Summary
Her beskriver vi en præklinisk ortopisk musemodel for GBM, etableret ved intrakraniel injektion af celler afledt af genetisk manipulerede musemodeltumorer. Denne model viser sygdomskendetegnene for human GBM. Til translationelle undersøgelser spores musehjernetumoren ved in vivo MR og histopatologi.
Abstract
Gensplejsede mus (GEM) modeller for human glioblastoma multiforme (GBM) er afgørende for at forstå udviklingen og progressionen af hjernetumorer. I modsætning til xenografttumorer opstår tumorer i GEM'er i det oprindelige mikromiljø i en immunkompetent mus. Imidlertid er brugen af GBM GEM'er i prækliniske behandlingsstudier udfordrende på grund af lange tumorlatenstider, heterogenitet i neoplasmafrekvens og tidspunktet for avanceret tumorudvikling. Mus induceret via intrakraniel ortopisk injektion er mere håndterbare til prækliniske undersøgelser og bevarer træk ved GEM-tumorerne. Vi genererede en ortopisk hjernetumormodel afledt af en GEM-model med Rb-, Kras- og p53-aberrationer (TRP), som udvikler GBM-tumorer, der viser lineære foci af nekrose af neoplastiske celler og tæt vaskularisering analog med human GBM. Celler afledt af GEM GBM-tumorer injiceres intrakranielt i vildtype, stammematchede modtagermus og reproducerer klasse IV-tumorer, hvilket omgår den lange tumorlatensperiode hos GEM-mus og muliggør oprettelse af store og reproducerbare kohorter til prækliniske undersøgelser. De meget proliferative, invasive og vaskulære træk ved TRP GEM-modellen for GBM rekapituleres i de ortotopiske tumorer, og histopatologiske markører afspejler humane GBM-undergrupper. Tumorvækst overvåges ved serielle MR-scanninger. På grund af den invasive karakter af de intrakranielle tumorer i immunkompetente modeller er det vigtigt at følge injektionsproceduren beskrevet her for at forhindre ekstrakraniel tumorvækst.
Introduction
Glioblastom (GBM; grad IV gliom) er den mest almindelige og ondartede hjernetumor, og nuværende behandlinger er ineffektive, hvilket resulterer i en median overlevelse på 15 måneder1. Pålidelige og nøjagtige prækliniske modeller, der repræsenterer de komplekse signalveje, der er involveret i hjernetumorvækst og patogenese, er afgørende for at fremskynde fremskridtene med at evaluere nye terapeutiske regimer for GBM. Musemodeller, hvor humane hjernetumorcellelinjer implanteres subkutant i immunkompromitterede mus, afspejler ikke det oprindelige immunsystem i hjernetumorer, og de kan heller ikke bruges til at evaluere terapeutiske evne til at krydse blod-hjerne-barrieren2. Ideelt set bør prækliniske musemodeller også nøje reproducere den humane GBM-histopatologi, herunder det høje niveau af invasivitet i det omgivende parenkym3. Selvom genetisk manipulerede mus (GEM) modeller udvikler tumorer i forbindelse med et intakt immunsystem, kræves der ofte komplicerede avlsordninger, og tumorer kan udvikle sig langsomt og inkonsekvent4. GEM-afledte allograftmodeller er bedre egnet til prækliniske terapeutiske studier, hvor store kohorter af tumorbærende mus er nødvendige inden for en kortere tidsramme.
I en tidligere rapport beskrev vi en ortopisk GBM-musemodel afledt direkte af GEM-tumorer. Tumorigenese i GEM initieres af genetiske begivenheder i cellepopulationer (primært astrocytter), der udtrykker glialfibrillært surt protein (GFAP), der resulterer i progression til GBM. Disse TRP GEMs har et TgGZT121 transgen (T), som udtrykker T121 efter eksponering for den GFAP-drevne Cre-rekombinase. T121-proteinekspression resulterer i undertrykkelse af Rb (Rb1, p107 og p103) proteinaktivitet. Co-ekspression af et GFAP-drevet Cre-transgen (GFAP-CreERT2) målretter ekspression til voksne astrocytter efter induktion med tamoxifen. TRP-mus har også en Cre-afhængig mutant Kras (KrasG12D; R) allel, for at repræsentere aktivering af receptortyrosinkinasevejen og er heterozygote for tab af Pten (P)5,6. Samtidige genaberrationer i receptortyrosinkinase (RTK), PI3K og RB-netværk er impliceret i 74% af GBM-patogenese7. Derfor er de primære signalveje, der er ændret i human GBM, repræsenteret af de konstruerede mutationer i TRP-mus, især GBM-tumorer, hvor delte nedstrømsmål for RTK'er aktiveres5.
