Modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme

Summary

Ici, nous décrivons un modèle murin orthotopique préclinique pour le GBM, établi par injection intracrânienne de cellules dérivées de tumeurs modèles de souris génétiquement modifiées. Ce modèle présente les caractéristiques de la maladie du GBM humain. Pour les études translationnelles, la tumeur cérébrale de souris est suivie par IRM in vivo et histopathologie.

Abstract

Les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) pour le glioblastome multiforme humain (GBM) sont essentiels pour comprendre le développement et la progression des tumeurs cérébrales. Contrairement aux tumeurs xénogreffées, dans les GEM, les tumeurs apparaissent dans le microenvironnement natif chez une souris immunocompétente. Cependant, l’utilisation des GEM GBM dans les études de traitement précliniques est difficile en raison des longues latences tumorales, de l’hétérogénéité de la fréquence des néoplasmes et du moment du développement tumoral de grade avancé. Les souris induites par injection orthotopique intracrânienne sont plus traitables pour les études précliniques et conservent les caractéristiques des tumeurs GEM. Nous avons généré un modèle orthotopique de tumeur cérébrale dérivé d’un modèle GEM avec aberrations Rb, Kras et p53 (TRP), qui développe des tumeurs GBM présentant des foyers linéaires de nécrose par des cellules néoplasiques et une vascularisation dense analogue au GBM humain. Les cellules dérivées des tumeurs GBM GEM sont injectées par voie intracrânienne dans des souris receveuses de type sauvage et appariées à la souche et reproduisent les tumeurs de grade IV, contournant ainsi la longue période de latence tumorale chez les souris GEM et permettant la création de cohortes importantes et reproductibles pour les études précliniques. Les caractéristiques hautement prolifératives, invasives et vasculaires du modèle TRP GEM pour le GBM sont récapitulées dans les tumeurs orthotopiques, et les marqueurs histopathologiques reflètent les sous-groupes de GBM humains. La croissance tumorale est surveillée par des IRM en série. En raison de la nature invasive des tumeurs intracrâniennes dans les modèles immunocompétents, il est essentiel de suivre attentivement la procédure d’injection décrite ici pour prévenir la croissance tumorale extracrânienne.

Introduction

Le glioblastome (GBM; gliome de grade IV) est la tumeur cérébrale la plus courante et maligne, et les traitements actuels sont inefficaces, entraînant une survie médiane de 15 mois¹. Des modèles précliniques fiables et précis qui représentent les voies de signalisation complexes impliquées dans la croissance des tumeurs cérébrales et la pathogenèse sont essentiels pour accélérer les progrès dans l’évaluation de nouveaux schémas thérapeutiques pour le GBM. Les modèles murins dans lesquels des lignées cellulaires de tumeurs cérébrales humaines sont implantées par voie sous-cutanée chez des souris immunodéprimées ne reflètent pas l’environnement immunitaire natif des tumeurs cérébrales et ne peuvent pas non plus être utilisés pour évaluer la capacité des traitements à traverser la barrière hémato-encéphalique². Idéalement, les modèles murins précliniques devraient également reproduire étroitement l’histopathologie du GBM humain, y compris le niveau élevé d’invasivité dans le parenchyme environnant³. Bien que les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) développent des tumeurs dans le contexte d’un système immunitaire intact, des schémas de sélection compliqués sont souvent nécessaires et les tumeurs peuvent se développer lentement et de manière incohérente⁴. Les modèles d’allogreffe dérivés de GEM sont mieux adaptés aux études thérapeutiques précliniques, où de grandes cohortes de souris porteuses de tumeurs sont nécessaires dans un délai plus court.

