Summary
Her beskriver vi en preklinisk ortotopisk musemodell for GBM, etablert ved intrakraniell injeksjon av celler avledet fra genetisk konstruerte musemodelltumorer. Denne modellen viser sykdomskjennetegnene til human GBM. For translasjonsstudier spores musens hjernesvulst av in vivo MR og histopatologi.
Abstract
Genetisk utviklede mus (GEM) modeller for human glioblastoma multiforme (GBM) er avgjørende for å forstå utviklingen og utviklingen av hjernesvulster. I motsetning til xenografttumorer, i GEM, oppstår svulster i det opprinnelige mikromiljøet i en immunkompetent mus. Imidlertid er bruken av GBM GEM i prekliniske behandlingsstudier utfordrende på grunn av lange tumorlatenser, heterogenitet i neoplasmafrekvens og tidspunktet for avansert tumorutvikling. Mus indusert via intrakraniell ortotopisk injeksjon er mer håndterbare for prekliniske studier, og beholder funksjoner i GEM-svulstene. Vi genererte en ortotopisk hjernesvulstmodell avledet fra en GEM-modell med Rb, Kras og p53-avvik (TRP), som utvikler GBM-svulster som viser lineære foci av nekrose av neoplastiske celler, og tett vaskularisering analogt med human GBM. Celler avledet fra GEM GBM-svulster injiseres intrakranielt i villtype, stammematchede mottakermus og reproduserer klasse IV-svulster, og omgår derfor den lange tumorlatensperioden i GEM-mus og muliggjør opprettelse av store og reproduserbare kohorter for prekliniske studier. De svært proliferative, invasive og vaskulære egenskapene til TRP GEM-modellen for GBM rekapituleres i ortotopiske svulster, og histopatologimarkører gjenspeiler menneskelige GBM-undergrupper. Tumorvekst overvåkes ved serielle MR-skanninger. På grunn av den invasive naturen til de intrakraniale svulstene i immunkompetente modeller, er det viktig å følge injeksjonsprosedyren som er skissert her nøye for å forhindre ekstrakranial tumorvekst.
Introduction
Glioblastom (GBM; grad IV gliom) er den vanligste og mest ondartede hjernesvulsten, og dagens behandlinger er ineffektive, noe som resulterer i en median overlevelse på 15 måneder1. Pålitelige og nøyaktige prekliniske modeller som representerer de komplekse signalveiene som er involvert i hjernesvulstvekst og patogenese, er avgjørende for å fremskynde fremdriften i evalueringen av nye terapeutiske regimer for GBM. Musemodeller der humane hjernesvulstcellelinjer implanteres subkutant i immunkompromitterte mus, gjenspeiler ikke det opprinnelige immunmiljøet til hjernesvulster, og de kan heller ikke brukes til å evaluere terapiens evne til å krysse blod-hjernebarrieren2. Ideelt sett bør prekliniske musemodeller også gjengi nøye den humane GBM-histopatologien, inkludert det høye invasivitetsnivået i det omkringliggende parenkymet3. Selv om genetisk utviklede musmodeller (GEM) utvikler svulster i sammenheng med et intakt immunsystem, er det ofte nødvendig med kompliserte avlsordninger, og svulster kan utvikle seg sakte og inkonsekvent4. GEM-avledede allograftmodeller er bedre egnet for prekliniske terapeutiske studier, hvor store kohorter av tumorbærende mus er nødvendig i en kortere tidsramme.
I en tidligere rapport beskrev vi en ortotopisk GBM-musemodell avledet direkte fra GEM-svulster. Tumorigenese i GEM initieres av genetiske hendelser i cellepopulasjoner (primært astrocytter) som uttrykker glialfibrillært surt protein (GFAP), som resulterer i progresjon til GBM. Disse TRP-GEMene har et TgGZT121-transgen (T), som uttrykker T121 etter eksponering for den GFAP-drevne Cre-rekombinasen. T121 proteinuttrykk resulterer i undertrykkelse av Rb (Rb1, p107 og p103) proteinaktivitet. Samtidig ekspresjon av et GFAP-drevet Cre-transgen (GFAP-CreERT2) retter seg mot ekspresjon til voksne astrocytter etter induksjon med tamoksifen. TRP-mus har også en Cre-avhengig mutant Kras (KrasG12D; R) allel, representerer aktivering av reseptortyrosinkinasebanen, og er heterozygot for tap av Pten (P)5,6. Samtidige genavvik i reseptortyrosinkinase (RTK), PI3K og RB-nettverk er involvert i 74% av GBM-patogenesen7. Derfor er de primære signalveiene endret i human GBM representert av de konstruerte mutasjonene i TRP-mus, spesielt GBM-svulster, der delte nedstrømsmål for RTK aktiveres5.
