Summary
Här beskriver vi en preklinisk ortotopisk musmodell för GBM, etablerad genom intrakraniell injektion av celler härledda från genetiskt modifierade musmodelltumörer. Denna modell visar sjukdomskännetecknen för mänsklig GBM. För translationella studier spåras hjärntumören hos möss genom in vivo MR och histopatologi.
Abstract
Genetiskt modifierade musmodeller (GEM) för human glioblastoma multiforme (GBM) är avgörande för att förstå utvecklingen och progressionen av hjärntumörer. Till skillnad från xenografttumörer, i GEMs, uppstår tumörer i den ursprungliga mikromiljön i en immunkompetent mus. Användningen av GBM GEMs i prekliniska behandlingsstudier är dock utmanande på grund av långa tumörlatenser, heterogenitet i neoplasmfrekvens och tidpunkten för tumörutveckling av avancerad kvalitet. Möss inducerade via intrakraniell ortotopisk injektion är mer lätthanterliga för prekliniska studier och behåller funktionerna hos GEM-tumörerna. Vi genererade en ortotopisk hjärntumörmodell härledd från en GEM-modell med Rb-, Kras- och p53-avvikelser (TRP), som utvecklar GBM-tumörer som visar linjära foci av nekros av neoplastiska celler och tät vaskularisering analog med human GBM. Celler härledda från GEM GBM-tumörer injiceras intrakraniellt i vildtyp, stammatchade mottagarmöss och reproducerar grad IV-tumörer, vilket kringgår den långa tumörlatensperioden hos GEM-möss och möjliggör skapandet av stora och reproducerbara kohorter för prekliniska studier. De mycket proliferativa, invasiva och vaskulära egenskaperna hos TRP GEM-modellen för GBM rekapituleras i de ortotopiska tumörerna, och histopatologimarkörer återspeglar humana GBM-undergrupper. Tumörtillväxt övervakas av seriella MR-skanningar. På grund av den invasiva karaktären hos de intrakraniella tumörerna i immunkompetenta modeller är det viktigt att noggrant följa injektionsproceduren som beskrivs här för att förhindra extrakraniell tumörtillväxt.
Introduction
Glioblastom (GBM; grad IV gliom) är den vanligaste och maligna hjärntumören, och nuvarande behandlingar är ineffektiva, vilket resulterar i en medianöverlevnad på 15 månader1. Tillförlitliga och exakta prekliniska modeller som representerar de komplexa signalvägar som är involverade i hjärntumörtillväxt och patogenes är avgörande för att påskynda framstegen i utvärderingen av nya terapeutiska regimer för GBM. Musmodeller där humana hjärntumörcellinjer implanteras subkutant i immunsupprimerade möss återspeglar inte den naturliga immunmiljön hos hjärntumörer, och de kan inte heller användas för att utvärdera terapins förmåga att passera blod-hjärnbarriären2. Helst bör prekliniska musmodeller också nära reproducera den humana GBM-histopatologin, inklusive den höga invasiviteten i det omgivande parenkymet3. Även om genetiskt modifierade musmodeller (GEM) utvecklar tumörer i samband med ett intakt immunförsvar, krävs ofta komplicerade avelssystem och tumörer kan utvecklas långsamt och inkonsekvent4. GEM-härledda allograftmodeller är bättre lämpade för prekliniska terapeutiska studier, där stora kohorter av tumörbärande möss behövs inom en kortare tidsram.
I en tidigare rapport beskrev vi en ortotopisk GBM-musmodell härledd direkt från GEM-tumörer. Tumörgenes i GEM initieras av genetiska händelser i cellpopulationer (främst astrocyter) som uttrycker gliafibrillärt surt protein (GFAP), vilket resulterar i progression till GBM. Dessa TRP GEMs har en TgGZT121-transgen (T), som uttrycker T121 efter exponering för GFAP-driven Cre-rekombinas. T121-proteinuttryck resulterar i undertryckande av Rb (Rb1, p107 och p103) proteinaktivitet. Samuttryck av en GFAP-driven Cre-transgen (GFAP-CreERT2) riktar sig mot uttryck till vuxna astrocyter efter induktion med tamoxifen. TRP-möss har också en Cre-beroende mutant Kras (KrasG12D; R) allel, för att representera aktivering av receptortyrosinkinasvägen, och är heterozygota för förlust av Pten (P)5,6. Samtidiga genavvikelser i receptortyrosinkinas (RTK), PI3K och RB-nätverk är inblandade i 74% av GBM-patogenes7. Därför representeras de primära signalvägarna som förändras i human GBM av de konstruerade mutationerna i TRP-möss, i synnerhet GBM-tumörer, där delade nedströmsmål för RTK aktiveras5.