Dans un rapport précédent, nous avons décrit un modèle murin orthotopique GBM dérivé directement des tumeurs GEM. La tumorigenèse dans le GEM est initiée par des événements génétiques dans les populations cellulaires (principalement les astrocytes) exprimant la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), qui entraînent une progression vers le GBM. Ces GEM TRP hébergent un transgène TgGZT121 (T), qui exprime T121 après exposition à la Cre recombinase pilotée par GFAP. L’expression de la protéine T121 entraîne la suppression de l’activité des protéines Rb (Rb1, p107 et p103). La co-expression d’un transgène Cre piloté par GFAP (GFAP-CreERT2) cible l’expression aux astrocytes adultes après induction avec le tamoxifène. Les souris TRP hébergent également un Kras mutant dépendant de Cre (Kras^G12D; R) allèle, pour représenter l’activation du récepteur tyrosine kinase voie, et sont hétérozygotes pour la perte de Pten (P)^5,6. Des aberrations génétiques concomitantes dans les réseaux du récepteur tyrosine kinase (RTK), PI3K et RB sont impliquées dans 74% de la pathogenèse GBM⁷. Par conséquent, les principales voies de signalisation altérées dans le GBM humain sont représentées par les mutations modifiées chez les souris TRP, en particulier les tumeurs GBM, dans lesquelles les cibles partagées en aval des RTK sont activées⁵.

Le modèle orthotopique syngénique dérivé de GEM a été validé en tant que modèle récapitulant les caractéristiques des tumeurs cérébrales humaines, y compris le caractère invasif et la présence de biomarqueurs de sous-type, pour une utilisation comme plate-forme pour évaluer les traitements anticancéreux ciblant les voies aberrantes dans le GBM. Les cellules ont été cultivées à partir de tumeurs prélevées dans les cerveaux TRP et réimplantées dans le cerveau de souris appariées à la souche, en utilisant un équipement stéréotaxique pour l’injection intracrânienne dans le cortex. Ce modèle murin orthotopique préclinique a développé des tumeurs GBM hautement cellulaires, invasives, pléomorphes avec un taux mitotique élevé, et présentait des foyers linéaires de nécrose par des cellules néoplasiques et une vascularisation dense, comme observé pour le GBM humain. Les volumes tumoraux et la croissance ont été mesurés par imagerie par résonance magnétique (IRM) in vivo .

Dans ce rapport, nous décrivons la technique optimale pour l’injection intracrânienne de cellules GBM primaires ou de lignées cellulaires dans le cerveau de souris de type sauvage, en utilisant les tumeurs TRP comme exemple. Le même protocole peut être adapté pour les souris immunodéprimées et d’autres lignées cellulaires GBM. Des conseils cruciaux sont donnés pour éviter les pièges courants, tels que la préparation sous-optimale des cellules ou les fuites de cellules au site d’injection, et pour utiliser correctement l’équipement stéréotaxique afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité du modèle. À des fins translationnelles, nous validons le modèle par détection IRM de la croissance des tumeurs cérébrales chez les animaux vivants, la caractérisation histologique, et présentons un exemple de traitement chez des souris porteuses de tumeurs.

Protocol

Le protocole d’étude décrit ici a été approuvé par le NCI au Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick est accrédité par AAALAC International et suit la politique du service de santé publique pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les soins aux animaux ont été fournis conformément aux procédures décrites dans le Guide de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire (Conseil national de recherches, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).

1. Préparation des cellules injectables

REMARQUE: Les cellules primaires de tumeurs cérébrales de souris (MBR) utilisées pour ce modèle ont été isolées à l’origine chez des souris TRP GEM induites par le tamoxifène, comme décrit dans El Meskini et ^al.5. Des détails sur la préparation cellulaire peuvent être trouvés dans cette référence.

