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Bioengineering

आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 सेल कल्चर एक त्रि-आयामी बाह्य मैट्रिक्स में

Published: November 13, 2023 doi: 10.3791/64507
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Orthopedics, Shanghai Key Laboratory for Prevention and Treatment of Bone and Joint Diseases, Shanghai Institute of Traumatology and Orthopaedics, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक त्रि-आयामी (3 डी) बाह्य मैट्रिक्स में आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

ओस्टियोसाइट्स को नॉनप्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं माना जाता है जो ओस्टियोब्लास्ट से टर्मिनल रूप से विभेदित होती हैं। अस्थि बाह्य मैट्रिक्स (ओस्टियोइड) में एम्बेडेड ओस्टियोब्लास्ट सेलुलर डेंड्राइट बनाने और प्रीओस्टियोसाइट्स में बदलने के लिए पीडीपीएन जीन को व्यक्त करते हैं। बाद में, प्रीओस्टियोसाइट्स मैट्रिक्स खनिज को बढ़ावा देने के लिए डीएमपी 1 जीन को व्यक्त करते हैं और इस तरह परिपक्व ओस्टियोसाइट्स में बदल जाते हैं। इस प्रक्रिया को ओस्टियोसाइटोजेनेसिस कहा जाता है। आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 ओस्टियोसाइटोजेनेसिस के इन विट्रो अध्ययन के लिए एक प्रसिद्ध सेल लाइन है। कई पिछले तरीकों ने कोलेजन I को संवर्धन मैट्रिक्स के मुख्य या एकमात्र घटक के रूप में उपयोग किया है। हालांकि, कोलेजन I के अलावा, ऑस्टियोइड में एक जमीनी पदार्थ भी होता है, जो सेलुलर विकास, आसंजन और प्रवास को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण घटक है। इसके अलावा, मैट्रिक्स पदार्थ पारदर्शी है, जो कोलेजन आई-गठित जेल की पारदर्शिता को बढ़ाता है और इस प्रकार, इमेजिंग तकनीकों के माध्यम से डेंड्राइट गठन की खोज में सहायता करता है। इस प्रकार, यह पेपर आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 अस्तित्व के लिए कोलेजन आई के साथ एक बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग करके 3 डी जेल स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण देता है। इस काम में, ऑस्टियोसाइटोजेनेसिस के दौरान डेंड्राइट गठन और जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था। ओस्टोजेनिक कल्चर के 7 दिनों के बाद, एक व्यापक डेंड्राइट नेटवर्क स्पष्ट रूप से फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। रियल-टाइम पीसीआर से पता चला कि पीडीपीएन और डीएमपी 1 के एमआरएनए स्तर लगातार 3 सप्ताह तक बढ़े। सप्ताह 4 में, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप ने खनिज कणों से भरे एक अपारदर्शी जेल का खुलासा किया, जो एक्स-रे फ्लोरेसेंस (एक्सआरएफ) परख के अनुरूप था। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि यह कल्चर मैट्रिक्स सफलतापूर्वक ओस्टियोब्लास्ट से परिपक्व ओस्टियोसाइट्स में संक्रमण की सुविधा प्रदान करता है।

Introduction

ओस्टियोसाइट्स ओस्टियोब्लास्ट 1,2 से प्राप्त टर्मिनल विभेदित कोशिकाएं हैं। एक बार ओस्टियोब्लास्ट को ओस्टियोइड द्वारा दफन कर दिया जाता है, तो यह ओस्टियोसाइटोजेनेसिस से गुजरता है और प्रीओस्टियोसाइट्स बनाने के लिए पीडीपीएन जीन को व्यक्त करता है, ओस्टियोइड को खनिज करने के लिए डीएमपी 1 जीन, और हड्डीके ऊतकों में परिपक्व ऑस्टियोसाइट के रूप में कार्य करने के लिए सोस्ट और एफजीएफ 23 जीन। यहां, ओस्टियोसाइटोजेनेसिस प्रक्रिया में डेंड्राइट एक्सटेंशन और मार्कर जीन अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए एक 3 डी संवर्धन प्रणाली पेश की गई है।

आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाएं ट्रांसजेनिक चूहों से प्राप्त एक अमर प्राथमिक सेल लाइन हैं औरविभिन्न मीडिया 4 में सुसंस्कृत होने पर ओस्टियोसाइट भेदभाव के लिए ओस्टियोब्लास्ट का विस्तार या प्रतिकृति कर सकती हैं। एमएलओ-ए 5, एमएलओ-वाई 4, और अन्य सेल लाइनों की तुलना में, कार्यात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, कैल्शियम नमक जमाव करने की क्षमता, और आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं में विभिन्न हार्मोनों की प्रतिक्रियाएं हड्डीके ऊतकों में प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स के समान होने की अधिक संभावना है।

2 डी सिस्टम की तुलना में, 3 डी संवर्धन प्रणाली विवो सेलुलर विकास वातावरण की नकल करने में अधिक सक्षम हैं, जिसमें पोषक तत्व ढाल, कम यांत्रिक कठोरता और आसपास की यांत्रिक सीमा शामिल है (तालिका 1)। 3 डी प्रणाली में ओस्टियोब्लास्टिक कोशिकाओं की खेती के लिए पिछले तरीकों में से अधिकांश ने कोलेजन I को फॉर्मूलेशन 4,5,6 में अद्वितीय घटक के रूप में उपयोग किया, क्योंकि कोलेजन I फाइबर कैल्शियम और फास्फोरस जमाव की साइट के रूप में काम करते हैं। हालांकि, ओस्टियोइड में एक अनिवार्य घटक, बाह्य मैट्रिक्स, में सेलुलर कारकों का एक बड़ा समूह होता है जो सेलुलर विकास, आसंजन और माइग्रेशन 7,8 को बढ़ावा देता है और इमेजिंग अवलोकन के लिए पारदर्शी और सुविधाजनक है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल ओस्टियोसाइटोजेनेसिस अध्ययन के लिए एक माध्यमिक घटक के रूप में मैट्रिगेल (इसके बाद बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के रूप में संदर्भित) का उपयोग करता है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल 24-वेल प्लेटों के चार कुओं में कोशिकाओं के संवर्धन के लिए उपयुक्त है। यदि कई नमूने या प्लेटें तैयार कर रहे हैं, तो अभिकर्मकों की मात्रा तदनुसार बढ़ाई जानी चाहिए।

1. कोलेजन I मिश्रण की तैयारी

नोट: कोलेजन I और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स जेल कमरे के तापमान पर जल्दी से। इसलिए, कोलेजन को बर्फ (2 डिग्री सेल्सियस से 8 डिग्री सेल्सियस) पर संभाला जाना चाहिए। उपयोग की जाने वाली सभी युक्तियों और ट्यूबों को तब तक ठंडा किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए। सभी प्रक्रियाओं को एक सुरक्षा हुड में किया जाना चाहिए।

  1. सभी अभिकर्मकों और सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
  2. धीरे-धीरे कोलेजन I (5 मिलीग्राम / एमएल) के 0.48 एमएल और 10 x न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) (फिनोल लाल के साथ) के 0.1 एमएल को बर्फ पर रखी बाँझ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें। धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
  3. फिनोल लाल संकेतक के रंग पैलेट के अनुसार, फिनोल लाल संकेतक को नारंगी में समायोजित करने के लिए 7.5% (डब्ल्यू / वी) एनएएचसीओ3 (लगभग 0.2 एमएल) की उचित मात्रा का उपयोग करें, जो इंगित करता है कि पीएच मान 7.0-7.4 की सीमा में है।
    नोट: माध्यम के पीएच के आधार पर, पीएच को लगभग 7.0-7.4 तक लाने के लिए NaHCO3 की मात्रा का उपयोग किया जाता है। इसके अतिरिक्त, एनएओएच का उपयोग पीएच न्यूट्रलाइजेशन के लिए किया जाता है।
  4. डीडीएच2ओ की उचित मात्रा जोड़कर मिश्रण की अंतिम मात्रा को 1 एमएल तक लाएं। उपयोग के लिए तैयार करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
    नोट: डीडीएच2ओ की अंतिम मात्रा चरण 1.3 में उपयोग किए गए NaHCO3 या NaOH की मात्रा पर निर्भर करेगी।

