग हो जाएं, तो ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए उन्हें विकास माध्यम से पतला करें।
  4. 400 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को पेलेट करें और सीरम-मुक्त मीडिया से धो लें। मतगणना से पहले एक बार दोहराएं।
  5. कक्षों को मैन्युअल रूप से या स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिनें। 2 μL की अंतिम इंजेक्शन मात्रा के आधार पर, वांछित एकाग्रता पर वांछित एकाग्रता पर 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 5% बाँझ मिथाइलसेल्यूलोज में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। वांछित सेल एकाग्रता सेल लाइन और मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल के आधार पर भिन्न हो सकती है। जीबीएम जीईएम टीआरपी कोशिकाओं के लिए, हम 25 x 106 कोशिकाओं / मिलीलीटर समाधान, या 50,000 कोशिकाओं के 2 μL इंजेक्ट करते हैं।

2. माउस तनाव

  1. एक उपयुक्त माउस स्ट्रेन नस्ल या खरीदें जो मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं की तनाव पृष्ठभूमि से मेल खाता है। टीआरपी कोशिकाओं के लिए, ट्यूमर सेल प्राप्तकर्ताओं के रूप में 9 सप्ताह के बी 6 डी 2 एफ 1 / जे चूहों (सी 57बीएल / 6 जे [बी 6] महिलाओं और डीबीए / 2 जे [डी 2] पुरुषों के बीच एक क्रॉस से) का उपयोग करें।

3. सर्जिकल क्षेत्र की स्थापना

नोट: सभी सर्जिकल चरण एक स्वच्छ, स्वच्छ वातावरण में सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करके आयोजित किए जाते हैं। मास्क सहित स्क्रब और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, सर्जन द्वारा पहना जाना चाहिए। उपयोग करने से पहले सर्जिकल उपकरणों को गर्मी-निष्फल किया जाना चाहिए।

  1. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के नीचे और काम की सतह पर सतह रक्षक रखें।
  2. एनेस्थीसिया मशीन से विनाइल टयूबिंग को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के गैस एनेस्थीसिया प्लेटफॉर्म के आईएन पोर्ट में संलग्न करें, और एक और ट्यूब को आउट पोर्ट में संलग्न करें।
  3. डिजिटल प्रदर्शन को पावर स्रोत और उपकरण से कनेक्ट करें।
  4. माइक्रोपंप नियंत्रक (चित्रा 1 ए) को एक बिजली स्रोत से कनेक्ट करें और माइक्रोपंप (चित्रा 1 ए) को उपकरण के मैनिपुलेटर आर्म से संलग्न करें (निर्माता निर्देश भी देखें)।
  5. 2,000 nL वॉल्यूम इंजेक्शन के लिए माइक्रोपंप को 5.6 nL / s पर सेट करें।
  6. गर्म मोती स्टरलाइज़र चालू करें।
  7. माउस हीटिंग पैड को तापमान नियंत्रक में प्लग करें और पावर स्रोत से कनेक्ट करें। प्लेट को मंच मंच पर रखें। प्लेट का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  8. बुलबुले पेश न करने के लिए सावधान रहें, 30 ग्राम सटीक सिरिंज को बैकलोड करें। प्लंजर डालें और सुई संलग्न करें। सुई को केवल हब द्वारा पकड़ना सुनिश्चित करें। प्लंजर को तब तक दबाएं, जब तक कि मिथाइलसेल्यूलोज सेल मिश्रण की एक बूंद सुई के माध्यम से बाहर न निकल जाए। सुई के किनारों को सावधानीपूर्वक पोंछकर, या काम की सतह पर एक बाँझ धुंध पैड रखकर और इसे सोखकर 70% अल्कोहल तैयारी पैड के साथ सुई को साफ करें। ध्यान रखें कि सुई को मोड़ें या न तोड़ें।
  9. माउस को मंच पर रखने से पहले सिरिंज-सुई विस्थापन को रोकने के लिए, माइक्रोपंप में सटीक सिरिंज संलग्न करें और मैनिपुलेटर आर्म को मंच से दूर घुमाएं।

