Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir ein präklinisches orthotopes Mausmodell für GBM, das durch intrakranielle Injektion von Zellen aus gentechnisch veränderten Mausmodelltumoren etabliert wurde. Dieses Modell zeigt die Krankheitsmerkmale des humanen GBM. Für translationale Studien wird der Hirntumor der Maus mittels In-vivo-MRT und Histopathologie verfolgt.
Abstract
Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEM) für humanes Glioblastoma multiforme (GBM) sind entscheidend für das Verständnis der Entstehung und des Fortschreitens von Hirntumoren. Im Gegensatz zu Xenograft-Tumoren entstehen Tumore bei GEMs in der nativen Mikroumgebung einer immunkompetenten Maus. Der Einsatz von GBM-GEMs in präklinischen Behandlungsstudien ist jedoch aufgrund der langen Tumorlatenzen, der Heterogenität der Neoplasienhäufigkeit und des Zeitpunkts der Tumorentwicklung im fortgeschrittenen Grad eine Herausforderung. Mäuse, die durch intrakranielle orthotope Injektion induziert wurden, sind für präklinische Studien besser handhabbar und behalten Merkmale der GEM-Tumore bei. Wir generierten ein orthotopes Hirntumormodell, das aus einem GEM-Modell mit Rb-, Kras- und p53-Aberrationen (TRP) abgeleitet wurde und GBM-Tumore entwickelt, die lineare Nekroseherde durch neoplastische Zellen und eine dichte Vaskularisation analog zu humanem GBM aufweisen. Zellen, die von GEM-GBM-Tumoren abgeleitet sind, werden intrakraniell in Wildtyp-Empfängermäuse injiziert und reproduzieren Tumore des Typs IV, wodurch die lange Tumorlatenzzeit in GEM-Mäusen umgangen wird und die Erstellung großer und reproduzierbarer Kohorten für präklinische Studien ermöglicht wird. Die hochproliferativen, invasiven und vaskulären Merkmale des TRP-GEM-Modells für GBM werden in den orthotopen Tumoren rekapituliert, und histopathologische Marker spiegeln humane GBM-Subgruppen wider. Das Tumorwachstum wird durch serielle MRT-Scans überwacht. Aufgrund des invasiven Charakters der intrakraniellen Tumoren in immunkompetenten Modellen ist eine sorgfältige Einhaltung des hier beschriebenen Injektionsverfahrens unerlässlich, um ein extrakranielles Tumorwachstum zu verhindern.
Introduction
Das Glioblastom (GBM; Gliom Grad IV) ist der häufigste und bösartigste Hirntumor, und die derzeitigen Therapien sind unwirksam, was zu einer medianen Überlebenszeit von 15 Monaten führt1. Zuverlässige und genaue präklinische Modelle, die die komplexen Signalwege darstellen, die am Wachstum und der Pathogenese von Hirntumoren beteiligt sind, sind unerlässlich, um den Fortschritt bei der Bewertung neuer Therapieschemata für GBM zu beschleunigen. Mausmodelle, in denen humane Hirntumorzelllinien subkutan in immungeschwächte Mäuse implantiert werden, spiegeln weder die native Immunumgebung von Hirntumoren wider, noch können sie verwendet werden, um die Fähigkeit von Therapeutika zu bewerten, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden2. Idealerweise sollten präklinische Mausmodelle auch die humane GBM-Histopathologie genau reproduzieren, einschließlich der hohen Invasivität in das umgebende Parenchym3. Obwohl gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEM) Tumore im Kontext eines intakten Immunsystems entwickeln, sind oft komplizierte Zuchtschemata erforderlich, und Tumore können sich langsam und uneinheitlich entwickeln4. GEM-abgeleitete Allotransplantatmodelle eignen sich besser für präklinische therapeutische Studien, bei denen große Kohorten von tumortragenden Mäusen in kürzerer Zeit benötigt werden.
