Summary
ここでは、遺伝子操作されたモデルマウス腫瘍に由来する細胞の頭蓋内注射によって樹立されたGBMの前臨床同所性マウスモデルについて述べる。このモデルは、ヒトGBMの疾患の特徴を示しています。トランスレーショナル研究のために、マウス脳腫瘍は in vivoMRI および組織病理学によって追跡される。
Abstract
ヒト多形性膠芽腫(GBM)の遺伝子改変マウス(GEM)モデルは、脳腫瘍の発生と進行を理解するために重要です。異種移植腫瘍とは異なり、GEMでは、腫瘍は免疫適格マウスの天然微小環境で発生します。しかし、前臨床治療研究におけるGBM GEMの使用は、腫瘍潜伏期間が長く、新生物頻度の不均一性、および進行性度の腫瘍発生のタイミングのために困難である。頭蓋内同所性注射 によって 誘導されたマウスは、前臨床試験にとってより扱いやすく、GEM腫瘍の特徴を保持しています。Rb、Kras、p53異常(TRP)を有するGEMモデルから派生した同所性脳腫瘍モデルを作成し、腫瘍細胞による線状壊死病巣を示すGBM腫瘍と、ヒトGBMに類似した高密度血管新生を発症した。GEM GBM腫瘍に由来する細胞は、野生型の系統が一致したレシピエントマウスに頭蓋内注射され、グレードIV腫瘍を再現するため、GEMマウスの長い腫瘍潜伏期間を回避し、前臨床試験用の大規模で再現性のあるコホートの作成を可能にします。GBMのTRP GEMモデルの高度に増殖性、浸潤性、および血管の特徴は、同所性腫瘍で再現され、組織病理学マーカーはヒトGBMサブグループを反映しています。腫瘍の成長は、連続MRIスキャンによって監視されます。免疫適格モデルにおける頭蓋内腫瘍の浸潤性のため、ここで概説した注射手順に注意深く従うことは、頭蓋外腫瘍の成長を防ぐために不可欠です。
Introduction
膠芽腫(GBM;グレードIV神経膠腫)は最も一般的で悪性の脳腫瘍であり、現在の治療法は効果がなく、生存期間の中央値は15か月です1。脳腫瘍の成長と病因に関与する複雑なシグナル伝達経路を表す信頼性の高い正確な前臨床モデルは、GBMの新しい治療レジメンの評価の進歩を促進するために不可欠です。ヒト脳腫瘍細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植したマウスモデルは、脳腫瘍の本来の免疫環境を反映しておらず、血液脳関門を通過する治療薬の能力を評価するためにも使用できません2。理想的には、前臨床マウスモデルはまた、周囲の実質3への高レベルの侵襲性を含むヒトGBM組織病理学を密接に再現すべきである。遺伝子改変マウス(GEM)モデルは、無傷の免疫系の状況で腫瘍を発症しますが、複雑な育種スキームが必要になることが多く、腫瘍はゆっくりと一貫性のない状態で発生する可能性があります4。GEM由来の同種移植片モデルは、担がんマウスの大規模なコホートがより短い時間枠で必要とされる前臨床治療研究に適しています。
以前の報告では、GEM腫瘍から直接誘導された同所性GBMマウスモデルについて説明しました。GEMにおける腫瘍形成は、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現する細胞集団(主に星状細胞)における遺伝的事象によって開始され、その結果、GBMに進行する。これらのTRP GEMは、GFAP駆動Creリコンビナーゼへの曝露後にT121を発現するTgGZT121導入遺伝子(T)を保有しています。T121タンパク質発現は、Rb(Rb1、p107、およびp103)タンパク質活性の抑制をもたらす。GFAP駆動型Cre導入遺伝子(GFAP-CreERT2)の共発現は、タモキシフェンによる誘導後の成体星状細胞への発現を標的とする。TRPマウスはまた、Cre依存性変異Kras(KrasG12D;R)対立遺伝子は、受容体チロシンキナーゼ経路の活性化を表すため、Pten(P)5,6の喪失に対してヘテロ接合性である。受容体チロシンキナーゼ(RTK)、PI3K、およびRBネットワークにおける同時遺伝子異常は、GBM病因の74%に関与しています7。したがって、ヒトGBMで変化した一次シグナル伝達経路は、TRPマウス、特にGTKの共有下流標的が活性化されるGBM腫瘍における操作された突然変異によって表されます5。