Den GEM-afledte syngeneiske ortopiske model blev valideret som en model, der rekapitulerer træk ved humane hjernetumorer, herunder invasivitet og tilstedeværelsen af subtype biomarkører, til brug som en platform til evaluering af kræftterapi rettet mod afvigende veje i GBM. Celler blev dyrket fra tumorer høstet fra TRP-hjerner og genimplanteret i hjernen hos stammematchede mus ved hjælp af stereotaktisk udstyr til intrakraniel injektion i cortex. Denne prækliniske ortotopiske musemodel udviklede GBM-tumorer, der var meget cellulære, invasive, pleomorfe med en høj mitotisk hastighed og viste lineære foci af nekrose ved neoplastiske celler og tæt vaskularisering, som observeret for human GBM. Tumorvolumener og vækst blev målt ved in vivo magnetisk resonansbilleddannelse (MRI).
I denne rapport beskriver vi den optimale teknik til intrakraniel injektion af primære GBM-celler eller cellelinjer i vildtypemusehjernen ved hjælp af TRP-tumorer som et eksempel. Den samme protokol kan tilpasses til immunkompromitterede mus og andre GBM-cellelinjer. Der gives afgørende tips til at undgå almindelige faldgruber, såsom suboptimal celleforberedelse eller cellelækage på injektionsstedet, og til at bruge det stereotaktiske udstyr korrekt for at sikre modellens reproducerbarhed og pålidelighed. Til translationelle formål validerer vi modellen ved MR-påvisning af hjernetumorvækst hos levende dyr, histologisk karakterisering og præsenterer et eksempel på behandling i tumorbærende mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den her beskrevne undersøgelsesprotokol blev godkendt af NCI på Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick er akkrediteret af AAALAC International og følger Public Health Service Policy for pleje og brug af forsøgsdyr. Dyrepasning blev ydet i overensstemmelse med de procedurer, der er beskrevet i "Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).
1. Klargøring af celler til injektion
BEMÆRK: Musehjernetumor primære celler (MBR'er), der anvendes til denne model, blev oprindeligt isoleret fra tamoxifen-inducerede TRP GEM-mus, som beskrevet i El Meskini et al.5. Detaljer om cellepræparatet findes i denne reference.
- Udfør følgende trin ved hjælp af steril teknik i et biosikkerhedsskab.
- Kultur primære hjernetumorceller in vitro , indtil de når den eksponentielle vækstfase.
- Høst cellerne i 0,25% trypsin, og når de har løsnet, fortynd dem med vækstmedium for at inaktivere trypsinet.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 400 x g og vask med serumfrie medier. Gentag én gang før optælling.
- Tæl cellerne manuelt eller med en automatiseret celletæller. Resuspender cellerne i 5% steril methylcellulose i 1x phosphatbufret saltvand (PBS) ved den ønskede koncentration, baseret på et slutinjektionsvolumen på 2 μL. Den ønskede cellekoncentration kan variere afhængigt af cellelinjen og hjernetumormodellen. Til GBM GEM TRP-celler injicerer vi 2 μL af en 25 x 106 celler/ml opløsning eller 50.000 celler.
2. Mus stamme
- Opdræt eller køb en passende musestamme, der matcher stammen baggrund af hjernetumorcellerne. For TRP-celler skal du bruge 9 uger gamle B6D2F1 / J-mus (fra en krydsning mellem C57BL / 6J [B6] kvinder og DBA / 2J [D2] mænd) som tumorcellemodtagere.
3. Opsætning af det kirurgiske område
BEMÆRK: Alle kirurgiske trin udføres ved hjælp af aseptisk teknik i et rent, desinficeret miljø. Skrubber og personlige værnemidler, herunder en maske, skal bæres af kirurgen. Kirurgiske værktøjer skal varmesteriliseres inden brug.