In einem früheren Bericht haben wir ein orthotopes GBM-Mausmodell beschrieben, das direkt von GEM-Tumoren abgeleitet wurde. Die Tumorgenese im GEM wird durch genetische Ereignisse in Zellpopulationen (hauptsächlich Astrozyten) initiiert, die das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) exprimieren und zu einer Progression zu GBM führen. Diese TRP-GEMs beherbergen ein TgGZT121-Transgen (T), das T121 nach Exposition gegenüber der GFAP-getriebenen Cre-Rekombinase exprimiert. Die Expression des T121-Proteins führt zu einer Unterdrückung der Aktivität des Rb-Proteins (Rb1, p107 und p103). Die Co-Expression eines GFAP-getriebenen Cre-Transgens (GFAP-CreERT2) zielt auf die Expression adulter Astrozyten nach Induktion mit Tamoxifen ab. TRP-Mäuse beherbergen auch eine Cre-abhängige Mutante Kras (KrasG12D; R)-Allel, das die Aktivierung des Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwegs darstellt, und sind heterozygot für den Verlust von Pten(P)5,6. Gleichzeitige Genaberrationen in den Netzwerken Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), PI3K und RB sind an 74% der GBM-Pathogenese beteiligt7. Daher werden die primären Signalwege, die im humanen GBM verändert sind, durch die manipulierten Mutationen in TRP-Mäusen, insbesondere GBM-Tumoren, repräsentiert, in denen gemeinsame nachgeschaltete Ziele von RTKs aktiviert werden5.
Das von GEM abgeleitete syngene orthotope Modell wurde als ein Modell validiert, das Merkmale menschlicher Hirntumore, einschließlich der Invasivität und des Vorhandenseins von Subtyp-Biomarkern, rekapituliert, um als Plattform für die Evaluierung von Krebstherapeutika zu dienen, die auf abweichende Signalwege bei GBM abzielen. Die Zellen wurden aus Tumoren kultiviert, die aus TRP-Gehirnen entnommen und mit stereotaktischen Geräten zur intrakraniellen Injektion in den Kortex wieder in das Gehirn von Mäusen implantiert wurden, die mit dem Stamm verglichen wurden. Dieses präklinische orthotope Mausmodell entwickelte GBM-Tumoren, die hochzellig, invasiv, pleomorph mit einer hohen Mitoserate waren und lineare Nekroseherde durch neoplastische Zellen und eine dichte Vaskularisation aufwiesen, wie sie für humanes GBM beobachtet wurden. Das Tumorvolumen und -wachstum wurde mittels in vivo Magnetresonanztomographie (MRT) gemessen.
In diesem Bericht beschreiben wir am Beispiel von TRP-Tumoren die optimale Technik für die intrakranielle Injektion von primären GBM-Zellen oder Zelllinien in das Wildtyp-Mäusegehirn. Das gleiche Protokoll könnte für immungeschwächte Mäuse und andere GBM-Zelllinien angepasst werden. Es werden wichtige Tipps gegeben, um häufige Fallstricke wie suboptimale Zellpräparation oder Zellleckage an der Injektionsstelle zu vermeiden und die stereotaktische Ausrüstung richtig einzusetzen, um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit des Modells zu gewährleisten. Zu translationalen Zwecken validieren wir das Modell durch MRT-Detektion des Hirntumorwachstums bei lebenden Tieren, histologische Charakterisierung und präsentieren ein Beispiel für die Behandlung in tumortragenden Mäusen.
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Protocol
Das hier beschriebene Studienprotokoll wurde vom NCI des Frederick Animal Care and Use Committee genehmigt. NCI-Frederick ist von AAALAC International akkreditiert und befolgt die Richtlinien des öffentlichen Gesundheitsdienstes für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Tierpflege erfolgte in Übereinstimmung mit den Verfahren, die im "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (National Research Council, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).
1. Vorbereitung der Zellen für die Injektion
HINWEIS: Die für dieses Modell verwendeten Hirntumor-Primärzellen (MBRs) der Maus wurden ursprünglich aus Tamoxifen-induzierten TRP-GEM-Mäusen isoliert, wie in El Meskini et al.5 beschrieben. Details zur Zellpräparation finden Sie in dieser Referenz.
- Führen Sie die folgenden Schritte mit steriler Technik in einer Biosicherheitswerkbank durch.
- Kultur von primären Hirntumorzellen in vitro , bis sie die exponentielle Wachstumsphase erreichen.
- Ernten Sie die Zellen in 0,25% Trypsin, und sobald sie sich gelöst haben, verdünnen Sie sie mit Wachstumsmedium, um das Trypsin zu inaktivieren.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g und waschen Sie sie mit serumfreien Medien. Wiederholen Sie dies einmal, bevor Sie zählen.
- Zählen Sie die Zellen manuell oder mit einem automatischen Zellzähler. Resuspendieren Sie die Zellen in 5%iger steriler Methylcellulose in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in der gewünschten Konzentration, basierend auf einem endgültigen Injektionsvolumen von 2 μl. Die gewünschte Zellkonzentration kann je nach Zelllinie und Hirntumormodell variieren. Für GBM GEM TRP-Zellen injizieren wir 2 μl einer 25 x 106-Zellen /ml-Lösung oder 50.000 Zellen.