Den GEM-härledda syngena ortotopiska modellen validerades som en modell som rekapitulerar egenskaper hos mänskliga hjärntumörer, inklusive invasivitet och förekomst av subtypbiomarkörer, för användning som en plattform för att utvärdera cancerterapier riktade mot avvikande vägar i GBM. Celler odlades från tumörer skördade från TRP-hjärnor och implanterades i hjärnan hos stammatchade möss, med hjälp av stereotaktisk utrustning för intrakraniell injektion i cortex. Denna prekliniska ortotopiska musmodell utvecklade GBM-tumörer som var mycket cellulära, invasiva, pleomorfa med hög mitotisk hastighet och visade linjära foci av nekros av neoplastiska celler och tät vaskularisering, som observerats för human GBM. Tumörvolymer och tillväxt mättes med magnetisk resonanstomografi in vivo (MRT).
I denna rapport beskriver vi den optimala tekniken för intrakraniell injektion av primära GBM-celler eller cellinjer i vildtypsmushjärnan, med TRP-tumörer som exempel. Samma protokoll kan anpassas för immunsupprimerade möss och andra GBM-cellinjer. Viktiga tips ges för att undvika vanliga fallgropar, såsom suboptimal cellpreparering eller cellläckage vid injektionsstället, och för att använda stereotaktisk utrustning korrekt för att säkerställa modellens reproducerbarhet och tillförlitlighet. För translationella ändamål validerar vi modellen genom MR-detektion av hjärntumörtillväxt hos levande djur, histologisk karakterisering och presenterar ett exempel på behandling i tumörbärande möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieprotokollet som beskrivs här godkändes av NCI vid Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick är ackrediterat av AAALAC International och följer Public Health Service Policy för vård och användning av försöksdjur. Djurvård tillhandahölls i enlighet med de förfaranden som beskrivs i "Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).
1. Beredning av celler för injektion
OBS: Primära mustumörceller (MBR) som användes för denna modell isolerades ursprungligen från tamoxifeninducerade TRP GEM-möss, som beskrivs i El Meskini et al.5. Detaljer om cellberedningen finns i denna referens.
- Utför följande steg med steril teknik i ett biosäkerhetsskåp.
- Odla primära hjärntumörceller in vitro tills de når den exponentiella tillväxtfasen.
- Skörda cellerna i 0,25% trypsin, och när de har lossnat, späd dem med tillväxtmedium för att inaktivera trypsinet.
- Pellet cellerna genom centrifugering vid 400 x g och tvätta med serumfria medier. Upprepa en gång innan du räknar.
- Räkna cellerna manuellt eller med en automatiserad cellräknare. Resuspendera cellerna i 5% steril metylcellulosa i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid önskad koncentration, baserat på en slutlig injektionsvolym på 2 μl. Den önskade cellkoncentrationen kan variera beroende på cellinjen och hjärntumörmodellen. För GBM GEM TRP-celler injicerar vi 2 μL av en 25 x 106 celler/ml lösning, eller 50 000 celler.
2. Musstam
- Ras eller köp en lämplig musstam som matchar stambakgrunden hos hjärntumörcellerna. För TRP-celler, använd 9 veckor gamla B6D2F1 / J-möss (från en korsning mellan C57BL / 6J [B6] honor och DBA / 2J [D2] män) som tumörcellmottagare.
3. Ställa in det kirurgiska området
OBS: Alla kirurgiska steg utförs med aseptisk teknik i en ren, saniterad miljö. Scrubs och personlig skyddsutrustning, inklusive en mask, ska bäras av kirurgen. Kirurgiska verktyg måste värmesteriliseras före användning.
