Summary
Aqui, descrevemos um modelo ortotópico pré-clínico em camundongos para GBM, estabelecido por injeção intracraniana de células derivadas de tumores modelo de camundongos geneticamente modificados. Este modelo exibe as características da doença do GBM humano. Para estudos translacionais, o tumor cerebral de camundongo é rastreado por ressonância magnética in vivo e histopatologia.
Abstract
Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) para glioblastoma multiforme humano (GBM) são críticos para a compreensão do desenvolvimento e progressão de tumores cerebrais. Ao contrário dos tumores de xenoenxerto, nos GEMs, os tumores surgem no microambiente nativo em um camundongo imunocompetente. No entanto, o uso de GEMs GBM em estudos de tratamento pré-clínico é desafiador devido às longas latências tumorais, à heterogeneidade na frequência de neoplasias e ao momento do desenvolvimento de tumores de grau avançado. Camundongos induzidos por injeção ortotópica intracraniana são mais tratáveis para estudos pré-clínicos e mantêm características dos tumores GEM. Geramos um modelo de tumor cerebral ortotópico derivado de um modelo de GEM com aberrações de Rb, Kras e p53 (TRP), que desenvolve tumores de GBM exibindo focos lineares de necrose por células neoplásicas e vascularização densa análoga à GBM humana. Células derivadas de tumores GEM GBM são injetadas intracranialmente em camundongos selvagens e cepas compatíveis e reproduzem tumores de grau IV, contornando assim o longo período de latência tumoral em camundongos GEM e permitindo a criação de coortes grandes e reprodutíveis para estudos pré-clínicos. As características altamente proliferativas, invasivas e vasculares do modelo TRP GEM para GBM são recapituladas nos tumores ortotópicos, e os marcadores histopatológicos refletem subgrupos humanos de GBM. O crescimento do tumor é monitorado por exames seriados de RM. Devido à natureza invasiva dos tumores intracranianos em modelos imunocompetentes, seguir cuidadosamente o procedimento de injeção descrito aqui é essencial para prevenir o crescimento de tumores extracranianos.
Introduction
O glioblastoma (GBM; glioma grau IV) é o tumor cerebral mais comum e maligno, e as terapias atuais são ineficazes, resultando em uma sobrevida média de 15meses1. Modelos pré-clínicos confiáveis e precisos que representem as complexas vias de sinalização envolvidas no crescimento e patogênese de tumores cerebrais são essenciais para acelerar o progresso na avaliação de novos regimes terapêuticos para GBM. Modelos murinos nos quais linhagens celulares tumorais cerebrais humanas são implantadas subcutaneamente em camundongos imunocomprometidos não refletem o ambiente imune nativo de tumores cerebrais, nem podem ser usados para avaliar a capacidade da terapêutica de atravessar a barreira hematoencefálica2. Idealmente, modelos pré-clínicos em camundongos também devem reproduzir de perto a histopatologia do GBM humano, incluindo o alto nível de invasividade no parênquima circundante3. Embora modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) desenvolvam tumores no contexto de um sistema imunológico intacto, esquemas de melhoramento complicados são frequentemente necessários, e os tumores podem se desenvolver lenta e inconsistentemente4. Os modelos de aloenxerto derivados do GEM são mais adequados para estudos terapêuticos pré-clínicos, onde grandes coortes de camundongos portadores de tumor são necessárias em um período de tempo mais curto.
Em um relato anterior, descrevemos um modelo ortotópico de GBM em camundongos derivado diretamente de tumores GEM. A tumorigênese no GEM é iniciada por eventos genéticos em populações celulares (principalmente astrócitos) expressando proteína glial fibrilar ácida (GFAP), que resultam em progressão para GBM. Esses GEMs TRP abrigam um transgene (T) TgGZT121, que expressa T121 após exposição à recombinase Cre dirigida por GFAP. A expressão da proteína T121 resulta na supressão da atividade da proteína Rb (Rb1, p107 e p103). A co-expressão de um transgene Cre dirigido por GFAP (GFAP-CreERT2) tem como alvo a expressão para astrócitos adultos após indução com tamoxifeno. Camundongos TRP também abrigam um mutante Cre-dependente Kras (KrasG12D; R) alelos, para representar a ativação da via do receptor tirosina quinase, e são heterozigotos para a perda de Pten (P)5,6. Aberrações gênicas concomitantes nas redes de receptores tirosina quinase (RTK), PI3K e RB estão implicadas em 74% da patogênese do GBM7. Portanto, as vias de sinalização primárias alteradas no GBM humano são representadas pelas mutações projetadas em camundongos TRP, em particular tumores GBM, nos quais alvos compartilhados a jusante de RTKs sãoativados5.