4. सर्जरी के लिए माउस तैयार करना

  1. माउस को 2.5% या संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र सेट के साथ प्रेरण कक्ष में रखकर एनेस्थेटाइज करें। नोजकोन में आइसोफ्लुरेन प्रवाह चालू करें।
  2. माउस को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में स्थानांतरित करें और नोजकोन को सुरक्षित करें, जिसमें शीर्ष दांत नोजकोन सपोर्ट पर स्थित हों (चित्रा 1 बी, 9)। सुरक्षित करने के लिए नाक पर नॉब को कस ें (चित्रा 1 बी)। रिफ्लेक्स की जांच के लिए पैर की अंगुली की चुटकी करके संज्ञाहरण का एक उचित स्तर सुनिश्चित करें।
    1. पर्याप्त ऑक्सीकरण सुनिश्चित करने के लिए रंग (गुलाबी) के लिए कान, पैर और श्लेष्म झिल्ली की निगरानी करें। इसके अलावा, श्वसन दर की निगरानी करें (एक वृद्धि या कमी आइसोफ्लुरेन स्तरों को समायोजित करने की आवश्यकता का संकेत दे सकती है)।
  3. दोनों कानों में ईयर बार (चित्रा 1 बी) डालें और सिर को सुरक्षित करने के लिए नॉब को कस लें।
  4. माउस एनेस्थीसिया के तहत होने पर आंखों को चिकनाई देने के लिए आंखों का मरहम लागू करें।
  5. पर्याप्त सड़न रोकनेवाली स्थिति सुनिश्चित करने के लिए, माउस के सिर पर बालों को नियोजित चीरा से लगभग 150% बड़े क्षेत्र में तोड़ने के लिए घुमावदार बल का उपयोग करें।
  6. 0.5-1 मिलीग्राम / किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन एसआर एनाल्जेसिया को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें, या किसी अन्य प्रोटोकॉल-अनुमोदित एनाल्जेसिक का उपयोग करें।
  7. आंतरिक तापमान की निगरानी करने और संज्ञाहरण के कारण हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए माउस रेक्टल प्रोब को रखें। माउस शरीर का तापमान 36.5 और 38.5 डिग्री सेल्सियस के बीच रखें।
  8. सर्जिकल स्क्रब और इथेनॉल के बीच तीन बार बारी-बारी से, बाहरी सर्कल का उपयोग करके सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें।
  9. त्वचा को तना हुआ खींचने के लिए बल का उपयोग करके, आंखों के बीच से शुरू होने वाले स्केलपेल ब्लेड के साथ लगभग 1 सेमी का चीरा लगाएं। ब्रेग्मा चीरे के माध्यम से दिखाई देना चाहिए।
    नोट: उचित बाँझ तकनीक के लिए, सर्जिकल साइट को केवल निष्फल उपकरणों की युक्तियों के साथ स्पर्श करें, और उपकरण युक्तियों को केवल बाँझ सतह पर रखें (जैसे कि एक आटोक्लेव टूल पैक के अंदर)।
  10. अतिरिक्त संयोजी ऊतक को दूर करने के लिए कपास युक्त एप्लिकेटर के लकड़ी के छोर का उपयोग करें, और फिर सूखने के लिए किसी अन्य एप्लिकेटर के कपास छोर का उपयोग करें।

5. सेल इंजेक्शन

  1. माउस के ऊपर सिरिंज अटैचमेंट के साथ मैनिपुलेटर आर्म को वापस करें, नॉब को सुरक्षित करने के लिए कस दें। ब्रेग्मा पर सिरिंज माउंट को स्थानांतरित करने के लिए क्षैतिज विमान में एक्स और वाई नॉब्स का उपयोग करें। ब्रेग्मा स्थिति की पुष्टि करने के लिए जेड नॉब का उपयोग करके सुई को कम करें। डिजिटल रीडआउट कंसोल को शून्य पर सेट करें।
  2. सुई को वांछित स्थिति में ले जाने के लिए एक्स और वाई नॉब्स और संबंधित डिजिटल रीडआउट का उपयोग करें। कॉर्टिकल कॉर्टेक्स स्थान के लिए, उपयुक्त निर्देशांक 3 मिमी पीछे, ब्रेग्मा के 2 मिमी पार्श्व दाएं और ड्यूरा मैटर से 2 मिमी गहरे हैं। सुई को खोपड़ी की सतह पर ले जाने के लिए जेड नॉब का उपयोग करें।
  3. संलग्न 25 ग्राम सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके खोपड़ी में एक छेद को पंचर करें। सुई के बेवेल को 30 ग्राम सटीक सिरिंज और सुई की ओर रखें, और मैनिपुलेटर आर्म को सावधानी पूर्वक साइड में घुमाएं। अंगूठे और उंगली का उपयोग करके, सुई को धीरे-धीरे आगे और पीछे हल्के दबाव के साथ तब तक रोल करें जब तक कि सुई की नोक सिर्फ खोपड़ी की टोपी को छेद न दे।
  4. सुई के छेद से किसी भी रक्त को दूर करने के लिए एक कपास युक्त एप्लिकेटर का उपयोग करें। छेद के ऊपर भरी हुई सटीक सिरिंज सुई के साथ मैनिपुलेटर आर्म को उपयुक्त स्थिति में बदलें। सुई की नोक को छेद के साथ संरेखित करें, सुई को मस्तिष्क ड्यूरा तक नीचे करने के लिए जेड नॉब का उपयोग करें, और डिजिटल रीडआउट कंसोल को शून्य पर सेट करें।
  5. जेड नॉब का उपयोग करके, सुई को 1 मिमी कम करें, और फिर 1 मिनट प्रतीक्षा करें। वांछित गहराई तक पहुंचने तक दोहराएं (2 मिमी जैसा कि संकेत दिया गया है)।
    नोट: सुई को धीरे-धीरे नीचे उतारा जाता है ताकि आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों और सेल समाधान के बैक-फ्लो को अतिरिक्त नुकसान को रोका जा सके।
  6. माइक्रोपंप शुरू करें, और फिर यह सुनिश्चित करने के लिए निगरानी करें कि पंप बंद हो जाता है जब 2 μL इंजेक्ट किया गया है। इस प्रक्रिया को संकेतित गति पर लगभग 6 मिनट लगना चाहिए। फिर, सुई को हिलाने से पहले 1 मिनट प्रतीक्षा करें।