2. Mäusestamm
- Züchten oder kaufen Sie einen geeigneten Mausstamm, der dem Stammhintergrund der Hirntumorzellen entspricht. Verwenden Sie für TRP-Zellen 9 Wochen alte B6D2F1/J-Mäuse (aus einer Kreuzung zwischen C57BL/6J [B6]-Weibchen und DBA/2J [D2]-Männchen) als Tumorzellempfänger.
3. Einrichten des Operationsbereichs
HINWEIS: Alle chirurgischen Schritte werden mit aseptischer Technik in einer sauberen, desinfizierten Umgebung durchgeführt. Peelings und persönliche Schutzausrüstung, einschließlich einer Maske, sollten vom Chirurgen getragen werden. Chirurgische Instrumente müssen vor der Verwendung hitzesterilisiert werden.
- Platzieren Sie den Oberflächenschutz unter dem stereotaktischen Gerät und auf der Arbeitsfläche.
- Befestigen Sie den Vinylschlauch des Anästhesiegeräts am IN-Anschluss der Gasanästhesieplattform des stereotaktischen Geräts und einen weiteren Schlauch am OUT-Anschluss.
- Schließen Sie die Digitalanzeige an eine Stromquelle und an das Gerät an.
- Schließen Sie die Mikropumpensteuerung (Abbildung 1A) an eine Stromquelle an und schließen Sie die Mikropumpe (Abbildung 1A) an den Manipulatorarm des Geräts an (siehe auch Herstelleranweisungen).
- Stellen Sie die Mikropumpe für die Volumeninjektion von 2.000 nL auf 5,6 nL/s ein.
- Schalten Sie den Heißperlensterilisator ein.
- Schließen Sie das Mausheizkissen an den Temperaturregler an und schließen Sie es an eine Stromquelle an. Stellen Sie den Teller auf das Bühnenpodest. Stellen Sie die Plattentemperatur auf 37 °C ein.
- Legen Sie eine 30-g-Präzisionsspritze zurück und achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Setzen Sie den Kolben ein und befestigen Sie die Nadel. Achten Sie darauf, die Nadel nur an der Nabe zu fassen. Drücken Sie den Kolben, bis ein Tropfen der Methylcellulose-Zellmischung durch die Nadel abgegeben wird. Reinigen Sie die Nadel mit einem Vorbereitungspad mit 70 % Alkohol, indem Sie die Seiten der Nadel vorsichtig abwischen oder ein steriles Mullkissen auf die Arbeitsfläche legen und abtupfen. Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu verbiegen oder zu brechen.
- Befestigen Sie die Präzisionsspritze an der Mikropumpe und drehen Sie den Manipulatorarm vom Tisch weg, um ein Verschieben der Spritzennadel zu verhindern, bevor Sie die Maus auf den Tisch setzen.
4. Vorbereitung der Maus auf die Operation
- Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in die Induktionskammer legen, wobei der Isofluran-Verdampfer auf 2,5 % eingestellt ist, oder gemäß den institutionellen Richtlinien. Schalten Sie den Isofluranfluss zum Nasenkegel ein.
- Setzen Sie die Maus in die stereotaktische Apparatur ein und befestigen Sie sie am Nasenkegel, wobei die oberen Zähne auf der Nasenkonusstütze positioniert werden (Abbildung 1B, 9). Ziehen Sie den Knopf am Nasenkonus fest, um ihn zu befestigen (Abbildung 1B). Stellen Sie ein angemessenes Maß an Anästhesie sicher, indem Sie einen Zehenkneifen durchführen, um den Reflex zu überprüfen.
- Überwachen Sie die Ohren, Füße und Schleimhäute auf Farbe (rosa), um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Überwachen Sie auch die Atemfrequenz (ein Anstieg oder eine Abnahme könnte darauf hindeuten, dass der Isofluranspiegel angepasst werden muss).
- Setzen Sie die Ohrbügel (Abbildung 1B) in beide Ohren ein und ziehen Sie den Knopf fest, um den Kopf zu sichern.
- Tragen Sie Augensalbe auf, um die Augen zu befeuchten, während die Maus unter Narkose steht.
- Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Haare auf dem Kopf der Maus auf einen Bereich zu zupfen, der etwa 150 % größer ist als der geplante Schnitt, um ausreichende aseptische Bedingungen zu gewährleisten.