- Anbring overfladebeskyttere under stereotaksapparatet og på arbejdsfladen.
- Fastgør vinylrøret fra anæstesimaskinen til IN-porten på gasanæstesiplatformen på det stereotaksiske apparat og et andet rør til OUT-porten.
- Tilslut det digitale display til en strømkilde og til apparatet.
- Tilslut mikropumperegulatoren (figur 1A) til en strømkilde, og fastgør mikropumpen (figur 1A) til apparatets manipulatorarm (se også producentens anvisninger).
- Indstil mikropumpen til 5,6 nL/s for 2.000 nL volumenindsprøjtning.
- Tænd sterilisatoren med varm perle.
- Sæt musens varmepude i temperaturregulatoren, og tilslut til en strømkilde. Placer pladen på sceneplatformen. Indstil pladetemperaturen til 37 °C.
- Backload en 30 G præcisionssprøjte, pas på ikke at indføre bobler. Indsæt stemplet og fastgør kanylen. Sørg for kun at gribe nålen ved navet. Tryk stemplet ned, indtil en dråbe af methylcellulosecelleblandingen løber gennem nålen. Rens nålen med en 70% alkoholpræparationspude ved forsigtigt at tørre kanylens sider af eller ved at placere en steril gazepude på arbejdsfladen og blotte den. Pas på ikke at bøje eller knække nålen.
- Fastgør præcisionssprøjten til mikropumpen, og drej manipulatorarmen væk fra scenen for at forhindre, at sprøjten-nålen forskydes, før musen placeres på scenen.
4. Forberedelse af musen til operation
- Bedøv musen ved at placere den i induktionskammeret med isofluranfordamperen indstillet til 2,5% eller i henhold til institutionelle retningslinjer. Tænd for isofluranstrømmen til næsekeglen.
- Overfør musen til det stereotaksiske apparat og fastgør den til næsekeglen med de øverste tænder placeret på næsekeglestøtten (figur 1B, 9). Stram knappen på næsekeglen for at fastgøre den (figur 1B). Sørg for et passende niveau af anæstesi ved at udføre en tåklemme for at kontrollere refleks.
- Overvåg ørerne, fødderne og slimhinderne for farve (pink) for at sikre tilstrækkelig iltning. Overvåg også respirationsfrekvensen (en stigning eller et fald kan indikere behovet for at justere isofluranniveauet).
- Indsæt ørestænger (figur 1B) i begge ører, og stram knappen for at fastgøre hovedet.
- Påfør øjensalve for at smøre øjnene, mens musen er under bedøvelse.
- Brug buede tang til at plukke håret på musens hoved til et område, der er ca. 150% større end det planlagte snit, for at sikre tilstrækkelige aseptiske forhold.
- Injicer 0,5-1 mg/kg buprenorphin SR analgesi subkutant, eller brug et andet protokolgodkendt smertestillende middel.
- Placer musens rektale sonde for at overvåge den indre temperatur og forhindre hypotermi på grund af anæstesi. Hold musens kropstemperatur mellem 36,5 og 38,5 °C.
- Rens det kirurgiske felt ved hjælp af udadgående cirkler, skiftevis mellem en kirurgisk skrubbe og ethanol tre gange.
- Brug tang til at trække huden stramt, lav et snit på ca. 1 cm med skalpelbladet, der starter mellem øjnene. Bremma skal være synlig gennem snittet.
BEMÆRK: For korrekt steril teknik skal du kun røre ved det kirurgiske sted med spidserne af steriliserede værktøjer og kun placere værktøjsspidser på en steril overflade (såsom indersiden af en autoklaveret værktøjspakke). - Brug træenden af applikatoren med bomuldsspids til at skrabe overskydende bindevæv væk, og tør derefter bomuldsendenden af en anden applikator.
5. Celleinjektion
- Sæt manipulatorarmen tilbage med sprøjtetilbehøret over musen, og stram knappen for at fastgøre den. Brug X- og Y-knapperne i det vandrette plan til at flytte sprøjteholderen over bregma. Sænk nålen ved hjælp af Z-knappen for at bekræfte bregma-positionen. Indstil den digitale udlæsningskonsol til nul.