6. सुई को हटाना और घाव बंद करना

  1. सुई को 1 मिमी ऊपर उठाएं और फिर 1 मिनट प्रतीक्षा करें। तब तक दोहराएं जब तक कि सुई खोपड़ी से पूरी तरह से मुक्त न हो जाए।
  2. यदि आवश्यक हो, तो इंजेक्शन साइट से किसी भी रक्त को दूर करने के लिए एक कपास-टिंप एप्लिकेटर का उपयोग करें।
  3. एक कपास-टिंप एप्लिकेटर के लकड़ी के छोर का उपयोग करके, हड्डी के मोम (~ 1 मिमी) का एक छोटा टुकड़ा लें और इसे शंकु में आकार दें। इसे खोपड़ी में उद्घाटन में रखें, मोम को छेद में धकेलें।
  4. एक मोती स्टेरिलाइज़र का उपयोग करके गर्मी डालें और खोपड़ी पर शेष मोम को पिघलाने और इसे चिकना करने के लिए उनका उपयोग करें।
  5. चीरे में बुपिवैकेन (एनेस्थेटिक) घोल की लगभग दो बूंदें रखें और त्वचा के किनारों को एक साथ खींचने के लिए बल का उपयोग करें।
  6. त्वचा को तना हुआ खींचें और त्वचा को बंद करने के लिए एक या दो घाव क्लिप रखें।
  7. माउस को ड्राफ्ट-मुक्त क्षेत्र में हीटिंग पैड पर एक साफ रिकवरी पिंजरे में रखें, और माउस का बारीकी से निरीक्षण करें। माउस को नियमित आवास में लौटने से पहले, सामान्य गतिविधि को फिर से शुरू करते हुए, संज्ञाहरण से पूरी तरह से जागने की अनुमति दें।
  8. संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार, सर्जिकल प्रक्रिया के बाद रोजाना माउस की जांच करें और दर्द प्रबंधन का प्रबंधन करें।
    1. यदि ब्यूप्रेनोर्फिन एसआर (चरण 4.6) का उपयोग एनाल्जेसिया के लिए किया जाता है, तो निरंतर-रिलीज फॉर्मूला 72 घंटे तक रहता है। इंजेक्शन को केवल तभी दोहराएं जब 72 घंटे के बाद दिखाई देने वाला दर्द या असुविधा मौजूद हो। जब सही तरीके से प्रदर्शन किया जाता है, तो चूहे इंट्राक्रैनील इंजेक्शन से अच्छी तरह से ठीक हो जाते हैं और अतिरिक्त एनाल्जेसिया की आवश्यकता नहीं होती है।
    2. सर्जरी के 7-10 दिन बाद स्टेपल को हटा दें।
  9. लाइव पशु इमेजिंग (एमआरआई) द्वारा ट्यूमर के विकास की निगरानी करें।
    1. जब मानवीय समापन बिंदु तक पहुंच जाते हैं तो चूहों को इच्छामृत्यु दें (यानी, यदि जानवर 20% शरीर का वजन खो देता है या हाइपोथर्मिक हो जाता है)।
    2. इन मस्तिष्क ट्यूमर की आक्रामक प्रकृति के कारण, न्यूरोलॉजिकल लक्षणों के लिए चूहों का निरीक्षण करें, जैसे कि असमान चाल, आंशिक पक्षाघात, कताई, या सिर झुकाव। यदि उन्नत ट्यूमर के विकास के इन नैदानिक संकेतों में से कोई भी देखा जाता है तो एक माउस को इच्छामृत्यु दें।