- Injizieren Sie 0,5-1 mg/kg Buprenorphin SR-Analgesie subkutan oder verwenden Sie ein anderes im Protokoll zugelassenes Analgetikum.
- Positionieren Sie die Rektalsonde der Maus, um die Innentemperatur zu überwachen und eine Unterkühlung aufgrund der Anästhesie zu verhindern. Halten Sie die Körpertemperatur der Maus zwischen 36,5 und 38,5 °C.
- Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit nach außen gerichteten Kreisen und wechseln Sie dreimal zwischen einem chirurgischen Peeling und Ethanol.
- Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette straff und machen Sie mit der Skalpellklinge einen Schnitt von ca. 1 cm, beginnend zwischen den Augen. Das Bregma sollte durch den Schnitt sichtbar sein.
Anmerkungen: Berühren Sie die Operationsstelle für eine ordnungsgemäße sterile Technik nur mit den Spitzen sterilisierter Werkzeuge und legen Sie die Werkzeugspitzen nur auf eine sterile Oberfläche (z. B. das Innere eines autoklavierten Werkzeugpakets). - Verwenden Sie das hölzerne Ende des Applikators mit Wattespitze, um überschüssiges Bindegewebe abzukratzen, und dann das Baumwollende eines anderen Applikators zum Trocknen.
5. Zellinjektion
- Ziehen Sie den Manipulatorarm mit dem Spritzenaufsatz über die Maus und ziehen Sie den Knopf fest, um ihn zu sichern. Verwenden Sie die X- und Y-Knöpfe in der horizontalen Ebene, um die Spritzenhalterung über Bremma zu bewegen. Senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf ab, um die Bregma-Position zu bestätigen. Stellen Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null.
- Verwenden Sie die X- und Y-Knöpfe und die entsprechende Digitalanzeige, um die Nadel in die gewünschte Position zu bringen. Für die Lage der kortikalen Rinde sind die entsprechenden Koordinaten 3 mm posterior, 2 mm lateral rechts von der Bremma und 2 mm tief von der Dura mater. Verwenden Sie den Z-Knopf, um die Nadel auf die Oberfläche des Schädels zu bewegen.
- Punktieren Sie ein Loch in den Schädel mit einer 1-ml-Spritze und einer angebrachten 25-G-Nadel. Setzen Sie die Abschrägung der Nadel in Richtung der 30-G-Präzisionsspritze und -nadel und drehen Sie den Manipulatorarm vorsichtig zur Seite. Rollen Sie die Nadel mit Daumen und Finger langsam und mit leichtem Druck hin und her, bis die Nadelspitze gerade noch die Schädeldecke durchsticht.
- Verwenden Sie einen Applikator mit Wattestäbchenspitze, um jegliches Blut aus dem Nadelloch abzutupfen. Bringen Sie den Manipulatorarm wieder in die entsprechende Position, wobei sich die Präzisionsspritzennadel über dem Loch befindet. Richten Sie die Nadelspitze am Loch aus, senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf auf die Gehirndura ab und stellen Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null.
- Senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf um 1 mm ab und warten Sie dann 1 Minute. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Tiefe erreicht ist (2 mm wie angegeben).
Anmerkungen: Die Nadel wird langsam abgesenkt, um eine zusätzliche Schädigung des umgebenden Hirngewebes und einen Rückfluss der Zelllösung zu vermeiden. - Starten Sie die Mikropumpe und überwachen Sie dann, ob die Pumpe stoppt, wenn 2 μl injiziert wurden. Dieser Vorgang sollte bei der angegebenen Geschwindigkeit etwa 6 Minuten dauern. Warten Sie dann 1 Minute, bevor Sie die Nadel bewegen.
6. Entfernen der Nadel und Wundverschluss
- Heben Sie die Nadel 1 mm an und warten Sie dann 1 Min. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Nadel vollständig frei vom Schädel ist.
- Verwenden Sie bei Bedarf einen Applikator mit Wattespitze, um Blut von der Injektionsstelle wegzutupfen.
- Nehmen Sie mit dem hölzernen Ende eines Applikators mit Wattestäbchen ein kleines Stück Knochenwachs (~1 mm) und formen Sie es zu einem Kegel. Setze es in die Öffnung im Schädel ein und drücke das Wachs in das Loch.
- Erhitzen Sie die Pinzette mit einem Perlensterilisator und verwenden Sie sie, um das restliche Wachs auf dem Schädel zu schmelzen und zu glätten.