- Placera ytskydd under den stereotaxiska apparaten och på arbetsytan.
- Fäst vinylröret från anestesimaskinen till IN-porten på gasanestesiplattformen på den stereotaxiska apparaten och ett annat rör till OUT-porten.
- Anslut den digitala displayen till en strömkälla och till apparaten.
- Anslut mikropumpens styrenhet (bild 1A) till en strömkälla och anslut mikropumpen (bild 1A) till apparatens manipulatorarm (se även tillverkarens anvisningar).
- Ställ in mikropumpen på 5,6 nL/s för volyminsprutningen på 2 000 nL.
- Slå på den heta pärlsterilisatorn.
- Anslut musens värmedyna till temperaturregulatorn och anslut till en strömkälla. Placera plattan på scenplattformen. Ställ in platttemperaturen på 37 °C.
- Ladda tillbaka en 30 G precisionsspruta, var försiktig så att du inte introducerar bubblor. Sätt i kolven och fäst nålen. Se till att endast greppa nålen vid navet. Tryck in kolven tills en droppe av metylcellulosacellblandningen kommer ut genom nålen. Rengör nålen med en 70% alkoholberedningsdyna genom att försiktigt torka av nålens sidor eller genom att placera en steril gasbinda på arbetsytan och blotta den. Var försiktig så att du inte böjer eller bryter nålen.
- Fäst precisionssprutan på mikropumpen och vrid manipulatorarmen bort från scenen för att förhindra att sprutnålen förskjuts innan musen placeras på scenen.
4. Förbereda musen för operation
- Bedöva musen genom att placera den i induktionskammaren med isofluranförångaren inställd på 2,5%, eller enligt institutionella riktlinjer. Slå på isofluranflödet till noskonen.
- Överför musen till den stereotaxiska apparaten och fäst vid noskonen, med de övre tänderna placerade på noskonstödet (figur 1B, 9). Dra åt vredet på noskonen för att säkra (figur 1B). Säkerställ en lämplig nivå av anestesi genom att utföra en tåknäpa för att kontrollera reflexen.
- Övervaka öron, fötter och slemhinnor för färg (rosa) för att säkerställa tillräcklig syresättning. Övervaka även andningsfrekvensen (en ökning eller minskning kan indikera behovet av att justera isoflurannivåerna).
- Sätt in öronstängerna (bild 1B) i båda öronen och dra åt ratten för att säkra huvudet.
- Applicera ögonsalva för att smörja ögonen medan musen är under anestesi.
- Använd böjda pincett för att plocka håret på musens huvud till ett område som är cirka 150% större än det planerade snittet för att säkerställa adekvata aseptiska förhållanden.
- Injicera 0,5-1 mg/kg buprenorfin SR-analgesi subkutant, eller använd ett annat protokollgodkänt smärtstillande medel.
- Placera musens rektala sond för att övervaka inre temperatur och förhindra hypotermi på grund av anestesi. Håll musens kroppstemperatur mellan 36,5 och 38,5 °C.
- Sanera det kirurgiska fältet med utåtgående cirklar, alternerande mellan en kirurgisk skrubba och etanol tre gånger.
- Använd pincett för att dra huden spänd, gör ett snitt på cirka 1 cm med skalpellbladet, med början mellan ögonen. Bregma ska vara synlig genom snittet.
OBS: För korrekt steril teknik, vidrör operationsområdet endast med spetsarna på steriliserade verktyg och placera verktygsspetsar endast på en steril yta (t.ex. insidan av en autoklaverad verktygsförpackning). - Använd träänden av bomullsspetsad applikator för att skrapa bort överflödig bindväv och sedan bomullsänden på en annan applikator för att torka.
5. Cellinjektion
- Sätt tillbaka manipulatorarmen med sprutfästet över musen och dra åt ratten för att säkra. Använd X- och Y-rattarna i horisontalplanet för att flytta sprutfästet över bregma. Sänk nålen med Z-ratten för att bekräfta bregma-positionen. Ställ in den digitala avläsningskonsolen på noll.