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Representative Results

ब्रेन ट्यूमर कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों को ट्यूमर के विकास के संकेतों जैसे दौरे, गतिभंग या वजन घटाने के लिए दैनिक निगरानी की जानी चाहिए। नियमित अंतराल पर एमआरआई स्कैनिंग द्वारा ब्रेन ट्यूमर के विकास की निगरानी भी की जा सकती है। साप्ताहिक एमआरआई स्कैन मस्तिष्क और ट्यूमर की मात्रा माप (चित्रा 1 सी) के भीतर बढ़ते ट्यूमर के बोझ के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। विशेष रूप से, टीआरपी ट्यूमर आक्रामक विकास का प्रदर्शन करते हैं, और 3 डी ट्यूमर की मात्रा 2 से 3 सप्ताह के भीतर एमआरआई द्वारा मापने योग्य होती है इंट्राक्रैनील इंजेक्शन (30 से 40 मिमी3 की औसत मात्रा के साथ)। एक प्रतिनिधि अध्ययन में, मस्तिष्क ट्यूमर-असर चूहों के एक समूह को नियंत्रण बनाम विकिरण चिकित्सा के लिए दो समूहों में विभाजित किया गया था; एमआरआई ट्यूमर की मात्रा माप ने विकिरण उपचार (चित्रा 2 ए) के बाद ट्यूमर के विकास दमन की कमी का खुलासा किया, जिसके परिणामस्वरूप इलाज किए गए चूहों के लिए जीवित रहने में कोई वृद्धि नहीं हुई (चित्रा 2 बी)।

नेक्रोपसी में, ट्यूमर एक सूजे हुए दाहिने गोलार्ध (चित्रा 3 ए, मध्य पैनल) के भीतर मस्तिष्क पर एक अंधेरे स्थान के रूप में दिखाई दे सकता है, या बड़े ट्यूमर के मामले में, एक उभरे हुए, अंधेरे क्षेत्र के रूप में। हिस्टोपैथोलॉजी विश्लेषण के लिए, इंजेक्शन साइट क्षेत्र (चित्रा 3 ए) के माध्यम से सेक्शनिंग ट्यूमर के विकास और गैर-घातक मस्तिष्क ऊतक में आक्रमण की सीमा के इष्टतम मूल्यांकन की अनुमति देता है। सिंजेनिक मॉडल में जीबीएम ट्यूमर आक्रामक रूप से बढ़ सकते हैं और टर्मिनल समापन बिंदु द्वारा खोपड़ी को तोड़ सकते हैं, जिसे नेक्रोपसी में देखा जा सकता है। इसके विपरीत, सेल आरोपण के तुरंत बाद एक्स्ट्राक्रेनियल वृद्धि संभवतः इंजेक्शन के दौरान कोशिकाओं के रिसाव को इंगित करती है, जिसे एमआरआई स्कैन (चित्रा 3 बी) पर या सिर पर गुंबददार क्षेत्र द्वारा एक लाइव माउस में देखा जा सकता है। सुई को इंजेक्शन साइट से बहुत जल्दी हटा दिया गया हो सकता है ( अनुभाग 6 देखें)। हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन द्वारा इंजेक्शन साइट पर रिसाव के रूप में एक्स्ट्राक्रैनियल वृद्धि की पुष्टि की जाती है।