1. Effectuer les étapes suivantes en utilisant une technique stérile dans une enceinte de biosécurité.
2. Culture in vitro de cellules tumorales cérébrales primaires jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance exponentielle.
3. Récoltez les cellules dans 0,25% de trypsine, et une fois qu’elles se sont détachées, diluez-les avec un milieu de croissance pour inactiver la trypsine.
4. Enduire les cellules par centrifugation à 400 x g et laver avec un média sans sérum. Répétez une fois avant de compter.
5. Comptez les cellules manuellement ou avec un compteur de cellules automatisé. Resuspendre les cellules dans de la méthylcellulose stérile à 5 % dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à la concentration désirée, sur la base d’un volume d’injection final de 2 μL. La concentration cellulaire souhaitée peut varier en fonction de la lignée cellulaire et du modèle de tumeur cérébrale. Pour les cellules GBM GEM TRP, nous injectons 2 μL d’une solution de 25 x 10⁶ cellules/ml, soit 50 000 cellules.

2. Souche de souris

1. Breed ou acheter une souche de souris appropriée qui correspond au fond de souche des cellules tumorales cérébrales. Pour les cellules TRP, utilisez des souris B6D2F1/J âgées de 9 semaines (issues d’un croisement entre des femelles C57BL/6J [B6] et des mâles DBA/2J [D2]) comme receveurs de cellules tumorales.

3. Mise en place de la zone chirurgicale

REMARQUE: Toutes les étapes chirurgicales sont effectuées à l’aide d’une technique aseptique dans un environnement propre et désinfecté. Le chirurgien doit porter des gommages et de l’équipement de protection individuelle, y compris un masque. Les outils chirurgicaux doivent être stérilisés thermiquement avant utilisation.

1. Placer des protecteurs de surface sous l’appareil stéréotaxique et sur la surface de travail.
2. Fixez le tube en vinyle de l’appareil d’anesthésie au port d’entrée de la plate-forme d’anesthésie gazeuse de l’appareil stéréotaxique et un autre tube au port OUT.
3. Connectez l’écran numérique à une source d’alimentation et à l’appareil.
4. Connectez le contrôleur de micropompe (Figure 1A) à une source d’alimentation et fixez la micropompe (Figure 1A) au bras manipulateur de l’appareil (voir également les instructions du fabricant).
5. Réglez la micropompe à 5,6 nL/s pour l’injection volumique de 2 000 nL.
6. Allumez le stérilisateur de billes chaudes.
7. Branchez le coussin chauffant de la souris dans le régulateur de température et connectez-le à une source d’alimentation. Placez l’assiette sur la plate-forme de scène. Réglez la température de la plaque à 37 °C.
8. Chargez une seringue de précision de 30 G, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Insérez le piston et fixez l’aiguille. Assurez-vous de saisir l’aiguille uniquement par le moyeu. Appuyez sur le piston jusqu’à ce qu’une goutte du mélange de cellules de méthylcellulose passe par l’aiguille. Nettoyez l’aiguille avec un tampon de préparation d’alcool à 70 % en essuyant soigneusement les côtés de l’aiguille ou en plaçant un tampon de gaze stérile sur la surface de travail et en l’épongeant. Veillez à ne pas plier ou casser l’aiguille.
9. Fixez la seringue de précision à la micropompe et faites pivoter le bras manipulateur loin de la scène, pour éviter le déplacement de l’aiguille de la seringue avant de placer la souris sur la scène.

