Summary
Aquí, describimos un modelo de ratón ortotópico preclínico para GBM, establecido por inyección intracraneal de células derivadas de tumores modelo de ratón genéticamente modificados. Este modelo muestra las características de la enfermedad del GBM humano. Para estudios traslacionales, el tumor cerebral de ratón se rastrea mediante resonancia magnética in vivo e histopatología.
Abstract
Los modelos de ratón genéticamente modificados (GEM) para el glioblastoma multiforme humano (GBM) son fundamentales para comprender el desarrollo y la progresión de los tumores cerebrales. A diferencia de los tumores de xenoinjerto, en los GEM, los tumores surgen en el microambiente nativo en un ratón inmunocompetente. Sin embargo, el uso de GBM GEM en estudios de tratamiento preclínico es un desafío debido a las largas latencias tumorales, la heterogeneidad en la frecuencia de las neoplasias y el momento del desarrollo del tumor de grado avanzado. Los ratones inducidos a través de la inyección ortotópica intracraneal son más tratables para estudios preclínicos y conservan las características de los tumores GEM. Generamos un modelo de tumor cerebral ortotópico derivado de un modelo GEM con aberraciones Rb, Kras y p53 (TRP), que desarrolla tumores GBM que muestran focos lineales de necrosis por células neoplásicas y vascularización densa análoga al GBM humano. Las células derivadas de tumores GEM GBM se inyectan intracranealmente en ratones receptores de tipo salvaje y reproducen tumores de grado IV, evitando así el largo período de latencia tumoral en ratones GEM y permitiendo la creación de cohortes grandes y reproducibles para estudios preclínicos. Las características altamente proliferativas, invasivas y vasculares del modelo TRP GEM para GBM se recapitulan en los tumores ortotópicos, y los marcadores histopatológicos reflejan subgrupos de GBM humanos. El crecimiento del tumor se controla mediante resonancias magnéticas seriadas. Debido a la naturaleza invasiva de los tumores intracraneales en modelos inmunocompetentes, seguir cuidadosamente el procedimiento de inyección descrito aquí es esencial para prevenir el crecimiento de tumores extracraneales.
Introduction
El glioblastoma (GBM; glioma grado IV) es el tumor cerebral más común y maligno, y las terapias actuales son ineficaces, lo que resulta en una mediana de supervivencia de 15 meses1. Los modelos preclínicos confiables y precisos que representan las complejas vías de señalización involucradas en el crecimiento y la patogénesis del tumor cerebral son esenciales para acelerar el progreso en la evaluación de nuevos regímenes terapéuticos para GBM. Los modelos de ratón en los que las líneas celulares de tumores cerebrales humanos se implantan por vía subcutánea en ratones inmunocomprometidos no reflejan el entorno inmune nativo de los tumores cerebrales, ni pueden usarse para evaluar la capacidad de la terapéutica para cruzar la barrera hematoencefálica2. Idealmente, los modelos preclínicos de ratón también deberían reproducir de cerca la histopatología del GBM humano, incluido el alto nivel de invasividad en el parénquima circundante3. Aunque los modelos de ratón genéticamente modificados (GEM) desarrollan tumores en el contexto de un sistema inmune intacto, a menudo se requieren esquemas de reproducción complicados, y los tumores pueden desarrollarse lenta e inconsistentemente4. Los modelos de aloinjertos derivados de GEM son más adecuados para estudios terapéuticos preclínicos, donde se necesitan grandes cohortes de ratones portadores de tumores en un período de tiempo más corto.
En un informe anterior, describimos un modelo ortotópico de ratón GBM derivado directamente de tumores GEM. La tumorigénesis en el GEM se inicia por eventos genéticos en poblaciones celulares (principalmente astrocitos) que expresan proteína ácida fibrilar glial (GFAP), que resultan en progresión a GBM. Estos TRP GEM albergan un transgén TgGZT121 (T), que expresa T121 después de la exposición a la recombinasa Cre impulsada por GFAP. La expresión de la proteína T121 da como resultado la supresión de la actividad de la proteína Rb (Rb1, p107 y p103). La coexpresión de un transgén Cre impulsado por GFAP (GFAP-CreERT2) dirige la expresión a los astrocitos adultos después de la inducción con tamoxifeno. Los ratones TRP también albergan un Kras mutante dependiente de Cre (KrasG12D; R) alelos, para representar la activación de la vía de la tirosina quinasa receptora, y son heterocigotos para la pérdida de Pten(P)5,6. Las aberraciones genéticas concurrentes en las redes receptoras tirosina quinasa (RTK), PI3K y RB están implicadas en el 74% de la patogénesis del GBM7. Por lo tanto, las vías de señalización primarias alteradas en el GBM humano están representadas por las mutaciones modificadas en ratones TRP, en particular tumores GBM, en los que se activan objetivos descendentes compartidos de RTK5.