O modelo ortotópico singênico derivado do GEM foi validado como um modelo que recapitula características de tumores cerebrais humanos, incluindo invasividade e presença de biomarcadores de subtipo, para uso como uma plataforma para avaliar a terapêutica do câncer visando vias aberrantes no GBM. As células foram cultivadas a partir de tumores colhidos de cérebros de TRP e reimplantadas no cérebro de camundongos pareados por cepas, usando equipamentos estereotáxicos para injeção intracraniana no córtex. Este modelo ortotópico pré-clínico em camundongos desenvolveu tumores de GBM altamente celulares, invasivos, pleomórficos com alta taxa mitótica, e exibiam focos lineares de necrose por células neoplásicas e vascularização densa, como observado para GBM humano. O volume e o crescimento tumoral foram medidos por ressonância magnética (RM) in vivo .
Neste relato, descrevemos a técnica ideal para a injeção intracraniana de células GBM primárias ou linhagens celulares no cérebro selvagem de camundongos, usando tumores TRP como exemplo. O mesmo protocolo pode ser adaptado para camundongos imunocomprometidos e outras linhagens celulares GBM. Dicas cruciais são dadas para evitar armadilhas comuns, como preparação celular subótima ou vazamento celular no local da injeção, e para usar o equipamento estereotáxico corretamente para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade do modelo. Para fins translacionais, validamos o modelo por RM de detecção de crescimento de tumor cerebral em animais vivos, caracterização histológica, e apresentamos um exemplo de tratamento em camundongos portadores de tumor.
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Protocol
O protocolo de estudo aqui descrito foi aprovado pelo NCI do Frederick Animal Care and Use Committee. O NCI-Frederick é acreditado pela AAALAC International e segue a Política do Serviço de Saúde Pública para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os cuidados com os animais foram realizados de acordo com os procedimentos descritos no "Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011; A National Academies Press, Washington D.C.).
1. Preparação de células injetáveis
NOTA: Células primárias de tumor cerebral (MBRs) de camundongos usadas para este modelo foram originalmente isoladas de camundongos TRP GEM induzidos por tamoxifeno, como descrito em El Meskini et al.5. Detalhes sobre a preparação celular podem ser encontrados nesta referência.
- Execute as etapas a seguir utilizando técnica estéril em um gabinete de biossegurança.
- Cultivar células tumorais cerebrais primárias in vitro até atingirem a fase de crescimento exponencial.
- Colher as células em tripsina 0,25% e, uma vez desprendidas, diluí-las com meio de crescimento para inativar a tripsina.
- Pellet as células por centrifugação a 400 x g e lavagem com meio sem soro. Repita uma vez antes da contagem.
- Conte as células manualmente ou com um contador de células automatizado. Ressuspender as células em metilcelulose estéril a 5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) na concentração desejada, com base em um volume final de injeção de 2 μL. A concentração celular desejada pode variar de acordo com a linhagem celular e o modelo do tumor cerebral. Para células GBM GEM TRP, injetamos 2 μL de uma solução de 25 x 106 células/ml, ou 50.000 células.
2. Tensão do rato
- Reproduza ou compre uma cepa de camundongo apropriada que corresponda ao fundo da cepa das células tumorais cerebrais. Para células TRP, use camundongos B6D2F1/J de 9 semanas de idade (a partir de um cruzamento entre fêmeas C57BL/6J [B6] e machos DBA/2J [D2]) como receptores de células tumorais.
3. Configuração da área cirúrgica
OBS: Todas as etapas cirúrgicas são realizadas por técnica asséptica em ambiente limpo e higienizado. Esfoliantes e equipamentos de proteção individual, incluindo máscara, devem ser usados pelo cirurgião. As ferramentas cirúrgicas devem ser esterilizadas termicamente antes do uso.