- Brug X- og Y-knapperne og den tilsvarende digitale aflæsning til at flytte nålen til den ønskede position. For den kortikale cortex placering er de relevante koordinater 3 mm bageste, 2 mm laterale højre til bregma og 2 mm dybe fra dura mater. Brug Z-knappen til at flytte nålen til overfladen af kraniet.
- Punktering af et hul i kraniet med en 1 ml sprøjte med en påsat 25 G kanyle. Placer kanylens skråning mod 30 G præcisionssprøjten og kanylen, og drej forsigtigt manipulatorarmen til siden. Brug tommelfinger og finger til at rulle nålen langsomt frem og tilbage med et let tryk, indtil nålespidsen lige gennemborer kraniehætten.
- Brug en applikator med bomuldsspids til at duppe blod væk fra nålehullet. Sæt manipulatorarmen i den rigtige position med den isatte præcisionskanyle over hullet. Juster spidsen af nålen med hullet ved hjælp af Z-knappen til at sænke nålen ned til hjerneduraen, og indstil den digitale udlæsningskonsol til nul.
- Brug Z-knappen til at sænke nålen 1 mm, og vent derefter 1 min. Gentag indtil den ønskede dybde er nået (2 mm som angivet).
BEMÆRK: Kanylen sænkes langsomt for at forhindre yderligere skade på det omgivende hjernevæv og tilbagestrømning af celleopløsningen. - Start mikropumpen, og overvåg derefter for at sikre, at pumpen stopper, når 2 μL er blevet injiceret. Denne proces skal tage ca. 6 minutter ved den angivne hastighed. Vent derefter 1 minut, før nålen flyttes.
6. Fjernelse af nålen og sårlukning
- Løft nålen 1 mm og vent derefter 1 min. Gentag indtil nålen er helt fri for kraniet.
- Brug om nødvendigt en applikator med bomuldsspids til at duppe blod væk fra injektionsstedet.
- Brug træenden af en applikator med bomuldsspids til at tage et lille stykke knoglevoks (~ 1 mm) og form det til en kegle. Placer den i åbningen i kraniet, og skub voksen ind i hullet.
- Varm tang ved hjælp af en perlesterilisator og brug dem til at smelte resterende voks på kraniet og glatte det.
- Placer cirka to dråber bupivacain (bedøvelse) opløsning i snittet og brug tang til at trække kanterne af huden sammen.
- Træk huden stram og læg en eller to sårklemmer for at lukke huden.
- Placer musen i et rent genoprettelsesbur på en varmepude i et trækfrit område, og observer musen nøje. Lad musen vågne helt op fra anæstesien og genoptage normal aktivitet, inden den returneres til almindeligt hus.
- Kontroller musen dagligt efter den kirurgiske procedure og administrer smertebehandling i henhold til institutionelle retningslinjer.
- Hvis buprenorphin SR (trin 4.6) anvendes til analgesi, varer formlen med vedvarende frigivelse i 72 timer. Gentag kun injektionen, hvis der er synlig smerte eller ubehag efter 72 timer. Når det udføres korrekt, genvinder musene godt fra de intrakranielle injektioner, og yderligere analgesi er ikke nødvendig.
- Fjern hæfteklammerne 7-10 dage efter operationen.
- Overvåg tumorvækst ved levende dyrebilleddannelse (MRI).
- Aflive musene, når humane endepunkter er nået (dvs. hvis dyret taber 20% kropsvægt eller bliver hypotermisk).
- På grund af den invasive karakter af disse hjernetumorer, observere musene for neurologiske symptomer, såsom ujævn gang, delvis lammelse, spinding, eller hovedet vippe. Aflive en mus, hvis nogen af disse kliniske tegn på avanceret tumorvækst observeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus, der injiceres med hjernetumorceller, bør overvåges dagligt for tegn på tumorvækst såsom anfald, ataksi, eller vægttab. Hjernetumorvækst kan også overvåges ved MR-scanning med jævne mellemrum. Ugentlige MR-scanninger muliggør visualisering af stigende tumorbyrde i hjernen og tumorvolumenmålinger (figur 1C). Især udviser TRP-tumorer aggressiv vækst, og 3D-tumorvolumener kan måles ved MR inden for 2 til 3 uger efter intrakraniel injektion (med et gennemsnitligt volumen på 30 til 40 mm3). I en repræsentativ undersøgelse blev en kohorte af hjernetumorbærende mus opdelt i to grupper til kontrol versus strålebehandling; MR-tumorvolumenmåling afslørede mangel på undertrykkelse af tumorvækst efter strålebehandling (figur 2A), hvilket resulterede i ingen stigning i overlevelsen for de behandlede mus (figur 2B).