El modelo ortotópico singénico derivado de GEM se validó como un modelo que recapitula las características de los tumores cerebrales humanos, incluida la invasividad y la presencia de biomarcadores de subtipo, para su uso como plataforma para evaluar la terapéutica del cáncer dirigida a vías aberrantes en GBM. Las células se cultivaron a partir de tumores cosechados de cerebros TRP y se reimplantaron en el cerebro de ratones de cepa compatible, utilizando equipos estereotácticos para la inyección intracraneal en la corteza. Este modelo ortotópico preclínico de ratón desarrolló tumores GBM que eran altamente celulares, invasivos, pleomórficos con una alta tasa mitótica y mostraban focos lineales de necrosis por células neoplásicas y vascularización densa, como se observa para el GBM humano. Los volúmenes y el crecimiento tumoral se midieron mediante imágenes de resonancia magnética (RM) in vivo .
En este informe, describimos la técnica óptima para la inyección intracraneal de células GBM primarias o líneas celulares en el cerebro de ratón de tipo salvaje, utilizando tumores TRP como ejemplo. El mismo protocolo puede adaptarse para ratones inmunocomprometidos y otras líneas celulares GBM. Se dan consejos cruciales para evitar errores comunes, como la preparación de células subóptimas o fugas de células en el lugar de inyección, y para usar correctamente el equipo estereotáctico para garantizar la reproducibilidad y confiabilidad del modelo. Para fines traslacionales, validamos el modelo mediante la detección por resonancia magnética del crecimiento de tumores cerebrales en animales vivos, la caracterización histológica y presentamos un ejemplo de tratamiento en ratones portadores de tumores.
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Protocol
El protocolo del estudio descrito aquí fue aprobado por el NCI en el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Frederick. NCI-Frederick está acreditado por AAALAC International y sigue la Política del Servicio de Salud Pública para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El cuidado de los animales se proporcionó de acuerdo con los procedimientos descritos en la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (Consejo Nacional de Investigación, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).
1. Preparación de células para inyección
NOTA: Las células primarias de tumores cerebrales de ratón (MBR) utilizadas para este modelo se aislaron originalmente de ratones TRP GEM inducidos por tamoxifeno, como se describe en El Meskini et al.5. Los detalles sobre la preparación de la célula se pueden encontrar en esta referencia.
- Realice los siguientes pasos utilizando una técnica estéril en un gabinete de bioseguridad.
- Cultivar células tumorales cerebrales primarias in vitro hasta que alcancen la fase de crecimiento exponencial.
- Cosechar las células en tripsina al 0,25%, y una vez que se hayan desprendido, dilúyelas con medio de crecimiento para inactivar la tripsina.
- Granular las células por centrifugación a 400 x g y lavar con medios sin suero. Repita una vez antes de contar.
- Cuente las celdas manualmente o con un contador de celdas automatizado. Resuspender las células en metilcelulosa estéril al 5% en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) a la concentración deseada, basándose en un volumen de inyección final de 2 μL. La concentración celular deseada puede variar según la línea celular y el modelo de tumor cerebral. Para las células GBM GEM TRP, inyectamos 2 μL de una solución de 25 x 106 células/ml, o 50.000 células.
2. Tensión del ratón
- Críe o compre una cepa de ratón apropiada que coincida con el fondo de cepa de las células tumorales cerebrales. Para las células TRP, use ratones B6D2F1/J de 9 semanas de edad (de un cruce entre hembras C57BL/6J [B6] y machos DBA/2J [D2]) como receptores de células tumorales.
3. Configuración del área quirúrgica
NOTA: Todos los pasos quirúrgicos se llevan a cabo utilizando una técnica aséptica en un ambiente limpio y desinfectado. El cirujano debe usar batas y equipo de protección personal, incluida una máscara. Las herramientas quirúrgicas deben ser esterilizadas por calor antes de su uso.