- Coloque protetores de superfície sob o aparelho estereotáxico e sobre a superfície de trabalho.
- Conecte o tubo de vinil do aparelho de anestesia à porta IN da plataforma de anestesia a gás do aparelho estereotáxico e outro tubo à porta OUT.
- Conecte o display digital a uma fonte de alimentação e ao aparelho.
- Conecte o controlador da microbomba (Figura 1A) a uma fonte de alimentação e conecte a microbomba (Figura 1A) ao braço manipulador do aparelho (consulte também as instruções do fabricante).
- Ajuste a microbomba para 5,6 nL/s para a injeção de volume de 2.000 nL.
- Ligue o esterilizador de esferas quentes.
- Conecte a almofada de aquecimento do mouse ao controlador de temperatura e conecte-se a uma fonte de energia. Coloque a placa na plataforma do palco. Ajuste a temperatura da placa para 37 °C.
- Backload uma seringa de precisão de 30 G, tomando cuidado para não introduzir bolhas. Insira o êmbolo e prenda a agulha. Certifique-se de segurar a agulha apenas pelo cubo. Pressione o êmbolo até que uma gota da mistura de células metilcelulose se distribua através da agulha. Limpe a agulha com uma almofada de preparação de álcool a 70%, limpando cuidadosamente as laterais da agulha ou colocando uma compressa de gaze estéril na superfície de trabalho e manchando-a. Tome cuidado para não dobrar ou quebrar a agulha.
- Conecte a seringa de precisão à microbomba e gire o braço manipulador para longe do palco, para evitar o deslocamento da seringa-agulha antes de colocar o mouse no palco.
4. Preparando o mouse para a cirurgia
- Anestesiar o camundongo colocando-o na câmara de indução com vaporizador de isoflurano regulado para 2,5%, ou de acordo com diretrizes institucionais. Ligue o fluxo de isoflurano para o cone nasal.
- Transfira o mouse para o aparelho estereotáxico e fixe no cone nasal, com os dentes superiores posicionados sobre o suporte do cone nasal (Figura 1B, 9). Aperte o botão no cone nasal para fixar (Figura 1B). Garanta um nível adequado de anestesia realizando uma pinça no dedo do pé para verificar se há reflexo.
- Monitore as orelhas, pés e membranas mucosas para cor (rosa) para garantir a oxigenação adequada. Além disso, monitorar a frequência respiratória (um aumento ou diminuição pode indicar a necessidade de ajustar os níveis de isoflurano).
- Insira as barras auriculares (Figura 1B) em ambas as orelhas e aperte o botão para prender a cabeça.
- Aplique pomada ocular para lubrificar os olhos enquanto o rato está sob anestesia.
- Use pinças curvas para arrancar o cabelo na cabeça do rato para uma área cerca de 150% maior do que a incisão planejada, para garantir condições assépticas adequadas.
- Injetar 0,5-1 mg/kg de buprenorfina SR analgesia por via subcutânea ou usar outro analgésico aprovado pelo protocolo.
- Posicione a sonda retal do mouse para monitorar a temperatura interna e evitar hipotermia devido à anestesia. Mantenha a temperatura corporal do rato entre 36,5 e 38,5 °C.
- Higienizar o campo cirúrgico utilizando círculos externos, alternando três vezes a paramentação cirúrgica e o etanol.
- Usando pinças para puxar a pele tensa, faça uma incisão de aproximadamente 1 cm com a lâmina do bisturi, começando entre os olhos. O bregma deve ser visível através da incisão.
NOTA: Para uma técnica estéril adequada, toque no local cirúrgico apenas com as pontas de ferramentas esterilizadas e coloque as pontas das ferramentas apenas em uma superfície estéril (como o interior de um pacote de ferramentas autoclavado). - Use a extremidade de madeira do aplicador com ponta de algodão para raspar o excesso de tecido conjuntivo e, em seguida, a extremidade de algodão de outro aplicador para secar.