2. सेल-मैट्रिक्स मिश्रण की तैयारी

  1. धीरे-धीरे बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 0.9 एमएल को बर्फ पर एक नए 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बदल दें।
  2. आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं को टी 25 फ्लास्क में 4 एमएल पूर्ण माध्यम (अल्फा-एमईएम जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस]) होता है) के साथ 33 डिग्री सेल्सियस पर 50 यू / एमएल आईएनएफ -γ के साथ पूरक किया जाता है।
  3. एक बार जब आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाएं 90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो माध्यम को हटा दें, और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस, पीएच 7.4 पूरे प्रोटोकॉल में) के साथ पिपेट के साथ धो लें। 30 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को पचाएं।
  4. पूर्ण माध्यम के 3.5 एमएल (अल्फा-एमईएम जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] होता है) जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें। 4 एमएल सेल सस्पेंशन को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. सेल निलंबन को 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और बर्फ पर पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और पूर्ण माध्यम के साथ अंतिम सेल घनत्व को 4 × 105 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें। चरण 2.1 से बाह्य मैट्रिक्स के 0.9 एमएल में तैयार सेल निलंबन के 0.1 एमएल जोड़ें। धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
    नोट: यदि सेल-मुक्त नियंत्रण की आवश्यकता है, तो नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बाह्य मैट्रिक्स के 0.9 एमएल में पूर्ण माध्यम के 0.1 एमएल जोड़ें।

3. सेल-जेल मिश्रण को चढ़ाना

  1. धीरे से, बर्फ पर ऊपर और नीचे पाइप करके चरण 2.6 और चरण 1.4 से 2 एमएल से दो मिश्रणों को अच्छी तरह मिलाएं। प्रत्येक कुएं में अंतिम मिश्रण का 0.5 मिलीलीटर पिपेट (24-वेल प्लेट के चार कुएं)। सेल-जेल मिश्रण बनाने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर ओस्टोजेनिक भेदभाव शुरू करने के लिए प्रत्येक कुएं में सेल-जेल मिश्रण में 0.5 एमएल ओस्टोजेनिक माध्यम (पूर्ण माध्यम जिसमें 50 μg / mL एस्कॉर्बिक एसिड और 4 mM β-ग्लिसरोफॉस्फेट होता है, जिसे ओस्टोजेनिक प्रेरण माध्यम भी कहा जाता है) जोड़ें । इसे दिन 0 के रूप में देखें।
  3. हर 2 दिनों में, आधे माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए ताजा ओस्टोजेनिक माध्यम से बदलें। 35 दिनों के लिए खेती जारी रखें।

4. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता और सेलुलर डेंड्राइट की पहचान करना