- Coloque protectores de superficie debajo del aparato estereotáxico y en la superficie de trabajo.
- Conecte el tubo de vinilo de la máquina de anestesia al puerto IN de la plataforma de anestesia de gas del aparato estereotáxico y otro tubo al puerto de salida.
- Conecte la pantalla digital a una fuente de alimentación y al aparato.
- Conecte el controlador de la microbomba (Figura 1A) a una fuente de alimentación y conecte la microbomba (Figura 1A) al brazo manipulador del aparato (consulte también las instrucciones del fabricante).
- Ajuste la microbomba a 5,6 nL/s para la inyección de volumen de 2.000 nL.
- Encienda el esterilizador de perlas calientes.
- Enchufe la almohadilla térmica del ratón en el controlador de temperatura y conéctela a una fuente de alimentación. Coloque la placa en la plataforma del escenario. Ajuste la temperatura de la placa a 37 °C.
- Carga una jeringa de precisión de 30 G, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Inserte el émbolo y coloque la aguja. Asegúrese de agarrar la aguja solo por el cubo. Presione el émbolo hasta que una gota de la mezcla de células de metilcelulosa se dispense a través de la aguja. Limpie la aguja con una almohadilla de preparación de alcohol al 70% limpiando cuidadosamente los lados de la aguja o colocando una gasa estéril en la superficie de trabajo y secándola. Tenga cuidado de no doblar o romper la aguja.
- Conecte la jeringa de precisión a la microbomba y gire el brazo manipulador lejos del escenario, para evitar el desplazamiento de la jeringa-aguja antes de colocar el ratón en el escenario.
4. Preparación del ratón para la cirugía
- Anestesiar al ratón colocándolo en la cámara de inducción con el vaporizador de isoflurano ajustado al 2,5%, o de acuerdo con las directrices institucionales. Encienda el flujo de isoflurano a la nariz.
- Transfiera el ratón al aparato estereotáxico y asegúrelo a la nariz, con los dientes superiores colocados sobre el soporte de la nariz (Figura 1B, 9). Apriete la perilla de la nariz para asegurarla (Figura 1B). Asegúrese de un nivel adecuado de anestesia realizando un pellizco en el dedo del pie para verificar el reflejo.
- Controle el color (rosa) de las orejas, los pies y las membranas mucosas para asegurar una oxigenación adecuada. Además, controle la frecuencia respiratoria (un aumento o disminución podría indicar la necesidad de ajustar los niveles de isoflurano).
- Inserte barras para los oídos (Figura 1B) en ambos oídos y apriete la perilla para asegurar la cabeza.
- Aplique ungüento para los ojos para lubricar los ojos mientras el ratón está bajo anestesia.
- Use fórceps curvos para arrancar el pelo de la cabeza del ratón en un área aproximadamente un 150% más grande que la incisión planificada, para garantizar condiciones asépticas adecuadas.
- Inyecte 0.5-1 mg/kg de buprenorfina SR analgesia por vía subcutánea, o use otro analgésico aprobado por el protocolo.
- Coloque la sonda rectal del ratón para controlar la temperatura interna y prevenir la hipotermia debido a la anestesia. Mantenga la temperatura corporal del ratón entre 36,5 y 38,5 °C.
- Desinfecte el campo quirúrgico usando círculos hacia afuera, alternando entre un exfoliante quirúrgico y etanol tres veces.
- Usando fórceps para tensar la piel, haga una incisión de aproximadamente 1 cm con la hoja de bisturí, comenzando entre los ojos. El bregma debe ser visible a través de la incisión.
NOTA: Para una técnica estéril adecuada, toque el sitio quirúrgico solo con las puntas de las herramientas esterilizadas y coloque las puntas de las herramientas solo sobre una superficie estéril (como el interior de un paquete de herramientas esterilizado en autoclave). - Use el extremo de madera del aplicador con punta de algodón para raspar el exceso de tejido conectivo, y luego el extremo de algodón de otro aplicador para que se seque.
5. Inyección celular
- Devuelva el brazo manipulador con el accesorio de la jeringa sobre el ratón, apretando la perilla para asegurarla. Utilice las perillas X e Y en el plano horizontal para mover el soporte de la jeringa sobre bregma. Baje la aguja con la perilla Z para confirmar la posición del bregma. Establezca la consola de lectura digital en cero.