5. Injeção de células
- Devolva o braço do manipulador com o acessório da seringa sobre o mouse, apertando o botão para fixar. Use os botões X e Y no plano horizontal para mover a montagem da seringa sobre o bregma. Abaixe a agulha usando o botão Z para confirmar a posição do bregma. Defina o console de leitura digital como zero.
- Use os botões X e Y e a leitura digital correspondente para mover a agulha para a posição desejada. Para a localização do córtex cortical, as coordenadas apropriadas são 3 mm posteriores, 2 mm laterais à direita do bregma e 2 mm de profundidade da dura-máter. Use o botão Z para mover a agulha para a superfície do crânio.
- Puncione um orifício no crânio usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 25 G acoplada. Coloque o bisel da agulha em direção à seringa e agulha de precisão de 30 G e gire cuidadosamente o braço do manipulador para o lado. Usando o polegar e o dedo, role a agulha para frente e para trás lentamente com pressão suave até que a ponta da agulha apenas perfure a calota craniana.
- Use um aplicador com ponta de algodão para afastar qualquer sangue do orifício da agulha. Substitua o braço do manipulador para a posição apropriada com a agulha de seringa de precisão carregada acima do orifício. Alinhe a ponta da agulha com o orifício, usando o botão Z para abaixar a agulha até a dura-má-cérebro, e ajuste o console de leitura digital para zero.
- Usando o botão Z, abaixe a agulha 1 mm e aguarde 1 min. Repita até atingir a profundidade desejada (2 mm, conforme indicado).
NOTA: A agulha é abaixada lentamente para evitar danos adicionais ao tecido cerebral circundante e ao refluxo da solução celular. - Inicie a microbomba e, em seguida, monitore para garantir que a bomba pare quando 2 μL tiverem sido injetados. Este processo deve levar cerca de 6 min na velocidade indicada. Em seguida, aguarde 1 min antes de mover a agulha.
6. Remoção da agulha e fechamento da ferida
- Levante a agulha 1 mm e aguarde 1 min. Repita até que a agulha esteja completamente livre do crânio.
- Se necessário, use um aplicador com ponta de algodão para afastar o sangue do local da injeção.
- Usando a extremidade de madeira de um aplicador com ponta de algodão, pegue um pequeno pedaço de cera de osso (~1 mm) e modele-o em um cone. Coloque-o na abertura do crânio, empurrando a cera para dentro do buraco.
- Aqueça as pinças usando um esterilizador de contas e use-as para derreter a cera restante no crânio e alisá-lo.
- Coloque aproximadamente duas gotas de solução de bupivacaína (anestésico) na incisão e use pinças para unir as bordas da pele.
- Puxe a pele tensa e coloque um ou dois clipes para fechar a pele.
- Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa em uma almofada de aquecimento em uma área livre de correntes de ar e observe atentamente o mouse. Permita que o rato acorde completamente da anestesia, retomando a atividade normal, antes de devolvê-lo ao alojamento normal.
- Verifique o mouse diariamente após o procedimento cirúrgico e administre o controle da dor, de acordo com as diretrizes institucionais.
- Se a buprenorfina SR (Passo 4.6) for utilizada para analgesia, a fórmula de liberação sustentada dura 72 h. Repita a injeção apenas se houver dor ou desconforto visíveis após 72 horas. Quando realizada corretamente, os camundongos se recuperam bem das injeções intracranianas e não é necessária analgesia adicional.
- Remova os grampos 7-10 dias após a cirurgia.
- Monitorar o crescimento do tumor por imagens de animais vivos (RM).
- Eutanasiar os camundongos quando os desfechos humanos forem atingidos (ou seja, se o animal perder 20% do peso corporal ou se tornar hipotérmico).
- Devido à natureza invasiva desses tumores cerebrais, observe os camundongos quanto a sintomas neurológicos, como marcha irregular, paralisia parcial, rotação ou inclinação da cabeça. Eutanásia de um camundongo se algum desses sinais clínicos de crescimento avançado do tumor for observado.