टीआरपी ऑर्थोटोपिक मॉडल में, हिस्टोपैथोलॉजी ने ग्रेड IV एस्ट्रोसाइटोमा / जीबीएम की उपस्थिति की पुष्टि की, जिसमें टीआरपी जीईएम ट्यूमर जैसे स्यूडोपैलिसेडिंग और नेक्रोसिस में देखी गई विशिष्ट विशेषताओं का पुनर्मूल्यांकन शामिल है (चित्रा 4)। मानव जीबीएम उपवर्गीकरण के लिए वर्णित जीबीएम तंत्रिका स्टेम सेल और पूर्वज मार्करों का मूल्यांकन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (चित्रा 5) द्वारा किया गया था। ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) की व्यापक अभिव्यक्ति एस्ट्रोसाइटिक पूर्वज मूल के एक प्रोलिफेरेटिव ट्यूमर को इंगित करती है, जबकि नेस्टीन और सॉक्स -2 न्यूरोनल पूर्वज मार्कर स्थापित हैं, और ओलिग -2 अभिव्यक्ति ऑलिगोडेंड्रोसाइटिक मूल 5,7 की कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करती है। सभी चार मार्कर मानव जीबीएम8 के उपप्रकारों में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: इंट्राक्रैनील इम्प्लांट उपकरण सेटअप और सीरियल एमआरआई द्वारा कल्पना की गई टीआरपी जीबीएम ट्यूमर की वृद्धि। (ए) इंट्राक्रैनील प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक विभिन्न तत्वों के साथ उपकरण सेटअप (1 से 11 वर्णित); विशिष्ट माउस हेड प्लेसमेंट और इनहेलेशन एनेस्थीसिया यूनिट (बी) में बढ़ाया जाता है। साप्ताहिक इमेजिंग एक कस्टम-निर्मित चार माउस सेंस सरणी सतह कॉइल 5,9 के साथ एमआरआई 3.0 टी नैदानिक स्कैनर पर किया गया था। मल्टी-स्लाइस टी 2-भारित टर्बो स्पिन इको (टी 2 डब्ल्यू-टीएसई) अनुक्रम: (टीआर / टीई (4437/100 एमएस), विमान रिज़ॉल्यूशन (0.12 x 0.15 मिमी), स्लाइस मोटाई (0.5 मिमी), सेंस त्वरण कारक (4) छवियों को पूरे माउस मस्तिष्क को कवर करने के लिए अक्षीय विमान में प्राप्त किया गया था। प्रत्यारोपण के बाद 3, 4 और 5 सप्ताह में ट्यूमर से कोरोनल अनुभाग दिखाए गए हैं। एमआरआई छवियों के लिए एक प्रतिनिधि स्केल बार नीचे दाईं ओर (सी) में इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विकिरण उपचार के साथ एक ऑर्थोटोपिक जीबीएम मॉडल का प्रतिनिधि प्रभावकारिता अध्ययन। (ए) एमआरआई स्कैन से गणना की गई त्रि-आयामी ट्यूमर वॉल्यूम, सप्ताह 2, 3, और 4 पोस्ट-ट्यूमर प्रत्यारोपण के अनुरूप। एमआरआई छवियों के विश्लेषण के माध्यम से मस्तिष्क ट्यूमर की मात्रा को मापा गया था। ITK_SNAP कार्यक्रम में एमआरआई छवि अपलोड करने के बाद, छवि कंट्रास्ट और छवि तीव्रता क्षेत्र फ़िल्टर को समायोजित किया गया था। सक्रिय समोच्च प्रारंभिककरण और छवि विभाजन के बाद, ट्यूमर की मात्रा को क्यूबिक मिमिटर्स में मापा गया था। विकिरण द्वारा इलाज किए गए व्यक्तिगत नियंत्रण (अनुपचारित) चूहों और चूहों (कुल 15 GY के लिए 5 दिनों के लिए प्रति दिन 3 Gy) को प्लॉट किया जाता है। (बी) नियंत्रण की तुलना में विकिरण-उपचारित चूहों का अस्तित्व। जीवित रहने के प्रतिशत की गणना ग्राफिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) के साथ कुल एन = 11 अनुपचारित चूहों और एन = 12 विकिरण-उपचारित चूहों से की गई थी। हमारे संस्थागत दिशानिर्देशों के आधार पर अध्ययन चूहों को मानवीय समापन बिंदु तक पहुंचने के रूप में इच्छामृत्यु दी गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: नेक्रोपसी में मस्तिष्क में ट्यूमर का स्थान। (ए) दाहिने माउस गोलार्ध में ट्यूमर के विकास का सही स्थान। बाएं पैनल अध्ययन समाप्ति पर एमआरआई स्कैन से मस्तिष्क के भीतर एक ट्यूमर का एक उदाहरण दिखाता है; लाल तीर ट्यूमर के स्थान को इंगित करता है। विच्छेदित माउस मस्तिष्क को खोपड़ी (मध्य पैनल) के भीतर दिखाया जाता है और कपाल गुहा (दाएं पैनल) से हटा दिया जाता है। मध्य पैनल में, नीले तीर इंजेक्शन साइट के सुई प्रभाव को इंगित करते हैं, और दोहरे सिर वाले तीर ऊतक विज्ञान के लिए काटे गए मस्तिष्क के अनुशंसित स्थान को इंगित करते हैं, दाहिने गोलार्ध को दो भागों में विभाजित करते हैं। मस्तिष्क के दोनों हिस्सों को पैराफिन में "खुली किताब" फैशन में एम्बेडेड किया जाता है। धराशायी रेखा एक संदर्भ के रूप में दो मस्तिष्क गोलार्धों को अलग करने वाली औसत अनुदैर्ध्य दरार को इंगित करती है। दाएं पैनल में, डैश लाइन द्वारा संलग्न क्षेत्र नेक्रोपसी में दिखाई देने वाले ट्यूमर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) माउस खोपड़ी के बाहर बढ़ने वाले मस्तिष्क ट्यूमर का एक उदाहरण एमआरआई स्कैन में दिखाया गया है। दोनों एमआरआई छवियों के लिए एक प्रतिनिधि स्केल बार चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ऑर्थोटोपिक टीआरपी जीबीएम ट्यूमर की हिस्टोपैथोलॉजी मानव जीबीएम की पहचान को पुन: प्रस्तुत करती है। पूरे मस्तिष्क के हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दागदार, धब्बेदार वर्गों का मूल्यांकन एसीवीपी-बोर्ड-प्रमाणित पशु रोग विज्ञानी द्वारा किया गया था, और