Den GEM-avledede syngene ortotopiske modellen ble validert som en modell som rekapitulerer egenskaper av humane hjernesvulster, inkludert invasivitet og tilstedeværelse av subtype biomarkører, for bruk som en plattform for å evaluere kreftbehandling rettet mot avvikende veier i GBM. Celler ble dyrket fra svulster høstet fra TRP-hjerner og reimplantert i hjernen til stammematchede mus, ved hjelp av stereotaktisk utstyr for intrakraniell injeksjon i cortex. Denne prekliniske ortotopiske musemodellen utviklet GBM-svulster som var svært cellulære, invasive, pleomorfe med høy mitotisk hastighet, og viste lineære foci av nekrose av neoplastiske celler og tett vaskularisering, som observert for human GBM. Tumorvolum og vekst ble målt ved in vivo magnetisk resonanstomografi (MR).
I denne rapporten beskriver vi den optimale teknikken for intrakraniell injeksjon av primære GBM-celler eller cellelinjer i villtype musehjerne, ved hjelp av TRP-svulster som et eksempel. Den samme protokollen kan tilpasses for immunkompromitterte mus og andre GBM-cellelinjer. Viktige tips gis for å unngå vanlige fallgruver, for eksempel suboptimal cellepreparasjon eller cellelekkasje på injeksjonsstedet, og for å bruke det stereotaktiske utstyret riktig for å sikre modellreproduserbarhet og pålitelighet. For translasjonsformål validerer vi modellen ved MR-påvisning av hjernesvulstvekst hos levende dyr, histologisk karakterisering og presenterer et eksempel på behandling hos tumorbærende mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieprotokollen beskrevet her ble godkjent av NCI ved Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick er akkreditert av AAALAC International og følger Public Health Service Policy for Care and Use of Laboratory Animals. Dyrepleie ble gitt i samsvar med prosedyrene som er beskrevet i "Veiledning for stell og bruk av forsøksdyr (National Research Council, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).
1. Klargjøring av celler til injeksjon
MERK: Primærceller for hjernesvulst (MBR) brukt til denne modellen ble opprinnelig isolert fra tamoxifen-induserte TRP GEM-mus, som beskrevet i El Meskini et al.5. Detaljer om cellepreparasjonen finner du i denne referansen.
- Utfør følgende trinn ved hjelp av steril teknikk i et biosikkerhetsskap.
- Kultur primære hjernesvulstceller in vitro til de når den eksponentielle vekstfasen.
- Høst cellene i 0,25% trypsin, og når de har løsnet, fortynn dem med vekstmedium for å inaktivere trypsinet.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 400 x g og vask med serumfrie medier. Gjenta én gang før du teller.
- Telle cellene manuelt eller med en automatisert celleteller. Resuspender cellene i 5 % steril metylcellulose i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) ved ønsket konsentrasjon, basert på et endelig injeksjonsvolum på 2 μL. Den ønskede cellekonsentrasjonen kan variere basert på cellelinjen og hjernesvulstmodellen. For GBM GEM TRP-celler injiserer vi 2 μL av en 25 x 106 celler/ml-løsning, eller 50 000 celler.
2. Muse belastning
- Breed eller kjøpe en passende mus stamme som samsvarer med belastningen bakgrunnen av hjernesvulstceller. For TRP-celler, bruk 9 uker gamle B6D2F1 / J-mus (fra et kryss mellom C57BL / 6J [B6] kvinner og DBA / 2J [D2] hanner) som tumorcellemottakere.
3. Sette opp operasjonsområdet
MERK: Alle kirurgiske trinn utføres ved hjelp av aseptisk teknikk i et rent, desinfisert miljø. Skrubber og personlig verneutstyr, inkludert maske, skal brukes av kirurgen. Kirurgiske verktøy må varmesteriliseres før bruk.