- Geben Sie etwa zwei Tropfen Bupivacain-Lösung (Anästhesie) in den Schnitt und ziehen Sie die Hautränder mit einer Pinzette zusammen.
- Ziehen Sie die Haut straff und platzieren Sie ein oder zwei Wundclips, um die Haut zu schließen.
- Legen Sie die Maus in einen sauberen Erholungskäfig auf einem Heizkissen in einem zugfreien Bereich und beobachten Sie die Maus genau. Lassen Sie die Maus vollständig aus der Narkose aufwachen und ihre normale Aktivität wieder aufnehmen, bevor Sie sie wieder in die normale Unterbringung zurückbringen.
- Kontrollieren Sie die Maus täglich nach dem chirurgischen Eingriff und führen Sie eine Schmerzbehandlung gemäß den institutionellen Richtlinien durch.
- Wenn Buprenorphin SR (Schritt 4.6) zur Analgesie verwendet wird, hält die Retardformel 72 h an. Wiederholen Sie die Injektion nur, wenn nach 72 h sichtbare Schmerzen oder Beschwerden vorhanden sind. Bei korrekter Durchführung erholen sich die Mäuse gut von den intrakraniellen Injektionen und eine zusätzliche Analgesie ist nicht erforderlich.
- Entfernen Sie die Klammern 7-10 Tage nach der Operation.
- Überwachen Sie das Tumorwachstum durch Bildgebung von Tieren (MRT).
- Einschläfern Sie die Mäuse ein, wenn humane Endpunkte erreicht sind (d. h. wenn das Tier 20 % Körpergewicht verliert oder unterkühlt wird).
- Aufgrund der invasiven Natur dieser Hirntumore sollten die Mäuse auf neurologische Symptome wie ungleichmäßiger Gang, teilweise Lähmung, Drehen oder Kopfneigung beobachtet werden. Euthanasieren Sie eine Maus, wenn eines dieser klinischen Anzeichen eines fortgeschrittenen Tumorwachstums beobachtet wird.
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Representative Results
Mäuse, denen Hirntumorzellen injiziert wurden, sollten täglich auf Anzeichen von Tumorwachstum wie Krampfanfälle, Ataxie oder Gewichtsverlust überwacht werden. Das Wachstum von Hirntumoren kann auch durch MRT-Untersuchungen in regelmäßigen Abständen überwacht werden. Wöchentliche MRT-Scans ermöglichen die Visualisierung der zunehmenden Tumorlast im Gehirn und der Tumorvolumenmessungen (Abbildung 1C). Insbesondere TRP-Tumoren weisen ein aggressives Wachstum auf, und 3D-Tumorvolumina sind innerhalb von 2 bis 3 Wochen nach intrakranieller Injektion mittels MRT messbar (mit einem durchschnittlichen Volumen von 30 bis 40mm3). In einer repräsentativen Studie wurde eine Kohorte von Mäusen, die Hirntumore trugen, in zwei Gruppen eingeteilt, um die Kontrolle und die Strahlentherapie zu erhalten. Die MRT-Messung des Tumorvolumens ergab eine fehlende Unterdrückung des Tumorwachstums nach der Strahlenbehandlung (Abbildung 2A), was zu keiner Verlängerung des Überlebens der behandelten Mäuse führte (Abbildung 2B).
Bei der Sektion können Tumore als dunkler Fleck im Gehirn innerhalb einer geschwollenen rechten Hemisphäre auftreten (Abbildung 3A, mittleres Bild) oder bei größeren Tumoren als erhabener, dunkler Bereich. Für die histopathologische Analyse ermöglicht die sagittale Schnittführung durch den Bereich der Injektionsstelle (Abbildung 3A) eine optimale Beurteilung des Tumorwachstums und des Ausmaßes der Invasion in nicht-malignes Hirngewebe. GBM-Tumoren in syngenen Modellen können aggressiv wachsen und den Schädel am terminalen Endpunkt durchbrechen, was bei der Nekropsie beobachtet werden kann. Im Gegensatz dazu deutet das extrakranielle Wachstum kurz nach der Zellimplantation wahrscheinlich auf einen Zellverlust während der Injektion hin, der auf MRT-Scans (Abbildung 3B) oder bei einer lebenden Maus durch einen gewölbten Bereich am Kopf beobachtet werden kann. Möglicherweise wurde die Nadel zu schnell von der Injektionsstelle entfernt (siehe Abschnitt 6). Das extrakranielle Wachstum wird durch histologische Beurteilung als Leckage an der Injektionsstelle bestätigt.