ट्यूमर को मानव एस्ट्रोसाइटोमा10,11 के लिए वर्तमान विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) वर्गीकरण के आधार पर वर्गीकृत किया गया था। ऑर्थोटोपिक जीबीएम ट्यूमर अत्यधिक प्रोलिफ़ेरेटिव, इनवेसिव (आई) और संवहनी (वी) हैं, और नियोप्लास्टिककोशिकाओं द्वारा नेक्रोसिस (एन) और स्यूडोपैलिसेडिंग (पी) सहित मानव जीबीएम हिस्टोपैथोलॉजी के हॉलमार्क प्रदर्शित करते हैं। डैश्ड लाइनें मस्तिष्क ट्यूमर के भीतर और परिधि में क्षेत्रों का आवर्धन दिखाती हैं, जो सामान्य मस्तिष्क ऊतक (क्रमशः ऊपर और नीचे दाएं) से सटे होते हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एंटीबॉडी और तरीकों को एल मेस्किनी एट अल.5 में वर्णित किया गया है। एच एंड ई छवियों के लिए एक स्केल बार कम और उच्च आवर्धन दोनों के लिए दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ऑर्थोटोपिक मॉडल में व्यक्त जीबीएम के बायोमार्कर। मल्टीपोटेंट पूर्वज मार्कर एसओएक्स -2 (एसआरवाई-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 2), तंत्रिका पूर्वज नेस्टीन और ओलिग -2, और ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) एस्ट्रोसाइटिक मार्कर की अभिव्यक्ति सेलुलर विषमता का संकेत देती है, जो मानव जीबीएम 7,8 की एक सामान्य विशेषता है। सभी आईएचसी छवियों के लिए एक प्रतिनिधि स्केल बार ओलिग 2 (ओलिगोडेंड्रोसाइट ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 2; नीचे दाएं) में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जीबीएम में नए चिकित्सीय लक्ष्यों और नवीन उपचार रणनीतियों के मूल्यांकन के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल आवश्यक हैं। जीबीएम के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में ऑटोक्थोनस साइट में ट्यूमर की घटना का लाभ होता है, लेकिन अक्सर एक लंबी विलंबता और अप्रत्याशित ट्यूमर विकासके साथ। जीईएम मॉडल ट्यूमर 4-5 महीने की विलंबता प्रदर्शित करते हैं, और इमेजिंग, भर्ती और उपचार के लिए आदर्श समय खिड़की व्यक्तिगत चूहों के बीच परिवर्तनशील है। ऑर्थोटोपिक मॉडल में 4-5 सप्ताह की एक अच्छी तरह से स्थापित और वापस लेने योग्य विकास और उपचार समयरेखा है, और प्रत्यारोपण के बाद एमआरआई द्वारा ट्यूमर का विश्वसनीय रूप से पता लगाया जाता है। जीईएम-व्युत्पन्न ऑर्थोटोपिक मॉडल का उपयोग प्रत्येक माउस में सटीक स्थान पर ट्यूमर के प्लेसमेंट के साथ-साथ आसपास के मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट के लाभ को बनाए रखते हुए ट्यूमर विकास दीक्षा के अस्थायी नियंत्रण की अनुमति देता है। टीआरपी ऑर्थोटोपिक मॉडल में, सक्रिय आरटीके, पीटीईएन और आरबी मार्ग एक ट्यूमर मॉडल का उत्पादन करते हैं जो मानव जीबीएम की हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करता है। मानव जीबीएम के अनुरूप, ऑर्थोटोपिक टीआरपी जीबीएम ट्यूमर आक्रामक विकास की विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि नेक्रोटिक फॉसी स्यूडोपैलिसेडिंग नियोप्लास्टिक कोशिकाओं और नियोवैस्कुलराइजेशन से घिरा हुआ है। ट्यूमर आसपास के मस्तिष्क पैरेन्काइमा में भी आक्रामक होते हैं। इसलिए, एजेंट जो रोगियों में ट्यूमर घुसपैठ और प्रवास को दबा सकते हैं, उनका मूल्यांकन टीआरपी ऑर्थोटोपिक ट्यूमर में प्रीक्लिनिकल रूप से किया जा सकता है। आक्रामक जीईएम ट्यूमर से कोशिकाओं को सिंजेनिक चूहों में इंजेक्ट करने की प्रक्रिया में विशेष सावधानी की आवश्यकता होती है, ताकि लक्षित क्षेत्र के बाहर कोशिकाओं के अनपेक्षित रिसाव और विकास से बचा जा सके। यहां वर्णित विधि, जब नियमित रूप से अभ्यास किया जाता है, तो इसका उपयोग लगातार ट्यूमर के विकास के साथ ट्यूमर-असर चूहों के बड़े समूहों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम जो सफल ट्यूमर इंजेक्शन को प्रभावित कर सकते हैं, उनमें मस्तिष्क पोस्ट-सेल इंजेक्शन से सुई को हटाना और हड्डी मोम का उपयोग शामिल है। सुई को एक समय में 1 मिमी डाला और हटाया जाना चाहिए (जैसा कि चरण 5 और 6 में वर्णित है), ताकि आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों को अतिरिक्त नुकसान और अवशिष्ट कोशिकाओं के रिसाव या इंजेक्शन निलंबन14 के बैकफ्लो को रोका जा सके। सुई छेद को प्लग और सील करने के लिए पिघली हुई हड्डी के मोम का उपयोग सेल रिसाव को रोकने के लिए एक बाधा बनाता है, जैसा कि मिथाइलसेल्यूलोज निलंबन में कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करता है। महत्वपूर्ण रूप से, मिथाइलसेल्यूलोज को मस्तिष्क कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने से पहले पीबीएस (या वैकल्पिक रूप से, सीरम-मुक्त मीडिया) जैसे बफर समाधान में मिलाया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, रिकवरी समय को कम करने के लिए, इंजेक्शन एनेस्थीसिया पर इनहेलेशन एनेस्थीसिया का उपयोग पसंद किया जाता है।