Ved obduktion kan tumorer forekomme som en mørk plet på hjernen inden for en hævet højre halvkugle (figur 3A, midterpanel) eller i tilfælde af større tumorer som en hævet, mørklagt region. Til histopatologisk analyse muliggør sagittal sektionering gennem injektionsstedsområdet (figur 3A) optimal vurdering af tumorvækst og omfanget af invasion i ikke-malign hjernevæv. GBM-tumorer i syngeneiske modeller kan vokse aggressivt og bryde kraniet ved det terminale endepunkt, hvilket kan observeres ved obduktion. I modsætning hertil indikerer ekstrakraniel vækst kort efter celleimplantation sandsynligvis en lækage af celler under injektionen, hvilket kan observeres på MR-scanninger (figur 3B) eller i en levende mus ved et kuplet område på hovedet. Kanylen kan være fjernet fra injektionsstedet for hurtigt (se punkt 6). Ekstrakraniel vækst bekræftes som lækage på injektionsstedet ved histologisk vurdering.
I TRP-ortopisk model bekræftede histopatologi tilstedeværelsen af grad IV astrocytom / GBM, herunder rekapitulation af de karakteristiske træk observeret i TRP GEM-tumorer såsom pseudopalisading og nekrose (figur 4). GBM neurale stamcelle- og stammarkører beskrevet for human GBM-underklassificering blev evalueret ved immunhistokemi (figur 5). Udbredt ekspression af glialfibrillært surt protein (GFAP) indikerer en proliferativ tumor af astrocytisk stamfaderoprindelse, mens Nestin og Sox-2 er etablerede neuronale stamfadermarkører, og Olig-2-ekspression bekræfter tilstedeværelsen af celler af oligodendrocytisk oprindelse 5,7. Alle fire markører udtrykkes stærkt i undertyper af human GBM8.
Figur 1: Opsætning af intrakranielt implantatapparat og vækst af TRP GBM-tumorer visualiseret ved seriel MR. (A) Apparatopsætning med forskellige elementer, der er nødvendige for intrakranielt implantat (1 til 11 beskrevet); specifik placering af musehoved og inhalationsanæstesienhed forstørres i (B). Ugentlig billeddannelse blev udført på en MR 3.0T klinisk scanner med en specialbygget fire mus SENSE array overfladespole 5,9. Multi-slice T2-vægtet turbo spin echo (T2w-TSE) sekvens: (TR / TE (4437/100 ms), i plan opløsning (0,12 x 0,15 mm), skivetykkelse (0,5 mm), SENSE accelerationsfaktor (4) billeder blev erhvervet i det aksiale plan for at dække hele musehjernen. Vist er koronale sektioner fra tumorer 3, 4 og 5 uger efter implantatet. En repræsentativ skalabjælke for MR-billeder er angivet nederst til højre (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ effektundersøgelse af en ortopisk GBM-model med strålebehandling. (A) Tredimensionelle tumorvolumener beregnet ud fra MR-scanninger, svarende til uge 2, 3 og 4 posttumorimplantater. Volumenerne af hjernetumorerne blev målt gennem analyse af MR-billederne. Efter upload af et MR-billede til ITK_SNAP-programmet blev billedkontrasten og billedintensitetsområdefilteret justeret. Efter den aktive konturinitialisering og billedsegmentering blev tumorvolumenet målt i kubiske milimieter. Der afbildes individuelle kontrolmus (ubehandlet) mus og mus, der behandles ved bestråling (3 Gy pr. dag i 5 dage, i alt 15 Gy). (B) Overlevelse af strålebehandlede mus sammenlignet med kontrolgruppen. Overlevelsesprocenten blev beregnet med grafsoftware (se materialetabel) fra i alt n = 11 ubehandlede mus og n = 12 strålingsbehandlede mus. Undersøgelsesmus blev aflivet, da humane endepunkter blev nået, baseret på vores institutionelle retningslinjer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tumorplacering i hjernen ved obduktion . (A) Korrekt placering af tumorvækst i højre musehalvdel. Det venstre panel viser et eksempel på en tumor i hjernen fra en MR-scanning ved studieafslutning; Den røde pil angiver tumorens placering. Den dissekerede musehjerne vises i kraniet (midterste panel) og