4. Préparer la souris à la chirurgie

1. Anesthésiez la souris en la plaçant dans la chambre d’induction avec le vaporisateur d’isoflurane réglé à 2,5%, ou selon les directives institutionnelles. Activez le flux d’isoflurane vers le nez.
2. Transférer la souris dans l’appareil stéréotaxique et la fixer au nez, les dents du haut étant positionnées sur le support du nez (Figure 1B, 9). Serrez le bouton du nez pour le fixer (Figure 1B). Assurez-vous d’un niveau approprié d’anesthésie en effectuant un pincement des orteils pour vérifier les réflexes.
   1. Surveillez la couleur (rose) des oreilles, des pieds et des muqueuses pour assurer une oxygénation adéquate. Surveillez également la fréquence respiratoire (une augmentation ou une diminution pourrait indiquer la nécessité d’ajuster les niveaux d’isoflurane).
3. Insérez des barres d’oreille (Figure 1B) dans les deux oreilles et serrez le bouton pour fixer la tête.
4. Appliquez une pommade pour les yeux pour lubrifier les yeux pendant que la souris est sous anesthésie.
5. Utilisez des pinces incurvées pour arracher les poils sur la tête de la souris à une zone environ 150% plus grande que l’incision prévue, afin d’assurer des conditions aseptiques adéquates.
6. Injecter 0,5-1 mg / kg buprénorphine SR analgésie par voie sous-cutanée, ou utiliser un autre analgésique approuvé par le protocole.
7. Positionnez la sonde rectale de la souris pour surveiller la température interne et prévenir l’hypothermie due à l’anesthésie. Maintenez la température corporelle de la souris entre 36,5 et 38,5 °C.
8. Désinfectez le champ chirurgical à l’aide de cercles extérieurs, en alternant trois fois entre un gommage chirurgical et de l’éthanol.
9. À l’aide d’une pince pour tirer la peau tendue, faites une incision d’environ 1 cm avec la lame du scalpel, en commençant entre les yeux. Le bregma doit être visible à travers l’incision.
   REMARQUE: Pour une technique stérile appropriée, touchez le site chirurgical uniquement avec les pointes d’outils stérilisés et placez les pointes d’outils sur une surface stérile uniquement (comme l’intérieur d’un paquet d’outils autoclavé).
10. Utilisez l’extrémité en bois de l’applicateur à embout de coton pour gratter l’excès de tissu conjonctif, puis l’extrémité en coton d’un autre applicateur pour sécher.

5. Injection cellulaire

1. Retournez le bras manipulateur avec la fixation de la seringue sur la souris, en serrant le bouton pour le fixer. Utilisez les boutons X et Y dans le plan horizontal pour déplacer le support de seringue sur le bregma. Abaissez l’aiguille à l’aide du bouton Z pour confirmer la position du bregma. Réglez la console de lecture numérique sur zéro.
2. Utilisez les boutons X et Y et le relevé numérique correspondant pour déplacer l’aiguille dans la position souhaitée. Pour l’emplacement du cortex cortical, les coordonnées appropriées sont 3 mm postérieur, 2 mm latéralement droit au bregma et 2 mm de profondeur de la dure-mère. Utilisez le bouton Z pour déplacer l’aiguille à la surface du crâne.
3. Percez un trou dans le crâne à l’aide d’une seringue de 1 ml munie d’une aiguille de 25 g. Placez le biseau de l’aiguille vers la seringue et l’aiguille de précision 30 G et tournez soigneusement le bras manipulateur sur le côté. À l’aide du pouce et du doigt, roulez l’aiguille d’avant en arrière lentement en appuyant doucement jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille ne fasse que percer la calotte crânienne.
4. Utilisez un applicateur à embout de coton pour tamponner le sang loin du trou de l’aiguille. Replacez le bras manipulateur dans la position appropriée à l’aide de l’aiguille de seringue de précision chargée au-dessus du trou. Alignez la pointe de l’aiguille avec le trou, en utilisant le bouton Z pour abaisser l’aiguille jusqu’à la mémoire cérébrale, et réglez la console de lecture numérique à zéro.
5. À l’aide du bouton Z, abaissez l’aiguille de 1 mm, puis attendez 1 min. Répéter jusqu’à ce que la profondeur désirée soit atteinte (2 mm comme indiqué).
   REMARQUE: L’aiguille est abaissée lentement pour éviter des dommages supplémentaires au tissu cérébral environnant et le reflux de la solution cellulaire.
6. Démarrez la micropompe, puis surveillez pour vous assurer que la pompe s’arrête lorsque 2 μL ont été injectés. Ce processus devrait prendre environ 6 minutes à la vitesse indiquée. Ensuite, attendez 1 min avant de déplacer l’aiguille.