- Plasser overflatebeskyttere under det stereotaktiske apparatet og på arbeidsflaten.
- Fest vinylslangen fra anestesimaskinen til IN-porten på gassanestesiplattformen til det stereotaksiske apparatet, og et annet rør til OUT-porten.
- Koble det digitale displayet til en strømkilde og til apparatet.
- Koble mikropumpekontrolleren (figur 1A) til en strømkilde og fest mikropumpen (figur 1A) til manipulatorarmen til apparatet (se også produsentens instruksjoner).
- Sett mikropumpen på 5,6 nL/s for voluminjeksjonen på 2 000 nL.
- Slå på den varme perlesterilisatoren.
- Koble musevarmeputen til temperaturkontrolleren og koble til en strømkilde. Plasser platen på sceneplattformen. Sett platetemperaturen til 37 °C.
- Tilbakelast en 30 G presisjonssprøyte, vær forsiktig så du ikke introduserer bobler. Stikk inn stempelet og fest kanylen. Pass på at du bare griper nålen ved navet. Press stempelet inn til en dråpe av metylcellulosecelleblandingen slipper gjennom nålen. Rengjør nålen med en 70 % kompress for tilberedning av alkohol ved å tørke forsiktig av sidene av nålen, eller ved å plassere en steril gasbind på arbeidsflaten og blotte den. Pass på at kanylen ikke bøyes eller knekkes.
- Fest presisjonssprøyten til mikropumpen og roter manipulatorarmen bort fra scenen for å forhindre forskyvning av sprøytenålen før musen plasseres på scenen.
4. Klargjøre musen for kirurgi
- Bedøv musen ved å plassere den i induksjonskammeret med isofluran fordamper satt til 2,5%, eller i henhold til institusjonelle retningslinjer. Slå på isofluran strømmen til nesekeglen.
- Overfør musen til det stereotaktiske apparatet og fest den til nesekjeglen, med de øverste tennene plassert på nesekjeglestøtten (figur 1B, 9). Stram knotten på nesekjeglen for å feste den (figur 1B). Sørg for et passende nivå av anestesi ved å utføre en tåklemme for å sjekke for refleks.
- Overvåk ørene, føttene og slimhinnene for farge (rosa) for å sikre tilstrekkelig oksygenering. Overvåk også respirasjonsfrekvensen (en økning eller reduksjon kan indikere behov for å justere isoflurannivåene).
- Sett ørestengene (figur 1B) inn i begge ørene og stram knotten for å feste hodet.
- Påfør øyesalve for å smøre øynene mens musen er under anestesi.
- Bruk buet tang til å plukke håret på musens hode til et område som er ca. 150 % større enn det planlagte snittet, for å sikre tilstrekkelige aseptiske forhold.
- Injiser 0,5-1 mg/kg buprenorfin SR analgesi subkutant, eller bruk et annet protokollgodkjent smertestillende middel.
- Plasser musens rektalsonde for å overvåke indre temperatur og forhindre hypotermi på grunn av anestesi. Hold musens kroppstemperatur mellom 36,5 og 38,5 °C.
- Desinfiser det kirurgiske feltet ved hjelp av ytre sirkler, vekslende mellom en kirurgisk skrubbe og etanol tre ganger.
- Bruk tang for å trekke huden stramt, gjør et snitt på ca 1 cm med skalpellbladet, starter mellom øynene. Bregma skal være synlig gjennom snittet.
MERK: For riktig steril teknikk, berør operasjonsstedet bare med tuppen av steriliserte verktøy, og plasser verktøyspissene bare på en steril overflate (for eksempel innsiden av en autoklavert verktøypakke). - Bruk treenden av bomullstippet applikator for å skrape bort overflødig bindevev, og deretter bomullsenden av en annen applikator for å tørke.
5. Celle injeksjon
- Sett manipulatorarmen tilbake med sprøytefestet over musen, og stram knotten for å feste. Bruk X- og Y-knappene i horisontalplanet for å bevege sprøytefestet over bregma. Senk nålen med Z-knappen for å bekrefte bregma-posisjonen. Sett den digitale avlesningskonsollen til null.