ध्यान दें कि सिर का आकार माउस उपभेदों के बीच, या उम्र और लिंग के आधार पर थोड़ा भिन्न हो सकता है; इस प्रकार, स्टीरियोटैक्टिक उपकरण को एक माउस कॉहोर्ट प्रकार से दूसरे में बदलते समय फिर से कैलिब्रेट करने की आवश्यकता हो सकती है। हम एक बड़े समूह के साथ आगे बढ़ने से पहले चूहों की एक छोटी संख्या में रुचि के प्रत्येक सेल लाइन के लिए इंजेक्शन के लिए सेल नंबर के अनुकूलन की भी सलाह देते हैं। मानव जेनोग्राफ्ट्स की तुलना में, तनाव-मिलान वाले चूहों में फिर से प्रत्यारोपित होने पर मुराइन ट्यूमर आक्रामक रूप से बढ़ सकते हैं और इंजेक्शन के लिए कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, जैसा कि हमने टीआरपी लाइनों के साथ देखा था।

जीईएम मॉडल में ग्लियोब्लास्टोमा की दीक्षा और विकास की तुलना में ऑर्थोटोपिक मस्तिष्क इंजेक्शन का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इंजेक्शन ट्यूमर के आसपास का ऊतक सामान्य है, और हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा स्थानीय आक्रामकता का आकलन किया जा सकता है। हालांकि, हम इंजेक्शन घाव के कारण माइक्रोएन्वायरमेंट में परिवर्तन से इनकार नहीं कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप संभवतः स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया या रक्त-मस्तिष्क बाधा का क्षोभ होता है।