6. Retrait de l’aiguille et fermeture de la plaie

1. Soulevez l’aiguille de 1 mm, puis attendez 1 min. Répétez jusqu’à ce que l’aiguille soit complètement libre du crâne.
2. Si nécessaire, utilisez un applicateur à embout de coton pour tamponner le sang loin du site d’injection.
3. À l’aide de l’extrémité en bois d’un applicateur à embout de coton, prenez un petit morceau de cire d’os (~ 1 mm) et façonnez-le en cône. Placez-le dans l’ouverture du crâne, en poussant la cire dans le trou.
4. Forceps thermiques à l’aide d’un stérilisateur à billes et utilisez-les pour faire fondre la cire restante sur le crâne et lisser.
5. Placez environ deux gouttes de solution de bupivacaïne (anesthésique) dans l’incision et utilisez une pince pour rapprocher les bords de la peau.
6. Tirez la peau tendue et placez une ou deux pinces pour fermer la peau.
7. Placez la souris dans une cage de récupération propre sur un coussin chauffant dans une zone sans courant d’air et observez attentivement la souris. Laissez la souris se réveiller complètement de l’anesthésie, en reprenant une activité normale, avant de la remettre dans un logement normal.
8. Vérifiez la souris tous les jours après l’intervention chirurgicale et administrez la gestion de la douleur, conformément aux directives de l’établissement.
   1. Si la buprénorphine SR (étape 4.6) est utilisée pour l’analgésie, la formule à libération prolongée dure 72 h. Répétez l’injection uniquement si une douleur ou un inconfort visible est présent après 72 h. Lorsqu’elles sont effectuées correctement, les souris récupèrent bien des injections intracrâniennes et une analgésie supplémentaire n’est pas nécessaire.
   2. Retirez les agrafes 7 à 10 jours après la chirurgie.
9. Surveiller la croissance tumorale par imagerie d’animaux vivants (IRM).
   1. Euthanasier les souris lorsque les paramètres sans cruauté sont atteints (c.-à-d. si l’animal perd 20 % de son poids corporel ou devient hypothermique).
   2. En raison de la nature invasive de ces tumeurs cérébrales, observez les souris pour les symptômes neurologiques, tels que la démarche inégale, la paralysie partielle, la rotation ou l’inclinaison de la tête. Euthanasier une souris si l’un de ces signes cliniques de croissance tumorale avancée est observé.

Representative Results

Les souris injectées avec des cellules tumorales cérébrales doivent être surveillées quotidiennement pour détecter des signes de croissance tumorale tels que des convulsions, une ataxie ou une perte de poids. La croissance des tumeurs cérébrales peut également être surveillée par IRM à intervalles réguliers. Les IRM hebdomadaires permettent de visualiser l’augmentation de la charge tumorale dans le cerveau et les mesures du volume tumoral (Figure 1C). En particulier, les tumeurs TRP présentent une croissance agressive, et les volumes tumoraux 3D sont mesurables par IRM dans les 2 à 3 semaines post-injection intracrânienne (avec un volume moyen de 30 à 40^mm3). Dans une étude représentative, une cohorte de souris porteuses de tumeurs cérébrales a été divisée en deux groupes pour le contrôle par rapport à la radiothérapie; La mesure du volume tumoral par IRM a révélé un manque de suppression de la croissance tumorale après la radiothérapie (Figure 2A), ce qui n’a entraîné aucune augmentation de la survie des souris traitées (Figure 2B).

Lors de la nécropsie, les tumeurs peuvent apparaître comme une tache sombre sur le cerveau dans un hémisphère droit enflé (Figure 3A, panneau du milieu), ou dans le cas de tumeurs plus grandes, comme une région surélevée et sombre. Pour l’analyse histopathologique, la coupe sagittale à travers la région du site d’injection (Figure 3A) permet une évaluation optimale de la croissance tumorale et de l’étendue de l’invasion dans le tissu cérébral non malin. Les tumeurs GBM dans les modèles syngéniques peuvent se développer agressivement et percer le crâne par le point final terminal, ce qui peut être observé à l’autopsie. En revanche, la croissance extracrânienne peu de temps après l’implantation cellulaire indique probablement une fuite de cellules pendant l’injection, ce qui peut être observé sur les IRM (Figure 3B), ou chez une souris vivante par une zone bombée sur la tête. L’aiguille peut avoir été retirée trop rapidement du site d’injection (voir rubrique 6). La croissance extracrânienne est confirmée par une fuite au site d’injection par une évaluation histologique.