  1. सेल धुंधला होना
    नोट: कैल्सीन एसिटोक्सीमिथाइल एस्टर (कैल्सीन एएम) एक सेल-परमीन डाई है जिसका उपयोग सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। एथिडियम होमोडीमर-1 (ईटीएचडी -1) बरकरार/ व्यवहार्य कोशिकाओं की झिल्ली को पार नहीं करताहै। इस प्रकार, सेल व्यवहार्यता और सेलुलर डेंड्राइट की पहचान करने के लिए कैल्सीन एएम / ईटीएचडी -1 का उपयोग किया जा सकता है।
    1. संस्कृति के दिन 1 और दिन 7 पर, कैल्केन एएम स्टॉक समाधान (डीएमएसओ में 4 एमएम) और ईटीएचडी -1 स्टॉक समाधान (डीएमएसओ / एच 2 ओ 1: 4 [वी / वी में2एमएम) को फ्रीजर से हटा दें, और उन्हें कमरे के तापमान पर गर्म होने दें।
      नोट: खनिज मैट्रिक्स में एक मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल होता है, इसलिए 4 की खेती के 7 दिनों के भीतर डीएमपी 1 अभिव्यक्ति के बिना प्रीओस्टियोसाइट चरण सेल धुंधला होने के अवलोकन के लिए अधिकउपयुक्त है।
    2. 2 mM EthD-1 स्टॉक समाधान के 4 μL और 4 mM कैल्सीन AM स्टॉक समाधान के 5 μL को 2 मिलीलीटर डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड खारा (D-PBS) में जोड़ें, और अच्छी तरह मिलाएं। यह काम करने के समाधान के रूप में लगभग 2 μM कैल्सीन AM और 4 μM EthD-1 देता है।
    3. 24-वेल प्लेट में कुओं में काम करने वाले घोल का पिपेट 0.5 एमएल। सेल-जेल मैट्रिक्स को दागने के लिए कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. इनक्यूबेशन के बाद, एक नए 35 मिमी ग्लास-बॉटम कल्चर डिश में लगभग 0.5 एमएल ताजा डी-पीबीएस जोड़ें। नमूनों के संदूषण या सूखने को रोकने के लिए पकवान को कवर करें।
    5. कोहनी से ढके हुए बल का उपयोग करके, चरण 4.1.3 से दाग वाले सेल-जेल मैट्रिक्स को चरण 4.1.4 से 35 मिमी कल्चर डिश में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। सेल-जेल मैट्रिक्स को नुकसान पहुंचाने या कतरने से बचें।
    6. एक लेजर कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत लेबल की गई कोशिकाओं को देखें।
  2. माइक्रोस्कोप स्कैनिंग सेट
    1. मंच पर 35 मिमी पकवान रखें। 10x उद्देश्य का उपयोग करके आईपीस के माध्यम से स्कैन किए जाने वाले सेल-जेल मैट्रिक्स के क्षेत्रों का चयन करें। विस्तारित डेंड्राइट के आकार के कारण उच्च-आवर्धन उद्देश्यों की सिफारिश नहीं की जाती है।
    2. ऑप्टिकल फ़िल्टर का चयन करें। कैल्सीन को एक मानक फ्लोरेसिन बैंडपास फिल्टर के साथ हरे रंग के रूप में देखा जा सकता है, और ईटीएचडी -1 को प्रोपिडियम आयोडाइड या टेक्सास रेड डाई के लिए फिल्टर के साथ लाल के रूप में देखा जा सकता है। स्कैनिंग के लिए "लाइन मोड" का चयन करें और "पिनहोल" को 2 μm पर सेट करें।
    3. 8 बिट डेटा गहराई की डेटा गहराई और 1,024 पिक्सेल x 1,024 पिक्सेल के छवि रिज़ॉल्यूशन का चयन करें।
    4. इष्टतम लेजर और डिटेक्टर सेटिंग्स के साथ अनुक्रमिक लाइन स्कैनिंग का उपयोग करके छवि (संभावित फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए न्यूनतम लेजर ऊर्जा रखें)।
      नोट: इष्टतम डिटेक्टर सेटिंग अंतिम प्रतिदीप्ति संकेतों पर निर्भर करती है।
  3. छवियों का "जेड-स्टैक" एकत्र करना
    1. ग्रीन चैनल सिग्नल के अनुसार, लगातार स्कैनिंग करते समय नमूने के माध्यम से ध्यान केंद्रित करके स्कैन किए जाने वाले सेल-जेल मैट्रिक्स के शीर्ष और निचले पदों को परिभाषित करें।
    2. एक बार नमूना के शीर्ष और निचले भाग को निर्दिष्ट करने के बाद, वांछित स्कैनिंग फ्रेम का चयन करें। स्कैन करना शुरू करें। नमूना चरण 4.2 से चयनित सेटिंग्स के साथ ऊपर से नीचे तक स्कैन किया जाएगा, जिससे छवियों की गैलरी उत्पन्न होगी।
  4. सेल व्यवहार्यता पहचान।
    1. चरण 4.3 से एक टुकड़ा चुनें। हरे और लाल चैनल क्रमशः जीवित और मृत कोशिकाओं को इंगित करते हैं।
  5. सेल डेंड्राइट पहचान।
    1. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए एकल हरे चैनल का चयन करें। गहराई की जानकारी इंद्रधनुष छद्म रंग छवियों की एक श्रृंखला के रूप में प्रदर्शित की जाती है। जेल के निचले भाग में स्थित डेंड्राइट लाल रंग में प्रदर्शित होते हैं, जबकि शीर्ष पर नीले रंग में प्रदर्शित होते हैं।

5. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके उपस्थिति की पहचान करना

  1. संस्कृति के दिन 1, दिन 7, दिन 21, और दिन 35 पर, संवर्धन माध्यम को हटा दें, और प्लेट में जैल को डी-पीबीएस के साथ दो बार धो लें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए प्लेट में सेल-जेल मैट्रिक्स को ठीक करने के लिए डी-पीबीएस में 4% (वी / वी) पैराफॉर्मलडिहाइड के 0.5 एमएल को अच्छी तरह से जोड़ें।
  2. अच्छी तरह से पैराफॉर्मलडिहाइड निकालें और प्लेट में डी-पीबीएस के साथ सेल-जेल मैट्रिक्स को दो बार और धोएं। इमेजिंग के लिए प्रत्येक कुएं में 0.5 एमएल डी-पीबीएस छोड़ दें।
  3. प्लेट को मंच पर रखें और 0.5x उद्देश्य का उपयोग करके आईपीस के माध्यम से इष्टतम स्थिति का चयन करें। उज्ज्वल क्षेत्र के तहत "स्वचालित एक्सपोजर" का उपयोग करके व्यक्तिगत रूप से प्लेट में सेल-जेल मैट्रिक्स के पूर्ण-क्षेत्र दृश्य की छवि बनाएं।

6. एक्सआरएफ परख के साथ खनिज जमाव की पहचान करना

  1. संस्कृति के 35 वें दिन, जांचें कि तरल नाइट्रोजन पर्याप्त है या नहीं। XRF सिस्टम प्रारंभ करें। नमूना कक्ष खोलें और कोहनी से भरे बल के साथ जैल को प्लेट से उपकरण के नमूना चरण के मध्य में स्थानांतरित करें। नमूना कक्ष बंद करें और उपयोग से पहले उपकरण को ठंडा करने के लिए 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  2. अधिग्रहण सेटअप के लिए "एक्सपोज़र टाइम" को 35 एमएस, "स्पेक्ट्रम रेंज" को 0-40 केवी और "इलेक्ट्रिक करंट" को 770 μA पर सेट करें।
  3. नमूना चरण को स्थानांतरित करके विश्लेषण के लिए तीन से पांच स्कैनिंग साइटें चुनें।
  4. पता लगाने के लिए तत्वों (Ca और P) का चयन करें। डिटेक्शन प्रारंभ करें और परिणाम निर्यात करें.
    नोट: हाइड्रॉक्सीपैटाइट में सीए और पी सबसे प्रचुर तत्व हैं।

7. कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति की पहचान करना

  1. संस्कृति के दिन 1, दिन 7, दिन 21, दिन 28, और दिन 35 पर, संवर्धन माध्यम को हटा दें और प्लेट में बर्फ-ठंडे डी-पीबीएस के साथ सेल-जेल मैट्रिक्स को दो बार धो लें।
  2. कोहनी से टिंप वाले जैल को प्लेट से 2.0 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें (कल्चर टाइम के अनुसार, सेल-जेल मैट्रिक्स धीरे-धीरे 35 वें दिन लगभग 0.1 एमएल तक सिकुड़ जाएगा)। सुनिश्चित करें कि एक जेल एक ट्यूब में रखा गया है। प्रत्येक ट्यूब में फिनोल-क्लोरोफॉर्म के 1 एमएल और दो बाँझ स्टेनलेस-स्टील बीटिंग बीड्स (4 मिमी, लाइसिंग मैट्रिक्स के रूप में) जोड़ें। ट्यूबों को यांत्रिक बीटिंग होमोजिनाइज़र के प्रीचिल्ड सैंपल स्लॉट में सममित रूप से रखें।
  3. बीटिंग को 55 हर्ट्ज की आवृत्ति और 10 सेकंड के ठहराव के साथ यांत्रिक धड़कन के प्रत्येक 1 मिनट में 1 सेमी के आयाम पर सेट करें, जिसमें कुल छह चक्र हों। मोती-पिटाई शुरू करें।
  4. फिनोल-क्लोरोफॉर्म-आइसोएमाइलकोहोल विधि का उपयोग करके सेल-जेल मैट्रिक्स से कुल आरएनए निकालें। यादृच्छिक हेक्सामर प्राइमरों के साथ कुल आरएनए के 2 μg को सीडीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्राइब करें।
  5. वास्तविक समय पीसीआर (तालिका 2) के लिए β-एक्टिन, पीडीपीएन, डीएमपी 1, सोस्ट और एफजीएफ 23 को लक्षित करने वाले प्राइमरों को डिजाइन करें। β-एक्टिन सामान्यीकरण के लिए उपयोग किया जाने वाला हाउसकीपिंग जीन है। पीडीपीएन10 और डीएमपी 111 जीन मुख्य रूप से पूर्व-ओस्टियोसाइट्स और खनिज युक्त ओस्टियोसाइट्स में व्यक्त किए जाते हैं, जबकि सोस्ट12 और एफजीएफ 2313 मुख्य रूप से परिपक्व ओस्टियोसाइट्स में व्यक्त किए जाते हैं।
  6. ट्यूब को गर्म ढक्कन सेट के साथ एक थर्मोसाइक्लर पर 105 डिग्री सेल्सियस पर रखें और निम्नलिखित पीसीआर साइक्लिंग सेटिंग्स का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन करें: 5 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 35 चक्रों के लिए 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण चरण और 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार चरण। त्रिभुज विधि के साथ फोल्ड परिवर्तनों का विश्लेषण करें।

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Representative Results

मृत कोशिका धुंधला होने के बाद, कोशिकाओं को एक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की गई थी। सभी कोशिकाएं कैल्केन एएम-पॉजिटिव (हरा रंग) थीं, और क्षेत्र में लगभग कोई ईटीएचडी -1-पॉजिटिव कोशिकाएं (लाल रंग) नहीं थीं, यह दर्शाता है कि इस विधि द्वारा बनाई गई जेल प्रणाली ओस्टियोसाइटोजेनेसिस (चित्रा 1 ए, बाएं) के लिए अत्यधिक उपयुक्त है। कोशिकाओं के स्थानिक वितरण को बेहतर ढंग से निर्धारित करने के लिए, जेल की विभिन्न गहराई पर सेल डेंड्राइट प्रदर्शित करने के लिए एक छद्म रंग छवि चुनी गई थी; लाल जेल के निचले भाग में डेंड्राइट दिखाता है, और नीला शीर्ष पर डेंड्राइट दिखाता है। परिणामों ने संकेत दिया कि आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाएं इस सेल-जेल मैट्रिक्स में अच्छी तरह से बढ़ीं, और सेलुलर डेंड्राइट धीरे-धीरे दिन 7 पर ओस्टोजेनिक माध्यम में एक नेटवर्क में विस्तारित हुए (चित्रा 1 ए, दाएं और चित्रा 1 बी)।

एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, जेल मैट्रिक्स की पारदर्शिता में गिरावट जारी रही जब तक कि यह सेल-फ्री जेल मैट्रिक्स (चित्रा 2 ए) के विपरीत, 35 वें दिन अपारदर्शी नहीं हो गया। दिन 35 पर अपारदर्शी जेल के एक्सआरएफ स्पेक्ट्रम ने संकेत दिया कि जेल पूरी तरह से कैल्शियम और फास्फोरस जमा से भरा था (चित्रा 2 बी)।