- Använd X- och Y-rattarna och motsvarande digitala avläsning för att flytta nålen till önskad position. För kortikala cortexplatsen är lämpliga koordinater 3 mm bakre, 2 mm laterala höger till bregma och 2 mm djupa från dura materen. Använd Z-ratten för att flytta nålen till ytan av skallen.
- Punktera ett hål i skallen med en 1 ml spruta med en bifogad 25 G nål. Placera nålens fasning mot 30 G precisionssprutan och nålen och vrid försiktigt manipulatorarmen åt sidan. Använd tummen och fingret och rulla nålen långsamt fram och tillbaka med lätt tryck tills nålspetsen precis tränger igenom skallskyddet.
- Använd en bomullsapplikator för att badda bort blod från nålhålet. Sätt tillbaka manipulatorarmen till lämplig position med den laddade precisionssprutnålen ovanför hålet. Rikta in nålspetsen mot hålet med Z-ratten för att sänka nålen ner till hjärndura och ställ in den digitala avläsningskonsolen på noll.
- Sänk nålen 1 mm med Z-ratten och vänta sedan 1 minut. Upprepa tills önskat djup har uppnåtts (2 mm enligt anvisningar).
OBS: Nålen sänks långsamt för att förhindra ytterligare skador på den omgivande hjärnvävnaden och återflödet av celllösningen. - Starta mikropumpen och övervaka sedan att pumpen stannar när 2 μL har injicerats. Denna process bör ta cirka 6 minuter vid den angivna hastigheten. Vänta sedan 1 minut innan du flyttar nålen.
6. Borttagning av nålen och sårförslutning
- Lyft nålen 1 mm och vänta sedan 1 min. Upprepa tills nålen är helt fri från skallen.
- Använd vid behov en applikator med bomullsspets för att badda bort blod från injektionsstället.
- Använd träänden på en bomullsspetsapplikator, ta en liten bit benvax (~ 1 mm) och forma den till en kon. Placera den i öppningen i skallen och tryck in vaxet i hålet.
- Värm pincett med en pärlsterilisator och använd dem för att smälta kvarvarande vax på skallen och släta ut det.
- Placera ungefär två droppar bupivakain (bedövningsmedel) lösning i snittet och använd pincett för att dra ihop hudens kanter.
- Dra huden spänd och placera en eller två sårklämmor för att stänga huden.
- Placera musen i en ren återhämtningsbur på en värmedyna i ett dragfritt område och observera musen noga. Låt musen vakna helt från anestesin och återuppta normal aktivitet innan den återgår till vanligt hus.
- Kontrollera musen dagligen efter det kirurgiska ingreppet och administrera smärtlindring enligt institutionella riktlinjer.
- Om buprenorfin SR (steg 4.6) används för analgesi, varar formeln med fördröjd frisättning i 72 timmar. Upprepa injektionen endast om synlig smärta eller obehag föreligger efter 72 timmar. När de utförs korrekt återhämtar sig mössen väl från de intrakraniella injektionerna och ytterligare analgesi behövs inte.
- Ta bort häftklamrarna 7-10 dagar efter operationen.
- Övervaka tumörtillväxt genom levande djuravbildning (MRT).
- Avliva mössen när humana slutpunkter uppnås (dvs. om djuret förlorar 20% kroppsvikt eller blir hypotermt).
- På grund av den invasiva karaktären hos dessa hjärntumörer, observera mössen för neurologiska symtom, såsom ojämn gång, partiell förlamning, snurrning eller huvudlutning. Avliva en mus om något av dessa kliniska tecken på avancerad tumörtillväxt observeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Möss injicerade med hjärntumörceller bör övervakas dagligen för tecken på tumörtillväxt såsom kramper, ataxi, eller viktminskning. Hjärntumörtillväxt kan också övervakas genom MR-skanning med jämna mellanrum. Veckovisa MR-skanningar möjliggör visualisering av ökande tumörbörda i hjärnan och tumörvolymmätningar (figur 1C). I synnerhet uppvisar TRP-tumörer aggressiv tillväxt och 3D-tumörvolymer mäts med MR inom 2 till 3 veckor efter intrakraniell injektion (med en genomsnittlig volym på 30 till 40 mm3). I en representativ studie delades en kohort av hjärntumörbärande möss in i två grupper för kontroll kontra strålbehandling; MR-mätning av tumörvolym avslöjade brist på tumörtillväxthämning efter strålbehandling (figur 2A), vilket resulterade i ingen ökning av överlevnaden för de behandlade mössen (figur 2B).