Dans le modèle orthotopique TRP, l’histopathologie a confirmé la présence d’astrocytome/GBM de grade IV, y compris la récapitulation des caractéristiques distinctives observées dans les tumeurs TRP GEM telles que la pseudopalissade et la nécrose (Figure 4). Les marqueurs des cellules souches neurales et des progéniteurs du GBM décrits pour la sous-classification du GBM humain ont été évalués par immunohistochimie (Figure 5). L’expression généralisée de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) indique une tumeur proliférative d’origine progénitrice astrocytaire, tandis que la Nestine et Sox-2 sont des marqueurs progéniteurs neuronaux établis, et l’expression d’Olig-2 confirme la présence de cellules d’origine oligodendrocytaire ^5,7. Les quatre marqueurs sont fortement exprimés dans les sous-types de GBM⁸ humain.

Figure 1 : Configuration de l’appareil d’implant intracrânien et croissance des tumeurs GBM TRP visualisées par IRM en série. (A) Configuration de l’appareil avec différents éléments nécessaires pour l’implant intracrânien (1 à 11 décrits); l’unité spécifique de placement de la tête de souris et d’anesthésie par inhalation est agrandie en (B). L’imagerie hebdomadaire a été réalisée sur un scanner clinique IRM 3.0T avec une bobine de surface SENSE ^5,9 à quatre souris construite sur mesure. Séquence d’écho de spin turbo pondéré en T2 multi-coupes (T2w-TSE): (TR / TE (4437/100 ms), en résolution plane (0,12 x 0,15 mm), épaisseur de tranche (0,5 mm), facteur d’accélération SENSE (4) Des images ont été acquises dans le plan axial pour couvrir tout le cerveau de la souris. Les sections coronales des tumeurs sont montrées 3, 4 et 5 semaines après l’implant. Une barre d’échelle représentative pour les images IRM est indiquée en bas à droite (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Etude d’efficacité représentative d’un modèle orthotopique de GBM avec radiothérapie. (A) Volumes tumoraux tridimensionnels calculés à partir d’IRM, correspondant aux implants post-tumoraux des semaines 2, 3 et 4. Les volumes des tumeurs cérébrales ont été mesurés par l’analyse des images IRM. Après avoir téléchargé une image IRM dans le programme ITK_SNAP, le contraste de l’image et le filtre de région d’intensité de l’image ont été ajustés. Après l’initialisation active du contour et la segmentation de l’image, le volume tumoral a été mesuré en milimimètres cubiques. Les souris témoins individuelles (non traitées) et les souris traitées par irradiation (3 Gy par jour pendant 5 jours pour un total de 15 Gy) sont tracées. (B) Survie des souris radiotraitées par rapport au témoin. Le pourcentage de survie a été calculé à l’aide d’un logiciel graphique (voir le tableau des matériaux) à partir d’un total de n = 11 souris non traitées et n = 12 souris radiotraitées. Les souris de l’étude ont été euthanasiées au fur et à mesure que les critères d’évaluation sans cruauté ont été atteints, conformément à nos lignes directrices institutionnelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Localisation de la tumeur dans le cerveau à l’autopsie. (A) Localisation correcte de la croissance tumorale dans l’hémisphère droit de la souris. Le panneau de gauche montre un exemple de tumeur dans le cerveau à partir d’une IRM à la fin de l’étude; La flèche rouge indique l’emplacement de la tumeur. Le cerveau de souris disséqué est montré dans le crâne (panneau du milieu) et retiré de la cavité crânienne (panneau droit). Dans le panneau du milieu, les flèches bleues indiquent l’impact de l’aiguille du site d’injection et les flèches à deux têtes indiquent l’emplacement recommandé de la coupe sagittale cérébrale pour l’histologie, divisant l’hémisphère droit en deux parties. Les deux parties du cerveau sont intégrées dans la paraffine à la manière d’un « livre ouvert ». La ligne pointillée indique la fissure longitudinale médiane séparant les deux hémisphères cérébraux comme référence. Dans le panneau de droite, la zone délimitée par la ligne pointillée représente la