fjernes fra kraniehulen (højre panel). I midterpanelet angiver blå pile nålens påvirkning af injektionsstedet, og dobbelthovedede pile angiver den anbefalede placering af hjernens sagittale snit til histologi, der deler højre halvkugle i to dele. Begge hjernedele er indlejret i paraffin på en "åben bog" måde. Den stiplede linje angiver den mediane langsgående sprække, der adskiller de to hjernehalvkugler som reference. I højre panel repræsenterer området omgivet af den stiplede linje det synlige tumorområde ved obduktion. (B) Et eksempel på en hjernetumor, der vokser uden for musekraniet, er vist i MR-scanningen. En repræsentativ skalabjælke for begge MR-billeder er vist i figur 3A. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Histopatologi af ortopiske TRP GBM-tumorer rekapitulerer kendetegnene ved human GBM. Hæmatoxylin og eosin (H & E) farvede, sagittale sektioner af hele hjernen blev evalueret af en ACVP-board-certificeret veterinærpatolog, og tumorerne blev klassificeret baseret på den nuværende Verdenssundhedsorganisation (WHO) klassifikation for humane astrocytomer10,11. Ortotopiske GBM-tumorer er stærkt proliferative, invasive (I) og vaskulariserede (V) og udviser kendetegn ved human GBM-histopatologi, herunder nekrose (N) og pseudopalisading (P) af neoplastiske celler12. Stiplede linjer viser forstørrelse af områderne i hjernetumoren og i periferien, der støder op til normalt hjernevæv (henholdsvis øverst og nederst til højre). Antistoffer og metoder til immunhistokemi er beskrevet i El Meskini et al.5. Der vises en skalabjælke for H&E-billeder for både lave og høje forstørrelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Biomarkører for GBM udtrykt i den ortopiske model. Ekspression af den multipotente stamfader markør SOX-2 (SRY-Box transkriptionsfaktor 2), neurale forfædre Nestin og Olig-2 og glial fibrillær sur protein (GFAP) astrocytisk markør indikerer cellulær heterogenitet, et fælles træk ved human GBM 7,8. En repræsentativ skalabjælke for alle IHC-billeder vises i Olig2 (Oligodendrocyt transkriptionsfaktor 2; nederst til højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prækliniske modeller er afgørende for evalueringen af nye terapeutiske mål og nye behandlingsstrategier i GBM. Gensplejsede musemodeller for GBM har fordelen ved tumorforekomst på det autoktone sted, men ofte med lang latenstid og uforudsigelig tumorvækst13. GEM-modeltumorerne udviser en latenstid på 4-5 måneder, og det ideelle tidsvindue til billeddannelse, rekruttering og behandling varierer blandt individuelle mus. Den ortopiske model har en veletableret og medgørlig vækst- og behandlingstidslinje på 4-5 uger, og tumorer detekteres pålideligt ved MR efter implantat. Anvendelsen af GEM-afledte ortopiske modeller muliggør placering af tumoren på den nøjagtige placering i hver mus samt tidsmæssig kontrol af tumorvækstinitiering, samtidig med at fordelen ved det omgivende hjernemikromiljø opretholdes. I TRP-ortopopisk model producerer aktiverede RTK-, PTEN- og RB-veje en tumormodel, der rekapitulerer de histologiske træk ved human GBM. Analogt med human GBM viser ortopiske TRP GBM-tumorer træk ved aggressiv vækst, såsom nekrotiske foci omgivet af pseudopalisaderende neoplastiske celler og neovaskularisering. Tumorer er også invasive i den omgivende hjerne parenchyma. Derfor kan midler, der kan undertrykke tumorinfiltration og migration hos patienter, evalueres præklinisk i TRP ortopiske tumorer. Processen med at injicere celler fra invasive GEM-tumorer i syngeneiske mus kræver særlig forsigtighed for at undgå utilsigtet lækage og vækst af celler uden for målområdet. Metoden beskrevet her, når rutinemæssigt praktiseres, kan bruges til at generere store kohorter af tumorbærende mus med konsekvent tumorvækst.