Vid obduktion kan tumörer uppträda som en mörk fläck på hjärnan inom en svullen höger halvklot (figur 3A, mittpanelen), eller i fallet med större tumörer, som en upphöjd, mörkare region. För histopatologisk analys möjliggör sagittal snittning genom injektionsstället (figur 3A) optimal bedömning av tumörtillväxt och omfattningen av invasion i icke-malign hjärnvävnad. GBM-tumörer i syngena modeller kan växa aggressivt och bryta skallen vid den terminala slutpunkten, vilket kan observeras vid obduktion. Däremot indikerar extrakraniell tillväxt strax efter cellimplantation sannolikt ett läckage av celler under injektionen, vilket kan observeras på MR-skanningar (figur 3B) eller i en levande mus av ett kupolformat område på huvudet. Nålen kan ha avlägsnats från injektionsstället för snabbt (se avsnitt 6). Extrakraniell tillväxt bekräftas som läckage vid injektionsstället genom histologisk bedömning.
I TRP-ortotopisk modell bekräftade histopatologi närvaron av astrocytom/GBM av grad IV, inklusive rekapitulation av de särdrag som observerats i TRP GEM-tumörer såsom pseudopalisading och nekros (figur 4). GBM neurala stamceller och stamfadermarkörer beskrivna för human GBM subklassificering utvärderades med immunohistokemi (figur 5). Utbrett uttryck av glialt fibrillärt surt protein (GFAP) indikerar en proliferativ tumör av astrocytiskt stamursprung, medan Nestin och Sox-2 är etablerade neuronala stamfadermarkörer och Olig-2-uttryck bekräftar närvaron av celler av oligodendrocytiskt ursprung 5,7. Alla fyra markörerna uttrycks starkt i subtyper av humant GBM8.
Figur 1: Installation och tillväxt av TRP GBM-tumörer för intrakraniella implantat visualiserade med seriell MRT. (A) Apparatinstallation med olika element som är nödvändiga för intrakraniellt implantat (1 till 11 beskrivet); specifik mushuvudplacering och inhalationsanestesienhet förstoras i (B). Veckovis avbildning utfördes på en MRI 3.0T klinisk skanner med en specialbyggd fyra mus SENSE array ytspole 5,9. Multi-slice T2-viktad turbospinnekosekvens (T2w-TSE): (TR/TE (4437/100 ms), i plan upplösning (0,12 x 0,15 mm), skivtjocklek (0,5 mm), SENSE-accelerationsfaktor (4) bilder förvärvades i axialplanet för att täcka hela mushjärnan. Visas är koronala sektioner från tumörer vid 3, 4 och 5 veckor efter implantatet. En representativ skalstapel för MR-bilder anges längst ned till höger (C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ effektstudie av en ortotopisk GBM-modell med strålbehandling. (A) Tredimensionella tumörvolymer beräknade från MR-skanningar, motsvarande vecka 2, 3 och 4 posttumörimplantat. Hjärntumörernas volymer mättes genom analys av MR-bilderna. Efter att ha laddat upp en MR-bild till ITK_SNAP-programmet justerades bildkontrasten och filtret för bildintensitetsregionen. Efter den aktiva konturinitialiseringen och bildsegmenteringen mättes tumörvolymen i kubikmilimietrar. Individuella (obehandlade) möss och möss behandlade med bestrålning (3 Gy per dag i 5 dagar för totalt 15 Gy) plottas. b) Överlevnad för strålbehandlade möss jämfört med kontroll. Överlevnadsprocenten beräknades med grafprogram (se materialtabell) från totalt n = 11 obehandlade möss och n = 12 strålningsbehandlade möss. Studiemöss avlivades när humana slutpunkter uppnåddes, baserat på våra institutionella riktlinjer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tumörplats i hjärnan vid obduktion . (A) Korrekt placering av tumörtillväxt i höger mushalvklot. Den vänstra panelen visar ett exempel på en tumör i hjärnan från en MR-skanning vid studiens avslutande; Den röda pilen indikerar tumörens plats. Den dissekerade mushjärnan visas i skallen (mittpanelen) och avlägsnas från kranialhålan (höger panel). I mittpanelen indikerar blå pilar injektionsställets