- Bruk X- og Y-knappene og den tilhørende digitale avlesningen for å flytte nålen til ønsket posisjon. For kortikal cortex-plassering er passende koordinater 3 mm bakre, 2 mm lateralt rett til bregma og 2 mm dypt fra dura mater. Bruk Z-knappen til å flytte nålen til overflaten av skallen.
- Stikk hullet i hodeskallen ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en påsatt 25 G kanyle. Plasser skråningen av nålen mot 30 G presisjonssprøyten og kanylen, og roter manipulatorarmen forsiktig til siden. Bruk tommel og finger til å rulle nålen sakte frem og tilbake med forsiktig trykk til nålespissen akkurat stikker hull på hodeskallehetten.
- Bruk en bomullstippet applikator for å tørke blod bort fra nålehullet. Sett manipulatorarmen tilbake i riktig posisjon med den lastede presisjonssprøytenålen over hullet. Juster spissen av nålen med hullet, bruk Z-knappen til å senke nålen ned til hjernens dura, og sett den digitale avlesningskonsollen til null.
- Bruk Z-knappen, senk nålen 1 mm og vent deretter 1 min. Gjenta til ønsket dybde er nådd (2 mm som angitt).
MERK: Nålen senkes sakte for å forhindre ytterligere skade på det omkringliggende hjernevevet og tilbakestrømningen av celleløsningen. - Start mikropumpen, og overvåk deretter at pumpen stopper når 2 μL er injisert. Denne prosessen bør ta ca 6 min med den angitte hastigheten. Vent deretter 1 min før kanylen flyttes.
6. Fjerning av kanylen og sårlukking
- Løft nålen 1 mm og vent deretter 1 min. Gjenta til nålen er helt fri fra skallen.
- Hvis nødvendig, bruk en bomull-tipped applikator for å tørke blod bort fra injeksjonsstedet.
- Bruk treenden av en bomullstippet applikator, ta et lite stykke beinvoks (~ 1 mm) og form det til en kjegle. Plasser den i åpningen i skallen, skyv voksen inn i hullet.
- Varm tang ved hjelp av en perlesterilisator og bruk dem til å smelte gjenværende voks på skallen og glatte den.
- Plasser omtrent to dråper bupivakain (bedøvelse) løsning i snittet og bruk tang for å trekke kantene av huden sammen.
- Trekk huden stram og legg en eller to sårklemmer for å lukke huden.
- Plasser musen i et rent gjenopprettingsbur på en varmepute i et trekkfritt område, og følg musen nøye. La musen våkne helt opp fra anestesien, gjenoppta normal aktivitet, før du returnerer den til vanlig bolig.
- Sjekk musen daglig etter den kirurgiske prosedyren og administrer smertebehandling, i henhold til institusjonelle retningslinjer.
- Hvis buprenorfin SR (trinn 4.6) brukes mot analgesi, varer formelen for forsinket frisetting i 72 timer. Gjenta injeksjonen bare hvis synlig smerte eller ubehag er tilstede etter 72 timer. Når det utføres riktig, gjenoppretter musene godt fra de intrakranielle injeksjonene, og ytterligere analgesi er ikke nødvendig.
- Fjern stiftene 7-10 dager etter operasjonen.
- Overvåk tumorvekst ved levende dyreavbildning (MR).
- Avlive musene når humane endepunkter er nådd (dvs. hvis dyret mister 20% kroppsvekt eller blir hypoterm).
- På grunn av den invasive naturen til disse hjernesvulstene, observer musene for nevrologiske symptomer, som ujevn gang, delvis lammelse, spinning eller hodevipping. Avlive en mus hvis noen av disse kliniske tegnene på avansert tumorvekst observeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus injisert med hjernesvulstceller bør overvåkes daglig for tegn på tumorvekst som anfall, ataksi eller vekttap. Hjernesvulst vekst kan også overvåkes ved MR-skanning med jevne mellomrom. Ukentlige MR-skanninger tillater visualisering av økende tumorbelastning i hjernen og tumorvolummålinger (figur 1C). Spesielt utviser TRP-svulster aggressiv vekst, og 3D-tumorvolumer kan måles ved MR innen 2 til 3 uker etter intrakraniell injeksjon (med et gjennomsnittlig volum på 30 til 40 mm3). I en representativ studie ble en kohort av hjernesvulstbærende mus delt inn i to grupper for kontroll versus strålebehandling; MR-tumorvolummåling viste manglende tumorvekstsuppresjon etter strålebehandling (figur 2A), noe som ikke medførte økt overlevelse for de behandlede musene (figur 2B).