Kritiske trin i protokollen, der kan påvirke vellykket tumorinjektion, omfatter fjernelse af nålen fra hjernen efter celleinjektion og brug af knoglevoks. Kanylen skal indsættes og fjernes 1 mm ad gangen (som beskrevet i trin 5 og 6) for at forhindre yderligere beskadigelse af det omgivende hjernevæv og lækage af restceller eller tilbageløb af den injicerede suspension14. Brugen af smeltet knoglevoks til at tilslutte og forsegle nålehullet skaber en barriere for at forhindre cellelækage, ligesom implantering af celler i en methylcellulosesuspension. Det er vigtigt, at methylcellulose blandes i en bufret opløsning såsom PBS (eller alternativt serumfrie medier), inden hjernecellerne resuspenderes. Derudover foretrækkes brugen af inhalationsanæstesi frem for injicerbar anæstesi for at forkorte restitutionstiden.
Bemærk, at hovedstørrelsen kan variere lidt mellem musestammer eller efter alder og køn; Det kan således være nødvendigt at kalibrere det stereotaktiske udstyr igen, når der skiftes fra en musekohortetype til en anden. Vi anbefaler også optimering af cellenummeret til injektion for hver cellelinje af interesse i et lille antal mus, før du fortsætter med en stor kohorte. Sammenlignet med humane xenotransplantater kan murine tumorer vokse aggressivt, når de genimplanteres i stammematchede mus og kræve færre celler til injektion, som vi observerede med TRP-linjer.
En vigtig fordel ved ortopisk hjerneinjektion sammenlignet med initiering og vækst af glioblastom i en GEM-model er, at vævet omkring den injicerede tumor er normalt, og lokal invasivitet kan vurderes ved histopatologi. Vi kan dog ikke udelukke ændringer i mikromiljøet på grund af selve injektionssåret, hvilket muligvis resulterer i en lokal inflammatorisk reaktion eller forstyrrelse af blod-hjerne-barrieren.
Afslutningsvis giver ortopiske modeller mulighed for undersøgelse af GBM med en rimelig tidslinje for behandling og inden for rammerne af den oprindelige tumorplacering. Vores model rekapitulerer menneskelige GBM-funktioner, men i en immunkompetent mus; Derfor kan immunmikromiljøet analyseres i forhold til tumorvækst eller som reaktion på immunterapi. Tumorvækst er aggressiv og invasiv, i modsætning til mange cellelinie xenograft GBM-modeller, hvor tumoren forbliver indkapslet og ikke udviser de histologiske træk ved human GBM13,15,16. Når det udføres korrekt, resulterer proceduren beskrevet her i pålidelig tumorvækst uden cellelækage eller ekstrakraniel spredning.
Endelig, selvom denne protokol er optimeret i forbindelse med GBM som en ortopisk musemodel, kan dens nøjagtighed og pålidelige anvendelse i præklinisk oversættelse tilpasses modeller af andre hjernetumorunderklasser. Metoder og reagenser i denne protokol kan anvendes til forskellige celletypeimplantater, der bærer mutationer til hjernetumormodellen af interesse (f.eks. diffust midterliniegliom17) med justering af stereotaksiske koordinater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Alan E. Kulaga for fremragende teknisk assistance og fru Michelle L. Gumprecht for at forfine de kirurgiske teknikker. Vi takker Dr. Philip L. Martin for patologianalyse og fru Lilia Ileva og Dr. Joseph Kalen fra Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program for MR-scanninger.
Dette projekt er finansieret helt eller delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr. HHSN261201500003I. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis synspunkter eller politikker fra Department of Health and Human Services, og omtalen af handelsnavne, kommercielle produkter eller organisationer indebærer heller ikke godkendelse fra den amerikanske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al.
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G.
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , Exon Publications. (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J.
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