GEM由来の同系同所性モデルは、GBMの異常な経路を標的とするがん治療薬を評価するためのプラットフォームとして使用するために、浸潤性やサブタイプバイオマーカーの存在など、ヒト脳腫瘍の特徴を再現するモデルとして検証されました。TRP脳から採取した腫瘍から細胞を培養し、皮質に頭蓋内注射するための定位装置を用いて、系統適合マウスの脳に再移植した。この前臨床同所性マウスモデルは、細胞性が高く、浸潤性で、有糸分裂率が高く、ヒトGBMで観察されたように、腫瘍細胞による壊死の線状病巣と密な血管新生を示すGBM腫瘍を発症しました。腫瘍体積および成長は、 in vivo 磁気共鳴画像法(MRI)によって測定した。
本報告では、初代GBM細胞または細胞株を野生型マウス脳に頭蓋内注射するための最適な手法について、TRP腫瘍を例に説明する。同じプロトコルを、免疫無防備状態のマウスおよび他のGBM細胞株に適合させることができる。最適ではない細胞調製や注入部位での細胞漏出などの一般的な落とし穴を回避し、定位装置を正しく使用してモデルの再現性と信頼性を確保するための重要なヒントを提供します。翻訳目的で、生きた動物の脳腫瘍増殖のMRI検出、組織学的特性評価、および担癌マウスでの治療例によってモデルを検証します。
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Protocol
ここに記載されている研究プロトコルは、フレデリック動物管理および使用委員会のNCIによって承認されました。NCI-フレデリックはAAALACインターナショナルの認定を受けており、実験動物の世話と使用に関する公衆衛生サービスポリシーに従っています。動物の世話は、「実験動物の世話と使用のためのガイド」(国立研究評議会、2011;全米アカデミーズプレス、ワシントンDC)。
1.注射用細胞の調製
注:このモデルに用いたマウス脳腫瘍初代細胞(MBR)は、El Meskiniらに記載されているように、もともとタモキシフェン誘導TRP GEMマウスから単離された5。細胞調製の詳細は、この参考文献に見出すことができる。
- バイオセーフティキャビネットで滅菌技術を使用して次の手順を実行します。
- 初代脳腫瘍細胞を指数関数的増殖期に達するまで in vitro で培養します。
- 細胞を0.25%トリプシンで採取し、剥離したら増殖培地で希釈してトリプシンを不活性化します。
- 400 x g の遠心分離により細胞をペレット化し、無血清培地で洗浄します。カウントする前に一度繰り返します。
- 手動または自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。細胞を5%滅菌メチルセルロースに1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に、2 μLの最終注入量に基づいて所望の濃度で再懸濁します。所望の細胞濃度は、細胞株および脳腫瘍モデルに基づいて変化し得る。GBM GEM TRP細胞の場合、25 x 106 細胞/ml溶液、または50,000細胞を2 μL注入します。
2.マウス系統
- 脳腫瘍細胞の株背景に一致する適切なマウス系統を繁殖または購入する。TRP細胞については、9週齢のB6D2F1/Jマウス(C57BL/6J [B6]雌とDBA/2J [D2]雄の交配種由来)を腫瘍細胞レシピエントとして使用します。
3.手術領域の設定
注意: すべての外科的ステップは、清潔で消毒された環境で無菌技術を使用して行われます。スクラブとマスクを含む個人用保護具は、外科医が着用する必要があります。手術器具は使用前に加熱滅菌する必要があります。