Ved nekropsi kan svulster vises som en mørk flekk på hjernen i en hovent høyre hjernehalvdel (figur 3A, midtpanel), eller i tilfelle av større svulster, som en hevet, mørklagt region. For histopatologianalyse gir sagittal snitting gjennom injeksjonsstedsregionen (figur 3A) optimal vurdering av tumorvekst og omfanget av innvekst i ikke-malignt hjernevev. GBM-svulster i syngene modeller kan vokse aggressivt og bryte skallen ved det terminale endepunktet, som kan observeres ved nekropsi. I motsetning til dette indikerer ekstrakraniell vekst kort tid etter celleimplantasjon sannsynligvis en lekkasje av celler under injeksjonen, som kan observeres på MR-skanninger (figur 3B), eller i en levende mus ved et kuppelområde på hodet. Nålen kan ha blitt fjernet fra injeksjonsstedet for raskt (se avsnitt 6). Ekstrakraniell vekst bekreftes som lekkasje på injeksjonsstedet ved histologisk vurdering.
I TRP-ortotopisk modell bekreftet histopatologi tilstedeværelse av astrocytom grad IV/GBM, inkludert rekapitulering av særtrekk observert i TRP GEM-svulster som pseudopalisading og nekrose (figur 4). GBM nevrale stamcelle- og stamcellemarkører beskrevet for human GBM-subklassifisering ble evaluert ved immunhistokjemi (figur 5). Utbredt ekspresjon av glialfibrillært surt protein (GFAP) indikerer en proliferativ tumor av astrocytisk stamopprinnelse, mens Nestin og Sox-2 er etablerte neuronale stammarkører, og Olig-2-uttrykk bekrefter tilstedeværelsen av celler av oligodendrocytisk opprinnelse 5,7. Alle fire markørene er sterkt uttrykt i undertyper av menneskelig GBM8.
Figur 1: Oppsett av intrakranielt implantatapparat og vekst av TRP GBM-svulster visualisert ved seriell MR. (A) Apparatoppsett med forskjellige elementer som er nødvendige for intrakranielt implantat (1 til 11 beskrevet); spesifikk musehodeplassering og inhalasjonsanestesienhet er forstørret i (B). Ukentlig avbildning ble utført på en MR 3.0T klinisk skanner med en spesialbygd fire mus SENSE array overflatespole 5,9. Flerskive T2-vektet turbospinnekko (T2w-TSE)-sekvens: (TR/TE (4437/100 ms), i planoppløsning (0,12 x 0,15 mm), skivetykkelse (0,5 mm), SENSE-akselerasjonsfaktor (4) ble det tatt bilder i aksialplanet for å dekke hele musehjernen. Vist er koronale snitt fra svulster ved 3, 4 og 5 uker etter implantatet. En representativ skalalinje for MR-bilder er angitt nederst til høyre (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ effektstudie av en ortotopisk GBM-modell med strålebehandling. (A) Tredimensjonale tumorvolumer beregnet ut fra MR-undersøkelser, tilsvarende posttumorimplantater uke 2, 3 og 4. Volumene av hjernesvulstene ble målt gjennom analyse av MR-bildene. Etter å ha lastet opp et MR-bilde til ITK_SNAP programmet, ble bildekontrasten og bildeintensitetsområdefilteret justert. Etter initialisering av aktiv kontur og bildesegmentering ble tumorvolumet målt i kubiske milimietere. Individuelle kontrollmus (ubehandlede) og mus behandlet med bestråling (3 Gy per døgn i 5 dager for totalt 15 Gy) er plottet. (B) Overlevelse av strålebehandlede mus sammenlignet med kontroll. Overlevelsesprosenten ble beregnet med grafisk programvare (se materialtabell) fra totalt n = 11 ubehandlede mus og n = 12 strålebehandlede mus. Studiemus ble avlivet da humane endepunkter ble nådd, basert på våre institusjonelle retningslinjer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Tumorplassering i hjernen ved nekropsi. (A) Korrekt plassering av tumorvekst i høyre musehalvkule. Det venstre panelet viser et eksempel på en svulst i hjernen fra en MR-skanning ved avslutning av studien; Den røde pilen indikerer svulstplasseringen. Den dissekerte musehjernen vises i skallen (midtpanelet) og fjernes fra kranialhulen (høyre panel). I midtpanelet