- Utilice las perillas X e Y y la lectura digital correspondiente para mover la aguja a la posición deseada. Para la ubicación de la corteza cortical, las coordenadas apropiadas son 3 mm posterior, 2 mm lateral derecho a la bregma y 2 mm de profundidad desde la duramadre. Use la perilla Z para mover la aguja a la superficie del cráneo.
- Perfore un orificio en el cráneo con una jeringa de 1 ml con una aguja de 25 G adjunta. Coloque el bisel de la aguja hacia la jeringa y la aguja de precisión de 30 G, y gire con cuidado el brazo manipulador hacia un lado. Con el pulgar y el dedo, haga rodar la aguja hacia adelante y hacia atrás lentamente con una presión suave hasta que la punta de la aguja perfore la tapa del cráneo.
- Use un aplicador con punta de algodón para eliminar cualquier sangre del orificio de la aguja. Coloque el brazo manipulador en la posición adecuada con la aguja de jeringa de precisión cargada por encima del orificio. Alinee la punta de la aguja con el orificio, usando la perilla Z para bajar la aguja hasta la duramadre cerebral, y ajuste la consola de lectura digital a cero.
- Con la perilla Z, baje la aguja 1 mm y, a continuación, espere 1 minuto. Repita hasta alcanzar la profundidad deseada (2 mm como se indica).
NOTA: La aguja se baja lentamente para evitar daños adicionales al tejido cerebral circundante y el reflujo de la solución celular. - Encienda la microbomba y luego monitoree para asegurarse de que la bomba se detenga cuando se hayan inyectado 2 μL. Este proceso debería tomar aproximadamente 6 minutos a la velocidad indicada. Luego, espere 1 minuto antes de mover la aguja.
6. Extracción de la aguja y cierre de la herida
- Levante la aguja 1 mm y luego espere 1 min. Repita hasta que la aguja esté completamente libre del cráneo.
- Si es necesario, use un aplicador con punta de algodón para eliminar cualquier sangre del sitio de inyección.
- Usando el extremo de madera de un aplicador con punta de algodón, tome un pequeño trozo de cera ósea (~ 1 mm) y forme un cono. Colóquelo en la abertura del cráneo, empujando la cera hacia el agujero.
- Caliente las pinzas con un esterilizador de cuentas y úselas para derretir la cera restante en el cráneo y alisarla.
- Coloque aproximadamente dos gotas de solución de bupivacaína (anestésico) en la incisión y use fórceps para unir los bordes de la piel.
- Tire de la piel tensa y coloque uno o dos clips para heridas para cerrar la piel.
- Coloque el ratón en una jaula de recuperación limpia sobre una almohadilla térmica en un área libre de corrientes de aire, y observe de cerca el ratón. Permita que el ratón se despierte completamente de la anestesia, reanudando la actividad normal, antes de devolverlo a la vivienda normal.
- Revise el ratón diariamente después del procedimiento quirúrgico y administre el manejo del dolor, de acuerdo con las pautas institucionales.
- Si se utiliza buprenorfina SR (Paso 4.6) para analgesia, la fórmula de liberación sostenida dura 72 h. Repita la inyección sólo si hay dolor o malestar visible después de 72 h. Cuando se realiza correctamente, los ratones se recuperan bien de las inyecciones intracraneales y no se necesita analgesia adicional.
- Retire las grapas 7-10 días después de la cirugía.
- Monitorear el crecimiento del tumor mediante imágenes de animales vivos (MRI).
- Eutanasia a los ratones cuando se alcanzan los puntos finales humanitarios (es decir, si el animal pierde el 20% del peso corporal o se vuelve hipotérmico).
- Debido a la naturaleza invasiva de estos tumores cerebrales, observe a los ratones para detectar síntomas neurológicos, como marcha desigual, parálisis parcial, giro o inclinación de la cabeza. Eutanasia a un ratón si se observa alguno de estos signos clínicos de crecimiento tumoral avanzado.