Im orthotopen TRP-Modell bestätigte die Histopathologie das Vorliegen eines Astrozytoms/GBM Grad IV, einschließlich der Rekapitulation der charakteristischen Merkmale, die bei TRP-GEM-Tumoren beobachtet wurden, wie z. B. Pseudopalisading und Nekrose (Abbildung 4). Die für die humane GBM-Subklassifikation beschriebenen neuralen Stammzell- und Vorläuferzellmarker wurden immunhistochemisch ausgewertet (Abbildung 5). Eine weit verbreitete Expression des glialen fibrillären sauren Proteins (GFAP) deutet auf einen proliferativen Tumor astrozytären Vorläuferursprungs hin, während Nestin und Sox-2 etablierte neuronale Vorläufermarker sind und die Expression von Olig-2 das Vorhandensein von Zellen oligodendrozytären Ursprungs bestätigt 5,7. Alle vier Marker werden in Subtypen von humanem GBM8 stark exprimiert.
Abbildung 1: Aufbau des intrakraniellen Implantatapparates und Wachstum von TRP-GBM-Tumoren, dargestellt durch serielle MRT. (A) Apparateaufbau mit verschiedenen Elementen, die für ein intrakranielles Implantat erforderlich sind (1 bis 11 beschrieben); Die spezifische Platzierung des Mauskopfes und die Inhalationsanästhesieeinheit sind in (B) vergrößert. Die wöchentliche Bildgebung wurde auf einem klinischen MRT-3.0T-Scanner mit einer speziell angefertigten SENSE-Array-Oberflächenspule mit vier Mäusendurchgeführt 5,9. Multi-Slice T2-weighted turbo spin echo (T2w-TSE) Sequenz: (TR/TE (4437/100 ms), in der Ebene (0,12 x 0,15 mm), Schichtdicke (0,5 mm), SENSE-Beschleunigungsfaktor (4) Bilder wurden in der axialen Ebene aufgenommen, um das gesamte Mäusegehirn abzudecken. Dargestellt sind koronale Schnitte von Tumoren 3, 4 und 5 Wochen nach der Implantation. Ein repräsentativer Maßstabsbalken für MRT-Bilder ist unten rechts (C) angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Wirksamkeitsstudie eines orthotopen GBM-Modells mit Strahlenbehandlung. (A) Dreidimensionale Tumorvolumina, berechnet aus MRT-Scans, entsprechend den Implantaten der Wochen 2, 3 und 4 nach dem Tumor. Die Volumina der Hirntumoren wurden durch die Analyse der MRT-Bilder gemessen. Nach dem Hochladen eines MRT-Bildes in das ITK_SNAP Programm wurden der Bildkontrast und der Bildintensitätsbereichsfilter angepasst. Im Anschluss an die aktive Konturinitialisierung und Bildsegmentierung wurde das Tumorvolumen in kubischen Milimietern gemessen. Einzelne Kontrollmäuse (unbehandelt) und Mäuse, die mit Bestrahlung behandelt wurden (3 Gy pro Tag für 5 Tage für insgesamt 15 Gy), werden dargestellt. (B) Überleben von bestrahlten Mäusen im Vergleich zur Kontrolle. Der prozentuale Überlebensprozentsatz wurde mit einer Grafiksoftware (siehe Materialtabelle) von insgesamt n = 11 unbehandelten Mäusen und n = 12 bestrahlten Mäusen berechnet. Die Studienmäuse wurden euthanasiert, wenn humane Endpunkte erreicht waren, basierend auf unseren institutionellen Richtlinien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Lokalisation des Tumors im Gehirn bei der Sektion . (A) Korrekte Lokalisation des Tumorwachstums in der rechten Maushemisphäre. Das linke Bild zeigt ein Beispiel für einen Tumor im Gehirn aus einem MRT-Scan am Ende der Studie. Der rote Pfeil zeigt die Lage des Tumors an. Das präparierte Mäusegehirn wird im Schädel gezeigt (mittleres Bild) und aus der Schädelhöhle entfernt (rechtes Bild). In der Mitte zeigen blaue Pfeile den Nadelaufprall der Injektionsstelle an, und Doppelpfeile zeigen die empfohlene Stelle des sagittalen Hirnschnitts für die Histologie an, wobei die rechte Hemisphäre in zwei Teile geteilt wird. Beide Gehirnteile sind in Paraffin eingebettet, wie ein "offenes Buch". Die gestrichelte Linie zeigt die mediane Längsspalte, die die beiden Gehirnhälften trennt, als Referenz an. Im rechten Bereich stellt der von der gestrichelten Linie umschlossene Bereich die sichtbare Tumorregion bei der Sektion dar. (B) Ein Beispiel für einen Hirntumor, der außerhalb des Mausschädels wächst, ist in der MRT-Untersuchung zu sehen. Ein repräsentativer Maßstabsbalken für beide MRT-Bilder ist in Abbildung 3A dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Histopathologie orthotoper TRP-GBM-Tumoren rekapituliert die Kennzeichen des humanen GBM. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte, sagittale Schnitte des gesamten Gehirns wurden von einem ACVP-zertifizierten Veterinärpathologen bewertet und die Tumore wurden auf der Grundlage der aktuellen Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für menschliche Astrozytomeeingestuft 10,11. Orthotope GBM-Tumoren sind hochgradig proliferativ, invasiv (I) und vaskularisiert (V) und weisen Merkmale der humanen GBM-Histopathologie auf, einschließlich Nekrose (N) und Pseudopalisading (P) durch neoplastische Zellen12. Gestrichelte Linien zeigen die Vergrößerung der Bereiche innerhalb des Hirntumors und an der Peripherie, die an normales Hirngewebe angrenzen (oben bzw. unten rechts). Antikörper und Methoden zur Immunhistochemie sind in El Meskini et al.5 beschrieben. Eine Maßstabsleiste für H&E-Bilder wird sowohl für niedrige als auch für hohe Vergrößerungen angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Biomarker von GBM, die im orthotopen Modell exprimiert werden. Die Expression des multipotenten Vorläufermarkers SOX-2 (SRY-Box-Transkriptionsfaktor 2), der neuralen Vorläuferzellen Nestin und Olig-2 sowie des astrozytären Markers glial fibrillary acidic protein (GFAP) deuten auf zelluläre Heterogenität hin, ein gemeinsames Merkmal des humanen GBM 7,8. Eine repräsentative Maßstabsleiste für alle IHC-Bilder ist in Olig2 (Oligodendrozyten-Transkriptionsfaktor 2; unten rechts) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Präklinische Modelle sind essentiell für die Evaluierung neuer therapeutischer Zielstrukturen und neuartiger Behandlungsstrategien bei GBM. Gentechnisch veränderte Mausmodelle für GBM haben den Vorteil, dass Tumore an der autochthonen Stelle auftreten, aber oft mit einer langen Latenz und einem unvorhersehbaren Tumorwachstum13. Die Tumore des GEM-Modells weisen eine Latenz von 4-5 Monaten auf, und das ideale Zeitfenster für Bildgebung, Rekrutierung und Behandlung ist zwischen den einzelnen Mäusen unterschiedlich. Das orthotope Modell hat eine gut etablierte und beherrschbare Wachstums- und Behandlungszeit von 4-5 Wochen, und Tumore werden nach der Implantation zuverlässig durch MRT erkannt. Die Verwendung von GEM-abgeleiteten orthotopen Modellen ermöglicht die Platzierung des Tumors an der exakten Stelle in jeder Maus sowie die zeitliche Kontrolle der Initiierung des Tumorwachstums, wobei der Vorteil der umgebenden Mikroumgebung des Gehirns erhalten bleibt. Im orthotopen TRP-Modell erzeugen aktivierte RTK-, PTEN- und RB-Signalwege ein Tumormodell, das die histologischen Merkmale des humanen GBM rekapituliert. Analog zum humanen GBM zeigen orthotope TRP-GBM-Tumoren Merkmale eines aggressiven Wachstums, wie z.B. nekrotische Herde, die von pseudopalisadenden neoplastischen Zellen umgeben sind, und Neovaskularisation. Tumore sind auch invasiv in das umgebende Hirnparenchym. Daher können Wirkstoffe, die die Tumorinfiltration und -migration bei Patienten unterdrücken können, präklinisch in orthotopen TRP-Tumoren evaluiert werden. Der Prozess der Injektion von Zellen aus invasiven GEM-Tumoren in syngene Mäuse erfordert besondere Vorsicht, um das unbeabsichtigte Austreten und Wachstum von Zellen außerhalb der Zielregion zu vermeiden. Die hier beschriebene Methode kann, wenn sie routinemäßig praktiziert wird, verwendet werden, um große Kohorten von tumortragenden Mäusen mit konsistentem Tumorwachstum zu erzeugen.