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Representative Results
Camundongos injetados com células tumorais cerebrais devem ser monitorados diariamente em busca de sinais de crescimento tumoral, como convulsões, ataxia ou perda de peso. O crescimento do tumor cerebral também pode ser monitorado por ressonância magnética em intervalos regulares. A RM semanal permite a visualização do aumento da carga tumoral no interior do encéfalo e das medidas de volume tumoral (Figura 1C). Em particular, os tumores de TRP exibem crescimento agressivo, e os volumes tumorais 3D são mensuráveis pela RM dentro de 2 a 3 semanas após a injeção intracraniana (com um volume médio de 30 a 40 mm3). Em um estudo representativo, uma coorte de camundongos portadores de tumor cerebral foi dividida em dois grupos para controle versus radioterapia; A mensuração do volume tumoral na RM revelou ausência de supressão do crescimento tumoral após o tratamento radioterápico (Figura 2A), não resultando em aumento da sobrevida dos camundongos tratados (Figura 2B).
Na necropsia, os tumores podem aparecer como uma mancha escura no cérebro dentro de um hemisfério direito inchado (Figura 3A, painel médio), ou, no caso de tumores maiores, como uma região elevada e escurecida. Para a análise histopatológica, o corte sagital através da região do local da injeção (Figura 3A) permite uma ótima avaliação do crescimento tumoral e da extensão da invasão em tecido cerebral não maligno. Os tumores GBM em modelos singênicos podem crescer agressivamente e romper o crânio pelo desfecho terminal, o que pode ser observado na necropsia. Em contraste, o crescimento extracraniano logo após o implante celular provavelmente indica um vazamento de células durante a injeção, que pode ser observado em exames de ressonância magnética (Figura 3B), ou em um camundongo vivo por uma área abobadada na cabeça. A agulha pode ter sido removida do local de injeção demasiado rapidamente (ver Secção 6). O crescimento extracraniano é confirmado como extravasamento no local da injeção por avaliação histológica.
No modelo ortotópico do TRP, a histopatologia confirmou a presença de astrocitoma grau IV/GBM, incluindo a recapitulação das características distintivas observadas nos tumores do PRR GEM, como pseudopaliçada e necrose (Figura 4). Os marcadores de células-tronco neurais e progenitores do GBM descritos para a subclassificação do GBM humano foram avaliados por imunohistoquímica (Figura 5). A expressão generalizada da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) indica um tumor proliferativo de origem progenitora astrocitária, enquanto Nestin e Sox-2 são marcadores progenitores neuronais estabelecidos, e a expressão de Olig-2 confirma a presença de célulasde origem oligodendrocítica5,7. Todos os quatro marcadores são altamente expressos em subtipos de GBMhumano 8.
Figura 1: Colocação do aparelho de implante intracraniano e crescimento dos tumores do GBM do TRP visualizados por RM seriada. (A) Montagem do aparelho com diferentes elementos necessários para o implante intracraniano (1 a 11 descritos); a colocação específica da cabeça do rato e a unidade de anestesia inalatória são ampliadas em (B). Imagens semanais foram realizadas em um scanner clínico de RM 3.0T com uma bobina de superfície de matriz SENSE de quatro camundongos construídasob medida 5,9. Sequência multi-slice T2-pondered turbo spin echo (T2w-TSE): (TR/TE (4437/100 ms), em resolução plana (0,12 x 0,15 mm), espessura de corte (0,5 mm), fator de aceleração SENSE (4) foram adquiridas no plano axial para cobrir todo o cérebro de camundongos. São mostrados cortes coronais de tumores em 3, 4 e 5 semanas pós-implante. Uma barra de escala representativa para imagens de RM é indicada no canto inferior direito (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estudo representativo da eficácia de um modelo ortotópico de GBM com tratamento radioterápico. (A) Volumes tumorais tridimensionais calculados a partir de exames de RM, correspondentes às semanas 2, 3 e 4 pós-implantes tumorais. Os volumes dos tumores cerebrais foram medidos através da análise das imagens de RM. Após o upload de uma imagem de RM no programa ITK_SNAP, o contraste da imagem e o filtro da região de intensidade da imagem foram ajustados. Após a inicialização do contorno ativo e segmentação da imagem, o volume tumoral foi medido em milimieters cúbicos. Camundongos controle individuais (não tratados) e camundongos tratados por irradiação (3 Gy por dia durante 5 dias para um total de 15 Gy) são plotados. (B) Sobrevivência de camundongos tratados com radiação em relação ao controle. A porcentagem de sobrevivência foi calculada com software gráfico (ver Tabela de Materiais) de um total de n = 11 camundongos não tratados e n = 