indikerer blå piler nålvirkningen av injeksjonsstedet, og dobbelthodede piler indikerer den anbefalte plasseringen av hjernens sagittalsnitt for histologi, og splitter høyre halvkule i to deler. Begge hjernedelene er innebygd i parafin på en "åpen bok" -måte. Den stiplede linjen indikerer median langsgående sprekk som skiller de to hjernehalvdelene som referanse. I høyre panel representerer området omsluttet av den stiplede linjen det synlige tumorområdet ved nekropsi. (B) Et eksempel på en hjernesvulst som vokser utenfor museskallen er vist i MR-skanningen. En representativ skalalinje for begge MR-bildene er vist i figur 3A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Histopatologi av ortotopiske TRP GBM-svulster rekapitulerer kjennetegnene til human GBM. Hematoksylin og eosin (H &E) farget, sagittale seksjoner av hele hjernen ble evaluert av en ACVP-bord-sertifisert veterinærpatolog, og svulstene ble gradert basert på gjeldende Verdens helseorganisasjon (WHO) klassifisering for humane astrocytomer10,11. Ortotopiske GBM-svulster er svært proliferative, invasive (I) og vaskulariserte (V), og viser kjennetegn ved human GBM-histopatologi inkludert nekrose (N) og pseudopalisading (P) av neoplastiske celler12. Stiplede linjer viser forstørrelse av områdene i hjernesvulsten og i periferien, ved siden av normalt hjernevev (henholdsvis øverst og nederst til høyre). Antistoffer og metoder for immunhistokjemi er beskrevet i El Meskini et al.5. En skalalinje for H&E-bilder vises for både lave og høye forstørrelser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Biomarkører for GBM uttrykt i den ortotopiske modellen. Ekspresjon av den multipotente stammarkøren SOX-2 (SRY-Box transkripsjonsfaktor 2), nevrale forfedre Nestin og Olig-2, og glial fibrillary acidic protein (GFAP) astrocytic markør indikerer cellulær heterogenitet, et vanlig trekk ved human GBM 7,8. En representativ skalalinje for alle IHC-bilder er vist i Olig2 (Oligodendrocyte transkripsjonsfaktor 2; nederst til høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prekliniske modeller er avgjørende for evaluering av nye terapeutiske mål og nye behandlingsstrategier i GBM. Genetisk konstruerte musemodeller for GBM har fordelen av tumorforekomst i det autochthonøse stedet, men ofte med lang latens og uforutsigbar tumorvekst13. GEM-modelltumorene viser en latens på 4-5 måneder, og det ideelle tidsvinduet for avbildning, rekruttering og behandling er variabelt blant individuelle mus. Den ortotopiske modellen har en veletablert og håndterbar vekst- og behandlingstidslinje på 4-5 uker, og svulster påvises pålitelig ved MR etter implantat. Bruken av GEM-avledede ortotopiske modeller muliggjør plassering av svulsten på den nøyaktige plasseringen i hver mus, samt tidsmessig kontroll av tumorvekstinitiering, samtidig som fordelen med det omkringliggende hjernemikromiljøet opprettholdes. I TRP-ortotopisk modell produserer aktiverte RTK-, PTEN- og RB-veier en tumormodell som rekapitulerer de histologiske egenskapene til human GBM. Analogt med human GBM viser ortotopiske TRP GBM-svulster funksjoner av aggressiv vekst, for eksempel nekrotiske foci omgitt av pseudopalisading neoplastiske celler og neovaskularisering. Tumorer er også invasive i den omkringliggende hjernen parenchyma. Derfor kan midler som kan undertrykke tumorinfiltrasjon og migrasjon hos pasienter evalueres preklinisk i TRP ortotopiske svulster. Prosessen med å injisere celler fra invasive GEM-svulster i syngene mus krever spesiell forsiktighet for å unngå utilsiktet lekkasje og vekst av celler utenfor det målrettede området. Metoden beskrevet her, når den rutinemessig praktiseres, kan brukes til å generere store kohorter av tumorbærende mus med konsistent tumorvekst.