- 固定装置の下と作業面に表面プロテクターを置きます。
- 麻酔器からのビニールチューブを固定装置のガス麻酔プラットフォームのINポートに取り付け、別のチューブをOUTポートに取り付けます。
- デジタルディスプレイを電源と装置に接続します。
- マイクロポンプコントローラ(図1A)を電源に接続し、マイクロポンプ(図1A)を装置のマニピュレータアームに取り付けます(製造元の指示も参照してください)。
- 2,000 nLの容量注入では、マイクロポンプを5.6 nL/sに設定します。
- ホットビーズ滅菌器の電源を入れます。
- マウスの加熱パッドを温度コントローラーに接続し、電源に接続します。プレートをステージプラットフォームに置きます。プレート温度を37°Cに設定します。
- 30 Gの精密シリンジをバックロードし、気泡が発生しないように注意してください。プランジャーを挿入し、針を取り付けます。針はハブのみでつかんでください。メチルセルロース細胞混合物の滴が針を通して分注されるまでプランジャーを押し下げます。針の側面を注意深く拭くか、滅菌ガーゼパッドを作業台に置いて吸い取り、70%アルコール調製パッドで針を洗浄します。針を曲げたり折ったりしないように注意してください。
- 精密シリンジをマイクロポンプに取り付け、マニピュレーターアームをステージから離れるように回転させて、マウスをステージに置く前にシリンジと針の変位を防ぎます。
4.手術のためのマウスの準備
- マウスをイソフルラン気化器を2.5%に設定した誘導チャンバーに置くか、施設のガイドラインに従って麻酔します。ノーズコーンへのイソフルランの流れをオンにします。
- マウスを定位固定装置に移し、上の歯をノーズコーンサポートに配置して、ノーズコーンに固定します(図1B、9)。ノーズコーンのノブを締めて固定します(図1B)。つま先をつまんで反射をチェックすることにより、適切なレベルの麻酔を確保します。
- 耳、足、粘膜の色(ピンク)を監視して、適切な酸素供給を確保します。また、呼吸数を監視します(増減はイソフルランレベルを調整する必要があることを示している可能性があります)。
- イヤーバー(図1B)を両耳に挿入し、ノブを締めて頭を固定します。
- マウスが麻酔下にある間に目を滑らかにするために目の軟膏を塗ります。
- 湾曲した鉗子を使用して、マウスの頭の毛を計画した切開よりも約150%大きい領域まで摘み取り、適切な無菌状態を確保します。
- 0.5〜1 mg / kgのブプレノルフィンSR鎮痛を皮下注射するか、別のプロトコル承認鎮痛薬を使用します。.
- マウス直腸プローブを配置して、内部温度を監視し、麻酔による低体温を防ぎます。マウスの体温を36.5〜38.5°Cに保ちます。
- 外向きの円を使用して手術野を消毒し、外科用スクラブとエタノールを3回交互に使用します。
- 鉗子を使って皮膚をぴんと張って引っ張り、目の間からメスの刃で約1cmの切開を行います。ブレグマは切開を通して見えるはずです。
注意: 適切な滅菌技術を得るには、滅菌されたツールの先端でのみ手術部位に触れ、ツールチップを滅菌面(オートクレーブ滅菌されたツールパックの内側など)にのみ置きます。 - 先端が綿のアプリケーターの木製の端を使用して余分な結合組織をこすり落とし、次に別のアプリケーターの綿の端を使用して乾燥させます。
5.細胞注入
- シリンジアタッチメントをマウスの上に取り付けた状態でマニピュレータアームを戻し、ノブを締めて固定します。水平面のXノブとYノブを使用して、シリンジマウントをブレグマの上に移動します。Zノブを使用して針を下げ、ブレグマの位置を確認します。デジタル読み出しコンソールをゼロに設定します。
- XノブとYノブ、および対応するデジタル読み出しを使用して、針を目的の位置に移動します。皮質皮質の位置については、適切な座標は、後方3 mm、ブレグマの外側右2 mm、硬膜から深さ2 mmです。Zノブを使用して、針を頭蓋骨の表面に移動します。