12 camundongos tratados com radiação. Os camundongos do estudo foram eutanasiados à medida que os desfechos humanos eram alcançados, com base em nossas diretrizes institucionais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Localização do tumor no cérebro na necropsia . (A) Localização correta do crescimento tumoral no hemisfério direito do camundongo. O painel esquerdo mostra um exemplo de um tumor dentro do cérebro a partir de uma ressonância magnética no final do estudo; A seta vermelha indica a localização do tumor. O cérebro de camundongo dissecado é mostrado dentro do crânio (painel médio) e removido da cavidade craniana (painel direito). No painel do meio, setas azuis indicam o impacto da agulha do local da injeção e setas de duas pontas indicam a localização recomendada do corte sagital cerebral para histologia, dividindo o hemisfério direito em duas partes. Ambas as partes do cérebro são embutidas em parafina em uma forma de "livro aberto". A linha tracejada indica a fissura longitudinal mediana que separa os dois hemisférios cerebrais como referência. No painel direito, a área delimitada pela linha tracejada representa a região visível do tumor na necropsia. (B) Um exemplo de tumor cerebral crescendo fora do crânio de camundongos é mostrado na ressonância magnética. Uma barra de escala representativa para ambas as imagens de RM é mostrada na Figura 3A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A histopatologia dos tumores ortotópicos do GBM TRP recapitula as características do GBM humano. Cortes sagitais de todo o encéfalo corados pela hematoxilina e eosina (H&E) foram avaliados por um patologista veterinário certificado pela ACVP, e os tumores foram classificados com base na classificação atual da Organização Mundial da Saúde (OMS) para astrocitomas humanos10,11. Os tumores ortotópicos do GBM são altamente proliferativos, invasivos (I) e vascularizados (V), e exibem características histopatológicas do GBM humano, incluindo necrose (N) e pseudopaliçada (P) por células neoplásicas12. As linhas tracejadas mostram ampliação das áreas dentro do tumor cerebral e na periferia, adjacentes ao tecido cerebral normal (superior e inferior direito, respectivamente). Anticorpos e métodos para imuno-histoquímica são descritos em El Meskini et al.5. Uma barra de escala para imagens H&E é mostrada para ampliações baixas e altas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Biomarcadores de GBM expressos no modelo ortotópico. A expressão do marcador progenitor multipotente SOX-2 (SRY-Box transcription factor 2), dos progenitores neurais Nestin e Olig-2 e do marcador astrocitário proteína glial fibrilar ácida (GFAP) indica heterogeneidade celular, característica comum ao GBM humano 7,8. Uma barra de escala representativa para todas as imagens de IHQ é mostrada em Olig2 (Oligodendrocyte transcription factor 2;bottom right). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Modelos pré-clínicos são essenciais para a avaliação de novos alvos terapêuticos e novas estratégias de tratamento no GBM. Modelos de camundongos geneticamente modificados para GBM têm a vantagem da ocorrência de tumores no sítio autóctone, mas muitas vezes com longa latência e crescimento tumoralimprevisível13. Os tumores modelo GEM exibem uma latência de 4-5 meses, e a janela de tempo ideal para imagem, recrutamento e tratamento é variável entre camundongos individuais. O modelo ortotópico tem um cronograma de crescimento e tratamento bem estabelecido e tratável de 4-5 semanas, e os tumores são detectados de forma confiável pela RM após o implante. O uso de modelos ortotópicos derivados do GEM permite a colocação do tumor no local exato em cada camundongo, bem como o controle temporal do início do crescimento tumoral, mantendo a vantagem do microambiente cerebral circundante. No modelo ortotópico do TRP, as vias ativadas RTK, PTEN e RB produzem um modelo tumoral que recapitula as características histológicas do GBM humano. Analogamente ao GBM humano, os tumores ortotópicos do GBM TRP apresentam características de crescimento agressivo, como focos necróticos circundados por células neoplásicas pseudopaliçantes e neovascularização. Os tumores também são invasivos no parênquima cerebral circundante. Portanto, agentes que podem suprimir a infiltração e migração tumoral em pacientes podem ser avaliados pré-clinicamente em tumores ortotópicos de TRP. O processo de injeção de células de tumores GEM invasivos em camundongos singênicos requer cuidado especial, para evitar o vazamento e o crescimento não intencionais de células fora da região alvo. O método aqui descrito, quando praticado rotineiramente, pode ser usado para gerar grandes coortes de camundongos portadores de tumor com crescimento tumoral consistente.