nålpåverkan och dubbelriktade pilar indikerar den rekommenderade platsen för hjärnsagittalskärningen för histologi och delar upp den högra halvklotet i två delar. Båda hjärndelarna är inbäddade i paraffin på ett "öppet bok" -sätt. Den streckade linjen anger medianen längsgående spricka som skiljer de två hjärnhalvorna som referens. I den högra panelen representerar området som omges av den streckade linjen det synliga tumörområdet vid obduktion. (B) Ett exempel på en hjärntumör som växer utanför musskallen visas i MR-skanningen. En representativ skalstapel för båda MR-bilderna visas i figur 3A. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Histopatologi av ortotopiska TRP GBM-tumörer rekapitulerar kännetecknen för human GBM. Hematoxylin och eosin (H &E) färgade, sagittala sektioner av hela hjärnan utvärderades av en ACVP-styrelsecertifierad veterinärpatolog, och tumörerna graderades baserat på den nuvarande Världshälsoorganisationen (WHO) klassificering för humana astrocytom10,11. Ortotopiska GBM-tumörer är mycket proliferativa, invasiva (I) och vaskulariserade (V) och uppvisar kännetecken för human GBM-histopatologi inklusive nekros (N) och pseudopalisading (P) av neoplastiska celler12. Streckade linjer visar förstoring av områdena inom hjärntumören och i periferin, intill normal hjärnvävnad (övre respektive nedre högra). Antikroppar och metoder för immunhistokemi beskrivs i El Meskini et al.5. En skalstapel för H&E-bilder visas för både låga och höga förstoringar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Biomarkörer för GBM uttryckta i den ortotopiska modellen. Uttryck av den multipotenta stammarkören SOX-2 (SRY-Box transkriptionsfaktor 2), neurala föregångare Nestin och Olig-2 och den gliala fibrillära sura proteinmarkören (GFAP) indikerar cellulär heterogenitet, en vanlig egenskap hos humant GBM 7,8. En representativ skalstapel för alla IHC-bilder visas i Olig2 (Oligodendrocyte transcription factor 2, nere till höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prekliniska modeller är avgörande för utvärdering av nya terapeutiska mål och nya behandlingsstrategier inom GBM. Genetiskt modifierade musmodeller för GBM har fördelen av tumörförekomst i det inhemska stället, men ofta med lång latens och oförutsägbar tumörtillväxt13. GEM-modellens tumörer uppvisar en latens på 4-5 månader, och det ideala tidsfönstret för avbildning, rekrytering och behandling varierar mellan enskilda möss. Den ortotopiska modellen har en väletablerad och lätthanterlig tillväxt- och behandlingstidslinje på 4-5 veckor, och tumörer detekteras på ett tillförlitligt sätt genom MR efter implantat. Användningen av GEM-härledda ortotopiska modeller möjliggör placering av tumören på den exakta platsen i varje mus, såväl som tidsmässig kontroll av tumörtillväxtinitiering, samtidigt som fördelen med den omgivande hjärnmikromiljön bibehålls. I TRP-ortotopisk modell producerar aktiverade RTK-, PTEN- och RB-vägar en tumörmodell som rekapitulerar de histologiska egenskaperna hos human GBM. Analogt med humant GBM uppvisar ortotopiska TRP GBM-tumörer egenskaper av aggressiv tillväxt, såsom nekrotiska foci omgivna av pseudopalisaderande neoplastiska celler och neovaskularisering. Tumörer är också invasiva i den omgivande hjärnparenkymen. Därför kan medel som kan undertrycka tumörinfiltration och migration hos patienter utvärderas prekliniskt i TRP ortotopiska tumörer. Processen att injicera celler från invasiva GEM-tumörer i syngena möss kräver särskild försiktighet för att undvika oavsiktlig läckage och tillväxt av celler utanför målområdet. Metoden som beskrivs här, när den rutinmässigt praktiseras, kan användas för att generera stora kohorter av tumörbärande möss med konsekvent tumörtillväxt.