- 25 Gの針が取り付けられた1 mLの注射器を使用して、頭蓋骨に穴を開けます。針のベベルを30 Gの精密シリンジと針に向けて置き、マニピュレーターアームを慎重に横に回転させます。親指と指を使用して、針先が頭蓋骨のキャップを突き刺すまで、穏やかな圧力で針をゆっくりと前後に転がします。
- 先端が綿のアプリケーターを使用して、針穴から血液を軽くたたきます。マニピュレーターアームを適切な位置に交換し、穴の上に装填された精密シリンジ針を取り付けます。針の先端を穴に合わせ、Zノブを使用して針を脳硬膜まで下げ、デジタル読み出しコンソールをゼロに設定します。
- Zノブを使用して、針を1 mm下げてから、1分間待ちます。希望の深さ(示されているように2 mm)に達するまで繰り返します。
注:針は、周囲の脳組織へのさらなる損傷および細胞溶液の逆流を防ぐためにゆっくりと下げられる。 - マイクロポンプを起動し、2 μLが注入されたときにポンプが停止することを確認するために監視します。このプロセスには、指定された速度で約6分かかります。次に、針を動かす前に1分間待ちます。
6.針の取り外しと創傷閉鎖
- 針を1 mm上げてから1分間待ちます。針が頭蓋骨から完全に外れるまで繰り返します。
- 必要に応じて、先端が綿のアプリケーターを使用して、注射部位から血液を軽くたたきます。
- 先端が綿のアプリケーターの木の端を使って、骨ワックスの小片(~1 mm)を取り、円錐形にします。頭蓋骨の開口部にそれを置き、ワックスを穴に押し込みます。
- ビーズ滅菌器を使用して鉗子を加熱し、それらを使用して頭蓋骨に残っているワックスを溶かし、滑らかにします。
- 約2滴のブピバカイン(麻酔薬)溶液を切開部に入れ、鉗子を使用して皮膚の端を一緒に引っ張ります。
- 皮膚をぴんと張って引っ張り、1つまたは2つの傷付きクリップを配置して皮膚を閉じます。
- ドラフトのない場所の加熱パッドの清潔な回復ケージにマウスを置き、マウスを注意深く観察します。マウスが麻酔から完全に目覚め、通常の活動を再開してから、通常のハウジングに戻します。
- 外科的処置後に毎日マウスをチェックし、施設のガイドラインに従って疼痛管理を行います。
- ブプレノルフィンSR(ステップ4.6)が鎮痛に使用される場合、徐放性処方は72時間持続します。72時間後に目に見える痛みや不快感がある場合にのみ注射を繰り返します。正しく実施された場合、マウスは頭蓋内注射から十分に回復し、追加の鎮痛は必要ありません。
- 手術後7〜10日でステープルを取り外します。
- 生きた動物イメージング(MRI)によって腫瘍の成長を監視します。
- 人道的なエンドポイントに達したとき(すなわち、動物が20%の体重を失うか、低体温になった場合)にマウスを安楽死させる。
- これらの脳腫瘍の浸潤性のために、不均一な歩行、部分的な麻痺、回転、または頭の傾きなどの神経学的症状についてマウスを観察します。進行した腫瘍増殖のこれらの臨床徴候のいずれかが観察された場合は、マウスを安楽死させます。
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Representative Results
脳腫瘍細胞を注射したマウスは、発作、運動失調、体重減少などの腫瘍増殖の兆候がないか毎日監視する必要があります。脳腫瘍の成長は、定期的にMRIスキャンによって監視することもできます。毎週のMRIスキャンにより、脳内の腫瘍量の増加と腫瘍体積の測定を視覚化できます(図1C)。特にTRP腫瘍は積極的な増殖を示し、3D腫瘍体積は頭蓋内注射後2〜3週間以内にMRIで測定可能です(平均体積は30〜40 mm3)。ある代表的な研究では、脳腫瘍担持マウスのコホートを対照と放射線療法の2つのグループに分けました。MRI腫瘍体積測定では、放射線治療後の腫瘍増殖抑制の欠如が明らかになり(図2A)、治療されたマウスの生存率の増加は得られませんでした(図2B)。