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Representative Results
Los ratones inyectados con células tumorales cerebrales deben ser monitoreados diariamente para detectar signos de crecimiento tumoral, como convulsiones, ataxia o pérdida de peso. El crecimiento del tumor cerebral también se puede controlar mediante una resonancia magnética a intervalos regulares. Las resonancias magnéticas semanales permiten visualizar el aumento de la carga tumoral dentro del cerebro y las mediciones del volumen tumoral (Figura 1C). En particular, los tumores TRP exhiben un crecimiento agresivo, y los volúmenes tumorales 3D se pueden medir mediante resonancia magnética dentro de 2 a 3 semanas después de la inyección intracraneal (con un volumen promedio de 30 a 40 mm3). En un estudio representativo, una cohorte de ratones portadores de tumores cerebrales se dividió en dos grupos para el control versus la radioterapia; La medición del volumen tumoral por RM reveló una falta de supresión del crecimiento tumoral después del tratamiento con radiación (Figura 2A), lo que no dio lugar a un aumento de la supervivencia de los ratones tratados (Figura 2B).
En la necropsia, los tumores pueden aparecer como una mancha oscura en el cerebro dentro de un hemisferio derecho hinchado (Figura 3A, panel central), o en el caso de tumores más grandes, como una región elevada y oscura. Para el análisis histopatológico, la sección sagital a través de la región del sitio de inyección (Figura 3A) permite una evaluación óptima del crecimiento tumoral y el grado de invasión en el tejido cerebral no maligno. Los tumores GBM en modelos singénicos pueden crecer agresivamente y romper el cráneo por el punto final terminal, lo que se puede observar en la necropsia. En contraste, el crecimiento extracraneal poco después de la implantación celular probablemente indica una fuga de células durante la inyección, que se puede observar en imágenes de resonancia magnética (Figura 3B), o en un ratón vivo por un área abovedada en la cabeza. Es posible que la aguja se haya retirado del lugar de inyección demasiado rápido (ver sección 6). El crecimiento extracraneal se confirma como fuga en el lugar de la inyección mediante evaluación histológica.
En el modelo ortotópico TRP, la histopatología confirmó la presencia de astrocitoma/GBM de grado IV, incluida la recapitulación de las características distintivas observadas en los tumores TRP GEM, como pseudopalisading y necrosis (Figura 4). Los marcadores progenitores y de células madre neurales GBM descritos para la subclasificación de GBM humano se evaluaron mediante inmunohistoquímica (Figura 5). La expresión generalizada de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) indica un tumor proliferativo de origen progenitor astrocítico, mientras que Nestin y Sox-2 son marcadores progenitores neuronales establecidos, y la expresión de Olig-2 confirma la presencia de células de origen oligodendrocítico 5,7. Los cuatro marcadores están altamente expresados en subtipos de GBM8 humano.
Figura 1: Configuración del aparato de implante intracraneal y crecimiento de tumores TRP GBM visualizados por resonancia magnética seriada. (A) Configuración del aparato con diferentes elementos necesarios para el implante intracraneal (1 a 11 descrito); la colocación específica de la cabeza del ratón y la unidad de anestesia por inhalación se magnifican en (B). Las imágenes semanales se realizaron en un escáner clínico MRI 3.0T conuna bobina de superficie SENSE Array 5,9 de cuatro ratones hecha a medida. Secuencia de eco de giro turbo ponderado T2 de múltiples cortes (T2w-TSE): (TR / TE (4437/100 ms), en resolución plana (0,12 x 0,15 mm), grosor de corte (0,5 mm), factor de aceleración SENSE (4) se adquirieron imágenes en el plano axial para cubrir todo el cerebro del ratón. Se muestran secciones coronales de tumores a las 3, 4 y 5 semanas después del implante. Una barra de escala representativa para imágenes de resonancia magnética se indica en la parte inferior derecha (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estudio representativo de eficacia de un modelo ortotópico de GBM con radioterapia. (A) Volúmenes tumorales tridimensionales calculados a partir de imágenes de resonancia magnética, correspondientes a las semanas 2, 3 y 4 de implantes posttumorales. Los volúmenes de los tumores cerebrales se midieron a través del análisis de las imágenes de resonancia magnética. Después de cargar una imagen de resonancia magnética en el programa ITK_SNAP, se ajustaron el contraste de la imagen y el filtro de región de intensidad de la imagen. Tras la inicialización activa del contorno y la segmentación de la imagen, el volumen tumoral se midió en milimieters cúbicos. Se representan los ratones de control individual (no tratados) y los ratones tratados por irradiación (3 Gy por día durante 5 días para un total de 15 Gy). (B) Supervivencia de ratones tratados con radiación en comparación con el control. El porcentaje de supervivencia se calculó con un software gráfico (ver Tabla de materiales) de un total de n = 11 