Kritiska steg i protokollet som kan påverka framgångsrik tumörinjektion inkluderar avlägsnande av nålen från hjärnan, postcellinjektion och användning av benvax. Nålen måste föras in och avlägsnas 1 mm åt gången (enligt beskrivningen i steg 5 och 6) för att förhindra ytterligare skador på den omgivande hjärnvävnaden och läckage av kvarvarande celler eller återflöde av den injicerade suspensionen14. Användningen av smält benvax för att plugga och täta nålhålet skapar en barriär för att förhindra cellläckage, liksom implantering av celler i en metylcellulosasuspension. Viktigt är att metylcellulosa måste blandas i en buffrad lösning såsom PBS (eller alternativt serumfria medier) innan hjärncellerna återsuspenderas. Dessutom föredras användning av inhalationsanestesi framför injicerbar anestesi, för att förkorta återhämtningstiden.
Observera att huvudstorleken kan skilja sig något mellan musstammar eller efter ålder och kön; Således kan den stereotaktiska utrustningen behöva kalibreras om vid byte från en muskohorttyp till en annan. Vi rekommenderar också optimering av cellantalet för injektion för varje cellinje av intresse i ett litet antal möss innan du fortsätter med en stor kohort. Jämfört med humana xenotransplantat kan murina tumörer växa aggressivt när de implanteras i stammatchade möss och kräver färre celler för injektion, som vi observerade med TRP-linjer.
En viktig fördel med ortotopisk hjärninjektion jämfört med initiering och tillväxt av glioblastom i en GEM-modell är att vävnaden som omger den injicerade tumören är normal och lokal invasivitet kan bedömas genom histopatologi. Vi kan dock inte utesluta förändringar i mikromiljön på grund av själva injektionssåret, vilket möjligen resulterar i ett lokalt inflammatoriskt svar eller störning av blod-hjärnbarriären.
Sammanfattningsvis möjliggör ortotopiska modeller studier av GBM, med en rimlig tidslinje för behandling och inom ramen för den ursprungliga tumörplatsen. Vår modell rekapitulerar mänskliga GBM-funktioner men i en immunkompetent mus; Därför kan immunmikromiljön analyseras i förhållande till tumörtillväxt eller som svar på immunterapi. Tumörtillväxt är aggressiv och invasiv, till skillnad från många cellinjexenograft GBM-modeller där tumören förblir inkapslad och inte uppvisar de histologiska egenskaperna hos humana GBM13,15,16. När den utförs korrekt resulterar proceduren som beskrivs här i tillförlitlig tumörtillväxt utan cellläckage eller extrakraniell spridning.
Slutligen, även om detta protokoll har optimerats i samband med GBM som en ortotopisk musmodell, kan dess noggrannhet och tillförlitliga tillämpning i preklinisk översättning anpassas till modeller av andra underklasser av hjärntumörer. Metoder och reagens i detta protokoll kan användas för olika celltypsimplantat som bär mutationer för hjärntumörmodellen av intresse (t.ex. diffust mittlinjegliom17), med justering av stereotaktiska koordinater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Alan E. Kulaga för utmärkt teknisk hjälp och mot Michelle L. Gumprecht för att ha förfinat de kirurgiska teknikerna. Vi tackar Dr. Philip L. Martin för patologianalys och Lilia Ileva och Dr. Joseph Kalen från Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program för MR-skanningar.
Detta projekt har finansierats helt eller delvis med federala medel från National Cancer Institute, National Institutes of Health, enligt kontrakt nr. HHSN261201500003I. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller policyer från Department of Health and Human Services, och omnämnandet av handelsnamn, kommersiella produkter eller organisationer innebär inte heller godkännande av den amerikanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al.
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G.
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , Exon Publications. (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J.
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