剖検時には、腫瘍は腫れた右半球内の脳の黒い斑点として現れることがあります(図3A、中央のパネル)、またはより大きな腫瘍の場合は、隆起した暗い領域として現れることがあります。病理組織学的分析では、注射部位領域を通る矢状切片(図3A)により、腫瘍の成長と非悪性脳組織への浸潤の程度を最適に評価できます。同系モデルのGBM腫瘍は積極的に増殖し、剖検時に観察できる終末端端点によって頭蓋骨を破る可能性があります。対照的に、細胞移植直後の頭蓋外増殖は、MRIスキャン(図3B)または生きたマウスの頭部のドーム型領域で観察できる、注射中の細胞の漏出を示している可能性があります。針が注射部位からあまりにも早く取り外された可能性があります( セクション6を参照)。頭蓋外増殖は組織学的評価により注射部位での漏出として確認される。
TRP同所性モデルでは、組織病理学により、偽パリサディングや壊死などのTRP GEM腫瘍で観察された特徴的な特徴の再現を含め、グレードIVの星細胞腫/GBMの存在が確認されました(図4)。GBM神経幹細胞およびヒトGBM下位分類について記載した前駆細胞マーカーを免疫組織化学により評価した(図5)。グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の広範な発現は、星状細胞前駆細胞起源の増殖性腫瘍を示し、一方、ネスチンおよびSox-2は確立された神経前駆細胞マーカーであり、Olig-2発現は希突起膠細胞起源の細胞の存在を確認する5,7。4つのマーカーはすべて、ヒトGBM8のサブタイプで高度に発現されています。
図1:頭蓋内インプラント装置のセットアップと連続MRIで可視化されたTRP GBM腫瘍の成長。 (A)頭蓋内インプラントに必要な異なる要素を備えた装置のセットアップ(1〜11記載);具体的なマウス頭部留置・吸入麻酔部は(B)に拡大されている。毎週のイメージングは、カスタムビルドの4つのマウスSENSEアレイ表面コイル5、9を備えたMRI 3.0T臨床スキャナーで実行されました。マルチスライスT2強調ターボスピンエコー(T2w-TSE)シーケンス:(TR/TE (4437/100 ms)、面分解能(0.12 x 0.15 mm)、スライス厚さ(0.5 mm)、SENSE加速係数(4)画像をマウスの脳全体をカバーする軸面で取得しました。示されているのは、移植後3、4、および5週間の腫瘍からの冠状切片です。MRI画像の代表的なスケールバーを右下(C)に示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:放射線治療を伴う同所性GBMモデルの代表的な有効性研究 。 (A)MRIスキャンから計算された、腫瘍移植後2、3、および4週目に対応する3次元腫瘍体積。脳腫瘍の体積は、MRI画像の分析を通じて測定されました。MRI画像をITK_SNAPプログラムにアップロードした後、画像のコントラストと画像強度領域フィルターを調整しました。アクティブな輪郭の初期化と画像セグメンテーションに続いて、腫瘍体積を立方ミリミエターで測定しました。個々の対照(未処理)マウスおよび放射線(1日当たり3Gy、5日間、合計15Gy)で処置したマウスをプロットする。(B)対照と比較した放射線治療マウスの生存率。生存率は、グラフ化ソフトウェア( 材料表を参照)を用いて、n = 11匹の未処理マウスおよびn = 12匹の放射線処理マウスの合計から計算した。研究用マウスは、私たちの施設のガイドラインに基づいて、人道的なエンドポイントに到達したときに安楽死させました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:剖検時の脳内の腫瘍の位置 。 (A)マウス右半球における腫瘍増殖の正しい位置。左のパネルは、研究終了時のMRIスキャンからの脳内の腫瘍の例を示しています。