Zu den entscheidenden Schritten im Protokoll, die sich auf eine erfolgreiche Tumorinjektion auswirken können, gehören die Entfernung der Nadel aus dem Gehirn nach der Zellinjektion und die Verwendung von Knochenwachs. Die Nadel muss jeweils 1 mm eingeführt und entfernt werden (wie in den Schritten 5 und 6 beschrieben), um eine zusätzliche Schädigung des umgebenden Hirngewebes und das Austreten von Restzellen oder den Rückfluss der injizierten Suspension14 zu verhindern. Die Verwendung von geschmolzenem Knochenwachs zum Stopfen und Versiegeln des Nadellochs schafft eine Barriere, um Zellleckagen zu verhindern, ebenso wie die Implantation von Zellen in einer Methylcellulosesuspension. Wichtig ist, dass Methylcellulose in einer gepufferten Lösung wie PBS (oder alternativ serumfreien Medien) gemischt werden muss, bevor die Gehirnzellen resuspendiert werden. Darüber hinaus wird die Verwendung einer Inhalationsanästhesie gegenüber einer injizierbaren Anästhesie bevorzugt, um die Genesungszeit zu verkürzen.
Beachten Sie, dass die Kopfgröße je nach Mausstamm oder nach Alter und Geschlecht leicht variieren kann. Daher muss die stereotaktische Ausrüstung möglicherweise neu kalibriert werden, wenn von einem Mauskohortentyp zu einem anderen gewechselt wird. Wir empfehlen auch, die Zellzahl für die Injektion für jede interessierende Zelllinie bei einer kleinen Anzahl von Mäusen zu optimieren, bevor mit einer großen Kohorte fortgefahren wird. Im Vergleich zu humanen Xenotransplantaten können murine Tumore aggressiv wachsen, wenn sie wieder in stammangepasste Mäuse implantiert werden, und benötigen weniger Zellen für die Injektion, wie wir bei TRP-Linien beobachtet haben.
Ein wesentlicher Vorteil der orthotopen Hirninjektion im Vergleich zur Initiierung und dem Wachstum von Glioblastomen in einem GEM-Modell besteht darin, dass das Gewebe, das den injizierten Tumor umgibt, normal ist und die lokale Invasivität histopathologisch beurteilt werden kann. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass sich durch die Injektionswunde selbst Veränderungen in der Mikroumgebung ergeben, die möglicherweise zu einer lokalen Entzündungsreaktion oder einer Störung der Blut-Hirn-Schranke führen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass orthotope Modelle die Untersuchung des GBM ermöglichen, mit einem angemessenen Zeitplan für die Behandlung und im Kontext der nativen Tumorlokalisation. Unser Modell rekapituliert menschliche GBM-Merkmale, jedoch in einer immunkompetenten Maus; Daher kann die Mikroumgebung des Immunsystems in Bezug auf das Tumorwachstum oder als Reaktion auf eine Immuntherapie analysiert werden. Das Tumorwachstum ist aggressiv und invasiv, im Gegensatz zu vielen Zelllinien-Xenotransplantat-GBM-Modellen, bei denen der Tumor eingekapselt bleibt und nicht die histologischen Merkmale des humanen GBM aufweist 13,15,16. Bei korrekter Durchführung führt das hier beschriebene Verfahren zu einem zuverlässigen Tumorwachstum ohne Zellleckage oder extrakranielle Ausbreitung.
Obwohl dieses Protokoll im Kontext von GBM als orthotopes Mausmodell optimiert wurde, kann seine Genauigkeit und zuverlässige Anwendung in der präklinischen Translation an Modelle anderer Hirntumor-Subklassen angepasst werden. Die Methoden und Reagenzien in diesem Protokoll können für verschiedene Zelltypenimplantate verwendet werden, die Mutationen für das interessierende Hirntumormodell tragen (z. B. diffuses Mittelliniengliom17), wobei die stereotaktischen Koordinaten angepasst werden müssen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Alan E. Kulaga für die hervorragende technische Unterstützung und Frau Michelle L. Gumprecht für die Verfeinerung der Operationstechniken. Wir danken Dr. Philip L. Martin für die Analyse der Pathologie und Frau Lilia Ileva und Dr. Joseph Kalen vom Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program für MRT-Scans.
Dieses Projekt wurde ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, unter der Vertragsnummer HHSN261201500003I finanziert. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Ministeriums für Gesundheit und Soziale Dienste wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
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- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
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