अंत में, ऑर्थोटोपिक मॉडल जीबीएम के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं, उपचार के लिए एक उचित समयरेखा के साथ और देशी ट्यूमर स्थान के संदर्भ में। हमारा मॉडल मानव जीबीएम सुविधाओं को फिर से परिभाषित करता है लेकिन एक इम्यूनोसक्षम माउस में; इसलिए, प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट का विश्लेषण ट्यूमर के विकास के सापेक्ष, या इम्यूनोथेरेपी के जवाब में किया जा सकता है। ट्यूमर की वृद्धि आक्रामक और आक्रामक है, कई सेल-लाइन जेनोग्राफ्ट जीबीएम मॉडल के विपरीत जिसमें ट्यूमर समझाया रहता है और मानव जीबीएम13,15,16 की हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं को प्रदर्शित नहीं करता है। जब सही तरीके से प्रदर्शन किया जाता है, तो यहां वर्णित प्रक्रिया के परिणामस्वरूप सेल रिसाव या एक्स्ट्राक्रैनियल प्रसार के बिना विश्वसनीय ट्यूमर विकास होता है।

अंत में, हालांकि इस प्रोटोकॉल को जीबीएम के संदर्भ में ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल के रूप में अनुकूलित किया गया है, प्रीक्लिनिकल अनुवाद में इसकी सटीकता और विश्वसनीय अनुप्रयोग को अन्य मस्तिष्क ट्यूमर उपवर्गों के मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में विधियों और अभिकर्मकों का उपयोग विभिन्न सेल प्रकार के प्रत्यारोपण के लिए किया जा सकता है जो मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल (जैसे, डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमा17) के लिए उत्परिवर्तन करते हैं, स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक के समायोजन के साथ।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए श्री एलन ई कुलागा और सर्जिकल तकनीकों को परिष्कृत करने के लिए सुश्री मिशेल एल गुम्प्रेच के आभारी हैं। हम पैथोलॉजी विश्लेषण के लिए डॉ फिलिप एल मार्टिन और एमआरआई स्कैन के लिए फ्रेडरिक नेशनल लेबोरेटरी स्मॉल एनिमल इमेजिंग प्रोग्राम की सुश्री लिलिया इलेवा और डॉ जोसेफ कालेन को धन्यवाद देते हैं।

इस परियोजना को अनुबंध संख्या एचएचएसएन 261201500003आई के तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से संघीय धन के साथ पूरी तरह से या आंशिक रूप से वित्त पोषित किया गया है। इस प्रकाशन की सामग्री आवश्यक रूप से स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग के विचारों या नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करती है, न ही व्यापार नामों, वाणिज्यिक उत्पादों या संगठनों का उल्लेख अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन का अर्थ है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved Millipore Sigma M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip BD 309659
6" Cotton Tipped Applicators Puritan S-18991
Adjustable stage platform David Kopf Instruments Model 901
Aerosol Barrier Tips Fisher Scientific 02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch PDI C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) Jackson Laboratory Jax #10006
Bone Wax Surgical Specialties 901
Bupivacaine 0.25% Henry Schein 6023287
BuprenorphineSR ZooPharm n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD UDP T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment CVS Pharmacy 247881
Disposable Scalpels, #10 blade Scalpel Miltex 16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box Somni Scientific n/a Investigator may use facility
standard equipment
Gas anesthesia platform for mice David Kopf Instruments Model 923-B
GraphPad Prism Graphpad Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 Hamilton Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL Hamilton 7653-01
Hot bead sterilizer with beads Fine Science Tools 18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter Fisher Scientific AMQAX2000
IsoFlurane Piramal Critical Care 29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads PDI C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console David Kopf Instruments Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID Masterflex HV-30616-16
Mouse Heating Plate David Kopf Instruments PH HP-4M
Mouse Rectal Probe David Kopf Instruments PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors ThermoFisher Scientific 74000-00
P20 pipette Gilson F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub Dynarex 1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator Fine Science Tools 12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover Fine Science Tools 12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips Fine Science Tools 12032-09
Semken forceps, curved Fine Science Tools 11009-13
Temperature Controller David Kopf Instruments PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip BD 309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller World Precision Instruments Model UMP3T

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References

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इस महीने JoVE में अंक 192
ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म के ट्रांसलेशनल ऑर्थोटोपिक मॉडल
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El Meskini, R., Atkinson, D., Weaver … More

El Meskini, R., Atkinson, D., Weaver Ohler, Z. Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme. J. Vis. Exp. (192), e64482, doi:10.3791/64482 (2023).

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