ratones no tratados y n = 12 ratones tratados con radiación. Los ratones de estudio fueron sacrificados a medida que se alcanzaban los criterios de valoración humanos, según nuestras pautas institucionales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ubicación del tumor en el cerebro en la necropsia. (A) Ubicación correcta del crecimiento tumoral en el hemisferio derecho del ratón. El panel izquierdo muestra un ejemplo de un tumor dentro del cerebro de una resonancia magnética al finalizar el estudio; La flecha roja indica la ubicación del tumor. El cerebro del ratón disecado se muestra dentro del cráneo (panel central) y se retira de la cavidad craneal (panel derecho). En el panel central, las flechas azules indican el impacto de la aguja del sitio de inyección, y las flechas de dos puntas indican la ubicación recomendada del corte sagital cerebral para la histología, dividiendo el hemisferio derecho en dos partes. Ambas partes del cerebro están incrustadas en parafina en forma de "libro abierto". La línea discontinua indica como referencia la fisura longitudinal mediana que separa los dos hemisferios cerebrales. En el panel derecho, el área encerrada por la línea discontinua representa la región tumoral visible en la necropsia. (B) Un ejemplo de un tumor cerebral que crece fuera del cráneo del ratón se muestra en la resonancia magnética. En la Figura 3A se muestra una barra de escala representativa para ambas imágenes de resonancia magnética. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La histopatología de los tumores ortotópicos de TRP GBM recapitula las características distintivas del GBM humano. Las secciones sagitales teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) de todo el cerebro fueron evaluadas por un patólogo veterinario certificado por la junta ACVP, y los tumores se clasificaron según la clasificación actual de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para astrocitomas humanos10,11. Los tumores ortotópicos de GBM son altamente proliferativos, invasivos (I) y vascularizados (V), y exhiben características distintivas de la histopatología del GBM humano, incluyendo necrosis (N) y pseudopalisading (P) por células neoplásicas12. Las líneas discontinuas muestran la ampliación de las áreas dentro del tumor cerebral y en la periferia, adyacentes al tejido cerebral normal (arriba y abajo a la derecha, respectivamente). Los anticuerpos y métodos para inmunohistoquímica se describen en El Meskini et al.5. Se muestra una barra de escala para imágenes de H&E para aumentos bajos y altos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Biomarcadores de GBM expresados en el modelo ortotópico. La expresión del marcador progenitor multipotente SOX-2 (SRY-Box transcription factor 2), los progenitores neurales Nestin y Olig-2, y el marcador astrocítico glial fibrilar ácido (GFAP) indican heterogeneidad celular, una característica común del GBM humano 7,8. Una barra de escala representativa para todas las imágenes IHQ se muestra en Olig2 (Oligodendrocitos transcription factor 2; abajo a la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los modelos preclínicos son esenciales para la evaluación de nuevas dianas terapéuticas y nuevas estrategias de tratamiento en GBM. Los modelos de ratón genéticamente modificados para GBM tienen la ventaja de la aparición de tumores en el sitio autóctono, pero a menudo con una latencia larga y un crecimiento tumoral impredecible13. Los tumores modelo GEM exhiben una latencia de 4-5 meses, y la ventana de tiempo ideal para la obtención de imágenes, el reclutamiento y el tratamiento es variable entre ratones individuales. El modelo ortotópico tiene una línea de tiempo de crecimiento y tratamiento bien establecida y manejable de 4-5 semanas, y los tumores se detectan de manera confiable mediante resonancia magnética después del implante. El uso de modelos ortotópicos derivados de GEM permite la colocación del tumor en la ubicación exacta en cada ratón, así como el control temporal de la iniciación del crecimiento tumoral, manteniendo la ventaja del microambiente cerebral circundante. En el modelo ortotópico TRP, las vías RTK, PTEN y RB activadas producen un modelo tumoral que recapitula las características histológicas del GBM humano. Análogamente a la GBM humana, los tumores ortotópicos TRP GBM muestran características de crecimiento agresivo, como focos necróticos rodeados de células neoplásicas pseudoempalizadas y neovascularización. Los tumores también son invasivos en el parénquima cerebral circundante. Por lo tanto, los agentes que pueden suprimir la infiltración y migración tumoral en pacientes se pueden evaluar preclínicamente en tumores ortotópicos TRP. El proceso de inyección de células de tumores GEM invasivos en ratones singénicos requiere especial precaución, para evitar la fuga involuntaria y el crecimiento de células fuera de la región objetivo. El método descrito aquí, cuando se practica rutinariamente, se puede usar para generar grandes cohortes de ratones portadores de tumores con un crecimiento tumoral constante.