As etapas críticas do protocolo que podem afetar a injeção bem-sucedida do tumor incluem a remoção da agulha do cérebro após a injeção de células e o uso de cera de osso. A agulha deve ser inserida e removida 1 mm de cada vez (conforme descrito nos passos 5 e 6), para evitar danos adicionais ao tecido cerebral circundante e o vazamento de células residuais ou refluxo da suspensão injetada14. O uso de cera de osso derretida para tapar e selar o orifício da agulha cria uma barreira para evitar o vazamento celular, assim como a implantação de células em uma suspensão de metilcelulose. É importante ressaltar que a metilcelulose deve ser misturada em uma solução tamponada, como PBS (ou, alternativamente, meio livre de soro) antes de ressuspender as células cerebrais. Além disso, o uso de anestesia inalatória é preferível à anestesia injetável, para encurtar o tempo de recuperação.
Observe que o tamanho da cabeça pode diferir ligeiramente entre as cepas de camundongos, ou por idade e sexo; Assim, o equipamento estereotáxico pode precisar ser recalibrado ao mudar de um tipo de coorte de camundongo para outro. Também recomendamos a otimização do número de células injetáveis para cada linhagem celular de interesse em um pequeno número de camundongos antes de prosseguir com uma grande coorte. Em comparação com xenoenxertos humanos, os tumores murinos podem crescer agressivamente quando reimplantados em camundongos compatíveis com cepas e requerem menos células para injeção, como observamos com as linhas de TRP.
Uma das principais vantagens da injeção cerebral ortotópica em comparação com o início e crescimento de glioblastoma em um modelo de GEM é que o tecido ao redor do tumor injetado é normal, e a invasividade local pode ser avaliada pela histopatologia. No entanto, não podemos descartar alterações no microambiente devido à própria ferida da injeção, que possivelmente resultem em uma resposta inflamatória local ou perturbação da barreira hematoencefálica.
Em conclusão, os modelos ortotópicos permitem o estudo do GBM, com um prazo razoável para o tratamento e dentro do contexto da localização do tumor nativo. Nosso modelo recapitula características do GBM humano, mas em um camundongo imunocompetente; portanto, o microambiente imune pode ser analisado em relação ao crescimento tumoral ou em resposta à imunoterapia. O crescimento tumoral é agressivo e invasivo, ao contrário de muitos modelos de GBM de linhagem celular em que o tumor permanece encapsulado e não exibe as características histológicas do GBM humano13,15,16. Quando realizado corretamente, o procedimento aqui descrito resulta em crescimento confiável do tumor, sem extravasamento celular ou disseminação extracraniana.
Finalmente, embora este protocolo tenha sido otimizado no contexto do GBM como um modelo ortotópico de camundongo, sua acurácia e aplicação confiável na tradução pré-clínica podem ser adaptadas a modelos de outras subclasses de tumores cerebrais. Os métodos e reagentes deste protocolo podem ser utilizados para diferentes implantes de tipos celulares portadores de mutações para o modelo de tumor cerebral de interesse (por exemplo, glioma difuso da linhamédia17), com o ajuste de coordenadas estereotáxicas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Sr. Alan E. Kulaga pela excelente assistência técnica e à Sra. Michelle L. Gumprecht pelo refinamento das técnicas cirúrgicas. Agradecemos ao Dr. Philip L. Martin pela análise patológica e à Sra. Lilia Ileva e ao Dr. Joseph Kalen, do Programa de Imagem de Pequenos Animais do Laboratório Nacional de Frederick, por exames de ressonância magnética.
Este projeto foi financiado, no todo ou em parte, com recursos federais do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, sob o Contrato nº HHSN261201500003I. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem a menção de nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implica endosso do Governo dos EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
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- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
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