région tumorale visible à l’autopsie. (B) Un exemple de tumeur cérébrale se développant à l’extérieur du crâne de souris est montré dans l’IRM. Une barre d’échelle représentative pour les deux images IRM est illustrée à la figure 3A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: L’histopathologie des tumeurs orthotopiques TRP GBM récapitule les caractéristiques du GBM humain. Les sections sagittales colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) de tout le cerveau ont été évaluées par un pathologiste vétérinaire certifié par l’ACVP, et les tumeurs ont été classées en fonction de la classification actuelle de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) pour les astrocytomes humains^10,11. Les tumeurs orthotopiques du GBM sont très prolifératives, invasives (I) et vascularisées (V), et présentent des caractéristiques de l’histopathologie du GBM humain, notamment une nécrose (N) et une pseudopalissade (P) par les cellules néoplasiques¹². Les lignes pointillées montrent un grossissement des zones dans la tumeur cérébrale et à la périphérie, adjacentes au tissu cérébral normal (en haut et en bas à droite, respectivement). Les anticorps et les méthodes d’immunohistochimie sont décrits dans El Meskini et ^coll.5. Une barre d’échelle pour les images H & E est affichée pour les grossissements faibles et élevés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Biomarqueurs du GBM exprimés dans le modèle orthotopique. L’expression du marqueur progéniteur multipotent SOX-2 (facteur de transcription 2 de SRY-Box), des progéniteurs neuronaux Nestin et Olig-2 et du marqueur astrocytaire de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) indique une hétérogénéité cellulaire, une caractéristique commune du GBM ^7,8 humain. Une barre d’échelle représentative pour toutes les images IHC est indiquée dans Olig2 (facteur de transcription des oligodendrocytes 2; en bas à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les modèles précliniques sont essentiels pour l’évaluation de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles stratégies de traitement du GBM. Les modèles murins génétiquement modifiés pour le GBM ont l’avantage de l’apparition de tumeurs dans le site autochtone, mais souvent avec une longue latence et une croissance tumorale imprévisible¹³. Les tumeurs du modèle GEM présentent une latence de 4 à 5 mois, et la fenêtre de temps idéale pour l’imagerie, le recrutement et le traitement est variable chez les souris individuelles. Le modèle orthotopique a un délai de croissance et de traitement bien établi et traitable de 4 à 5 semaines, et les tumeurs sont détectées de manière fiable par IRM après implant. L’utilisation de modèles orthotopiques dérivés de GEM permet de placer la tumeur à l’emplacement exact dans chaque souris, ainsi que de contrôler temporellement l’initiation de la croissance tumorale, tout en conservant l’avantage du microenvironnement cérébral environnant. Dans le modèle orthotopique TRP, les voies RTK, PTEN et RB activées produisent un modèle tumoral qui récapitule les caractéristiques histologiques du GBM humain. Analogues au GBM humain, les tumeurs orthotopiques TRP GBM présentent des caractéristiques de croissance agressive, telles que des foyers nécrotiques entourés de cellules néoplasiques pseudopalissadantes et une néovascularisation. Les tumeurs sont également invasives dans le parenchyme cérébral environnant. Par conséquent, les agents qui peuvent supprimer l’infiltration tumorale et la migration chez les patients peuvent être évalués précliniquement dans les tumeurs orthotopiques TRP. Le processus d’injection de cellules de tumeurs GEM invasives à des souris syngéniques nécessite une prudence particulière, afin d’éviter la fuite et la croissance involontaires de cellules en dehors de la région ciblée. La méthode décrite ici, lorsqu’elle est pratiquée de manière routinière, peut être utilisée pour générer de grandes cohortes de souris porteuses de tumeurs avec une croissance tumorale constante.