赤い矢印は腫瘍の位置を示す。解剖されたマウスの脳は頭蓋骨内に表示され(中央のパネル)、頭蓋腔から取り除かれます(右のパネル)。中央のパネルでは、青い矢印は注射部位の針の衝撃を示し、両方向の矢印は組織学のための脳矢状切断の推奨位置を示し、右半球を2つの部分に分割します。両方の脳部分は、「オープンブック」方式でパラフィンに埋め込まれています。破線は、基準として2つの脳半球を隔てる正中縦断裂を示す。右側のパネルでは、破線で囲まれた領域は、剖検時の目に見える腫瘍領域を表しています。(B)マウス頭蓋骨の外側に増殖している脳腫瘍の例がMRIスキャンで示されています。両方のMRI画像の代表的なスケールバーを 図3Aに示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:同所性TRP GBM腫瘍の組織病理学は、ヒトGBMの特徴を要約しています。ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色された脳全体の矢状切片は、ACVP理事会認定の獣医病理学者によって評価され、腫瘍はヒト星状細胞腫に関する現在の世界保健機関(WHO)分類に基づいて等級付けされました10,11。同所性GBM腫瘍は、増殖性が高く、浸潤性(I)および血管新生性(V)であり、腫瘍細胞による壊死(N)および偽パリサジン(P)を含むヒトGBM組織病理学の特徴を示す12。破線は、正常な脳組織に隣接する脳腫瘍内および末梢の領域の拡大を示す(それぞれ右上および右下)。免疫組織化学のための抗体および方法は、El Meskiniらに記載されている5。H&E画像のスケールバーは、低倍率と高倍率の両方に表示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:同所性モデルで発現したGBMのバイオマーカー。多能性前駆細胞マーカーSOX-2(SRY-Box転写因子2)、神経前駆細胞ネスチンおよびOlig-2、ならびにグリア線維酸性タンパク質(GFAP)星状細胞マーカーの発現は、細胞の不均一性を示し、これはヒトGBM7,8の共通の特徴である。すべてのIHC画像の代表的なスケールバーをOlig2(希突起膠細胞転写因子2;右下)に示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
前臨床モデルは、多形性神経膠芽腫における新しい治療標的および新規治療戦略の評価に不可欠である。GBMの遺伝子改変マウスモデルは、自生部位に腫瘍が発生するという利点がありますが、多くの場合、潜伏期間が長く、腫瘍の成長が予測できません13。GEMモデル腫瘍は4〜5か月の潜伏期を示し、イメージング、リクルートメント、および治療の理想的な時間枠は個々のマウス間で異なります。同所性モデルは、4〜5週間の十分に確立された扱いやすい成長と治療のタイムラインを持ち、腫瘍は移植後のMRIによって確実に検出されます。GEM由来の同所性モデルを使用することで、周囲の脳微小環境の利点を維持しながら、各マウスの正確な位置に腫瘍を配置し、腫瘍の成長開始を時間的に制御することができます。TRP同所性モデルでは、活性化されたRTK、PTEN、およびRB経路により、ヒトGBMの組織学的特徴を再現する腫瘍モデルが生成されます。ヒトGBMと同様に、同所性TRP GBM腫瘍は、偽パリサド腫瘍細胞および新生血管形成に囲まれた壊死病巣などの積極的な増殖の特徴を示す。腫瘍はまた、周囲の脳実質に浸潤性である。したがって、患者における腫瘍浸潤および遊走を抑制し得る薬剤は、TRP同所性腫瘍において前臨床的に評価することができる。浸潤性GEM腫瘍から同系マウスに細胞を注入するプロセスは、標的領域外の細胞の意図しない漏出および増殖を避けるために、特に注意が必要である。ここで説明する方法は、日常的に実施される場合、一貫した腫瘍増殖を有する担癌マウスの大規模なコホートを生成するために使用することができる。