Kritiske trinn i protokollen som kan påvirke vellykket tumorinjeksjon inkluderer fjerning av nålen fra hjernen etter celleinjeksjon og bruk av benvoks. Nålen må settes inn og fjernes 1 mm om gangen (som beskrevet i trinn 5 og 6), for å forhindre ytterligere skade på det omkringliggende hjernevevet og lekkasje av gjenværende celler eller tilbakestrømning av den injiserte suspensjonen14. Bruken av smeltet benvoks for å plugge og forsegle nålehullet skaper en barriere for å forhindre cellelekkasje, og det samme gjør implantering av celler i en metylcellulosesuspensjon. Det er viktig at metylcellulose må blandes i en bufret løsning som PBS (eller alternativt serumfrie medier) før resuspendering av hjernecellene. I tillegg er bruk av inhalasjonsbedøvelse foretrukket fremfor injiserbar anestesi, for å forkorte gjenopprettingstiden.
Merk at hodestørrelsen kan variere noe mellom musestammer, eller etter alder og kjønn; Dermed kan det stereotaktiske utstyret måtte kalibreres på nytt når du bytter fra en musekohorttype til en annen. Vi anbefaler også optimalisering av cellenummeret for injeksjon for hver cellelinje av interesse hos et lite antall mus før du fortsetter med en stor kohort. Sammenlignet med humane xenotransplantater, kan murintumorer vokse aggressivt når de reimplanteres i stammematchede mus og krever færre celler til injeksjon, som vi observerte med TRP-linjer.
En viktig fordel ved ortotopisk hjerneinjeksjon sammenlignet med initiering og vekst av glioblastom i en GEM-modell er at vevet rundt den injiserte svulsten er normalt, og lokal invasivitet kan vurderes ved histopatologi. Vi kan imidlertid ikke utelukke endringer i mikromiljøet på grunn av selve injeksjonssåret, som muligens resulterer i en lokal inflammatorisk respons eller forstyrrelse av blod-hjernebarrieren.
Avslutningsvis tillater ortotopiske modeller studier av GBM, med en rimelig tidslinje for behandling og innenfor rammen av den opprinnelige tumorplasseringen. Vår modell rekapitulerer menneskelige GBM-funksjoner, men i en immunkompetent mus; Derfor kan immunmikromiljøet analyseres i forhold til tumorvekst, eller som respons på immunterapi. Tumorvekst er aggressiv og invasiv, i motsetning til mange cell-line xenograft GBM-modeller der svulsten forblir innkapslet og ikke viser de histologiske egenskapene til human GBM13,15,16. Når det utføres riktig, resulterer prosedyren beskrevet her i pålitelig tumorvekst uten cellelekkasje eller ekstrakraniell spredning.
Til slutt, selv om denne protokollen er optimalisert i sammenheng med GBM som en ortotopisk musemodell, kan dens nøyaktighet og pålitelige anvendelse i preklinisk oversettelse tilpasses modeller av andre hjernesvulstunderklasser. Metoder og reagenser i denne protokollen kan benyttes for forskjellige celletypeimplantater som bærer mutasjoner for hjernesvulstmodellen av interesse (f.eks. Diffus midtlinjegliom17), med justering av stereotaksiske koordinater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Mr. Alan E. Kulaga for utmerket teknisk assistanse og til Ms Michelle L. Gumprecht for raffinering av kirurgiske teknikker. Vi takker Dr. Philip L. Martin for patologianalyse og Lilia Ileva og Dr. Joseph Kalen fra Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program for MR-skanninger.
Dette prosjektet har blitt finansiert helt eller delvis med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr. HHSN261201500003I. Innholdet i denne publikasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjene til Department of Health and Human Services, og heller ikke innebærer omtale av handelsnavn, kommersielle produkter eller organisasjoner godkjenning av den amerikanske regjeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al.
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G.
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , Exon Publications. (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J.
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