Les étapes critiques du protocole qui peuvent avoir un impact sur la réussite de l’injection tumorale comprennent le retrait de l’aiguille du cerveau post-injection cellulaire et l’utilisation de cire osseuse. L’aiguille doit être insérée et retirée 1 mm à la fois (comme décrit aux étapes 5 et 6), afin d’éviter des dommages supplémentaires au tissu cérébral environnant et la fuite de cellules résiduelles ou le reflux de la suspension injectée¹⁴. L’utilisation de cire d’os fondue pour boucher et sceller le trou de l’aiguille crée une barrière pour empêcher les fuites cellulaires, tout comme l’implantation de cellules dans une suspension de méthylcellulose. Il est important de noter que la méthylcellulose doit être mélangée dans une solution tamponnée telle que le PBS (ou un média sans sérum) avant de remettre en suspension les cellules du cerveau. De plus, l’utilisation de l’anesthésie par inhalation est préférée à l’anesthésie injectable, afin de raccourcir le temps de récupération.

Notez que la taille de la tête peut différer légèrement entre les souches de souris, ou selon l’âge et le sexe; Ainsi, il peut être nécessaire de recalibrer l’équipement stéréotaxique lors du passage d’un type de cohorte de souris à un autre. Nous recommandons également d’optimiser le nombre de cellules injectables pour chaque lignée cellulaire d’intérêt chez un petit nombre de souris avant de procéder à une grande cohorte. Par rapport aux xénogreffes humaines, les tumeurs murines peuvent se développer agressivement lorsqu’elles sont réimplantées chez des souris appariées et nécessitent moins de cellules pour l’injection, comme nous l’avons observé avec les lignées TRP.

Un avantage clé de l’injection cérébrale orthotopique par rapport à l’initiation et à la croissance du glioblastome dans un modèle GEM est que le tissu entourant la tumeur injectée est normal et que le caractère invasif local peut être évalué par histopathologie. Cependant, nous ne pouvons pas exclure des changements dans le microenvironnement dus à la plaie d’injection elle-même, qui peuvent entraîner une réponse inflammatoire locale ou une perturbation de la barrière hémato-encéphalique.

En conclusion, les modèles orthotopiques permettent l’étude du GBM, avec un délai raisonnable pour le traitement et dans le contexte de la localisation de la tumeur native. Notre modèle récapitule les caractéristiques du GBM humain mais chez une souris immunocompétente; Par conséquent, le microenvironnement immunitaire peut être analysé par rapport à la croissance tumorale ou en réponse à l’immunothérapie. La croissance tumorale est agressive et invasive, contrairement à de nombreux modèles de GBM de xénogreffe de lignée cellulaire dans lesquels la tumeur reste encapsulée et ne présente pas les caractéristiques histologiques du GBM^{humain 13,15,16}. Lorsqu’elle est effectuée correctement, la procédure décrite ici entraîne une croissance tumorale fiable sans fuite cellulaire ni propagation extracrânienne.

Enfin, bien que ce protocole ait été optimisé dans le contexte du GBM en tant que modèle murin orthotopique, sa précision et son application fiable en traduction préclinique peuvent être adaptées aux modèles d’autres sous-classes de tumeurs cérébrales. Les méthodes et les réactifs de ce protocole peuvent être utilisés pour différents types d’implants cellulaires porteurs de mutations pour le modèle de tumeur cérébrale d’intérêt (par exemple, gliome médian^{diffus 17}), avec ajustement des coordonnées stéréotaxiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T