腫瘍注射の成功に影響を与える可能性のあるプロトコルの重要なステップには、細胞注射後の脳からの針の除去と骨ワックスの使用が含まれます。針は、周囲の脳組織へのさらなる損傷および残留細胞の漏出または注入された懸濁液14の逆流を防ぐために、一度に1mmずつ挿入および除去されなければならない(ステップ5および6で説明される)。溶融した骨ワックスを使用して針穴を塞いで密封すると、メチルセルロース懸濁液に細胞を移植するのと同様に、細胞漏れを防ぐためのバリアが作成されます。重要なことに、メチルセルロースは、脳細胞を再懸濁する前に、PBS(または代わりに無血清培地)などの緩衝溶液に混合する必要があります。さらに、吸入麻酔の使用は、回復時間を短縮するために、注射可能な麻酔よりも好ましい。
頭のサイズは、マウス系統間、または年齢と性別によってわずかに異なる場合があることに注意してください。したがって、定位機器は、あるマウスコホートタイプから別のマウスコホートタイプに変更するときに再キャリブレーションする必要があるかもしれません。また、大規模なコホートに進む前に、少数のマウスで目的の細胞株ごとに注射する細胞数を最適化することをお勧めします。ヒト異種移植片と比較して、マウス腫瘍は、TRP株で観察されたように、系統適合マウスに再移植すると積極的に増殖し、注射に必要な細胞が少なくて済みます。
GEMモデルにおける膠芽腫の開始および成長と比較した同所性脳注射の主な利点は、注入された腫瘍の周囲の組織が正常であり、局所浸潤性が組織病理学によって評価され得ることである。しかし、注射創自体による微小環境の変化を排除することはできず、局所的な炎症反応や血液脳関門の摂動を引き起こす可能性があります。
結論として、同所性モデルは、治療のための合理的なタイムラインで、そして天然腫瘍の位置の文脈内で、GBMの研究を可能にします。私たちのモデルは、ヒトGBMの特徴を再現していますが、免疫適格マウスで再現しています。したがって、免疫微小環境は、腫瘍増殖に対して、または免疫療法に応答して分析され得る。腫瘍がカプセル化されたままであり、ヒトGBM13,15,16の組織学的特徴を示さない多くの細胞株異種移植片GBMモデルとは異なり、腫瘍の成長は攻撃的で侵襲的です。正しく実行されると、ここで説明する手順は、細胞漏出または頭蓋外拡がりなしに信頼性の高い腫瘍増殖をもたらす。
最後に、このプロトコルは同所性マウスモデルとしてGBMのコンテキストで最適化されていますが、その精度と前臨床翻訳における信頼性の高いアプリケーションは、他の脳腫瘍サブクラスのモデルに適合させることができます。このプロトコルにおける方法および試薬は、固定装置座標の調整を伴って、目的の脳腫瘍モデル(例えば、びまん性正中線グリオーマ17)のための変異を有する異なる細胞型インプラントに利用することができる。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
優れた技術支援をしてくださったアラン・E・クラガ氏と、手術技術を洗練させてくれたミシェル・L・ガンプレヒトさんに感謝しています。病理分析のフィリップL.マーティン博士と、MRIスキャンのフレデリック国立研究所小動物画像プログラムのリリアイレバ氏とジョセフカレン博士に感謝します。
このプロジェクトは、契約番号HHSN261201500003Iに基づいて、国立衛生研究所の国立がん研究所からの連邦資金の全体または一部に資金提供されています。この出版物の内容は、必ずしも保健社会福祉省の見解や方針を反映しているわけではなく、商号、商品、または組織の言及は、米国政府による承認を意味するものでもありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
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