Los pasos críticos en el protocolo que pueden afectar la inyección exitosa del tumor incluyen la extracción de la aguja de la inyección cerebral posterior a la célula y el uso de cera ósea. La aguja debe insertarse y retirarse 1 mm a la vez (como se describe en los pasos 5 y 6), para evitar daños adicionales al tejido cerebral circundante y la fuga de células residuales o el reflujo de la suspensión inyectada14. El uso de cera de hueso derretida para tapar y sellar el orificio de la aguja crea una barrera para evitar la fuga celular, al igual que la implantación de células en una suspensión de metilcelulosa. Es importante destacar que la metilcelulosa debe mezclarse en una solución tamponada como PBS (o, alternativamente, medios sin suero) antes de resuspender las células cerebrales. Además, se prefiere el uso de anestesia por inhalación sobre la anestesia inyectable, para acortar el tiempo de recuperación.
Tenga en cuenta que el tamaño de la cabeza puede diferir ligeramente entre las cepas de ratón, o por edad y sexo; Por lo tanto, es posible que sea necesario recalibrar el equipo estereotáctico al cambiar de un tipo de cohorte de ratón a otro. También recomendamos la optimización del número de células para inyección para cada línea celular de interés en un pequeño número de ratones antes de proceder con una gran cohorte. En comparación con los xenoinjertos humanos, los tumores murinos pueden crecer agresivamente cuando se reimplantan en ratones de cepa y requieren menos células para la inyección, como observamos con las líneas TRP.
Una ventaja clave de la inyección cerebral ortotópica en comparación con el inicio y el crecimiento del glioblastoma en un modelo GEM es que el tejido que rodea el tumor inyectado es normal y la invasividad local puede evaluarse mediante histopatología. Sin embargo, no podemos descartar cambios en el microambiente debido a la propia herida de la inyección, que posiblemente den lugar a una respuesta inflamatoria local o a una perturbación de la barrera hematoencefálica.
En conclusión, los modelos ortotópicos permiten el estudio del GBM, con un cronograma razonable para el tratamiento y dentro del contexto de la ubicación del tumor nativo. Nuestro modelo recapitula las características del GBM humano, pero en un ratón inmunocompetente; Por lo tanto, el microambiente inmune puede analizarse en relación con el crecimiento tumoral o en respuesta a la inmunoterapia. El crecimiento tumoral es agresivo e invasivo, a diferencia de muchos modelos de GBM de xenoinjerto de línea celular en los que el tumor permanece encapsulado y no presenta las características histológicas del GBM humano13,15,16. Cuando se realiza correctamente, el procedimiento descrito aquí da como resultado un crecimiento tumoral confiable sin fuga de células o diseminación extracraneal.
Por último, aunque este protocolo se ha optimizado en el contexto del GBM como modelo ortotópico de ratón, su precisión y aplicación fiable en la traducción preclínica puede adaptarse a modelos de otras subclases de tumores cerebrales. Los métodos y reactivos en este protocolo se pueden utilizar para diferentes tipos de implantes celulares portadores de mutaciones para el modelo de tumor cerebral de interés (por ejemplo, glioma difuso de línea media17), con el ajuste de coordenadas estereotáxicas.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. Alan E. Kulaga su excelente asistencia técnica y a la Sra. Michelle L. Gumprecht el perfeccionamiento de las técnicas quirúrgicas. Agradecemos al Dr. Philip L. Martin por el análisis de patología y a la Sra. Lilia Ileva y al Dr. Joseph Kalen del Programa de Imágenes de Animales Pequeños del Laboratorio Nacional Frederick por las exploraciones por resonancia magnética.
Este proyecto ha sido financiado en su totalidad o en parte con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. HHSN261201500003I. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica el respaldo del Gobierno de los Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
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- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
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