संस्कृति के दिन 1, दिन 7, दिन 21, दिन 28, और दिन 35 पर, कई मार्कर जीन की अभिव्यक्ति का वास्तविक समय पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया था। परिणामों से पता चला कि पीडीपीएन और डीएमपी 1 के एमआरएनए स्तर लगातार दिन 1 से 21 वें दिन तक बढ़े, जबकि पीडीपीएन का एमआरएनए स्तर 21 वें दिन के बाद कम हो गया (चित्रा 3)। एफजीएफ 23 और सोस्ट के एमआरएनए स्तर सभी चरणों के दौरान लगातार बढ़े (चित्रा 3)।

Figure 1
चित्रा 1: आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 का सेलुलर डेंड्राइट नेटवर्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की गई । (ए) जेल में व्यापक डेंड्राइट नेटवर्क के आंशिक क्षेत्र की प्रतिनिधि छवियां। हरा रंग जीवित कोशिकाओं और विस्तारित सेलुलर डेंड्राइट नेटवर्क को इंगित करता है। (बी) ए में छवि का छद्म रंग (दाएं, दिन 7)। लाल (नीला) रंग जेल के नीचे (शीर्ष) पर स्थित डेंड्राइट को इंगित करता है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ओस्टोजेनिक संवर्धन के बाद आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं का खनिज जमाव । (ए) संकेतित समय पर 24-वेल प्लेट में (ऊपर) और बिना (नीचे) कोशिकाओं के साथ जेल की प्रतिनिधि पूर्ण-क्षेत्र छवियां, जैसा कि स्टीरियोमाइक्रोस्कोप द्वारा कल्पना की गई है। (बी) एक्सआरएफ परख द्वारा विश्लेषण के अनुसार 35 वें दिन सेल-जेल मैट्रिक्स में कैल्शियम और फास्फोरस सामग्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओस्टोजेनिक संवर्धन के बाद आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं की कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति। आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं में कार्यात्मक जीन में परिवर्तन संकेतित समय पर एक ओस्टोजेनिक माध्यम के साथ संवर्धित होता है। संक्षेप: डी = दिन; W = सप्ताह। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में दर्शाया जाता है। फोल्ड परिवर्तनों का विश्लेषण सीटी विधि के साथ किया गया था, जो β-एक्टिन जीन का उल्लेख करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2D .3D
तैयारी में कठिनाई सरल मध्यम
पोषक तत्वों की प्रवणता अनुपस्थित उपस्थित
कोलेजन की व्यवस्था मोनोलेयर बहुअक्षीय असतत
ईसीएम की यांत्रिकी कठोरता उच्च नीचा
ईसीएम की यांत्रिक रेंज एकपक्षीय घेरना
कोशिका गतिशीलता; समतल सतह उचित
अंतरकोशिकीय संचार अपर्याप्त पर्याप्त

तालिका 1: आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं के लिए 2 डी और 3 डी संस्कृति प्रणालियों के बीच तुलना।

नाम अनुक्रम (5'-3')
Pdpn-for GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG
PDPN-rev GGTTGTACTCTCTCTCTCTCT
Dmp1-for CCCAGTTGCCAGATACCAC
Dmp1-rev CACTATTTGCCTGTCCCTG
Sost-for ACAACCAGACCATGAACCG
Sost-rev CAGGAAGGGGTGGTGGTG
Fgf23 के लिए GGTGATAACAGGAGCCATGAC
Fgf23-rev TGCTTCTGCGACAAGTAGAC
β-एक्टिन-फॉर ACCTTCTACAATGAGCTGCG
β-एक्टिन-रेव CTGGATGGCTACGTACATGG

तालिका 2: वास्तविक समय पीसीआर परख में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि सहज जमावट को रोकने के लिए चरण 1 और चरण 2 को बर्फ पर किया जाना चाहिए। इस विधि में, कोलेजन I की अंतिम एकाग्रता 1.2 मिलीग्राम / इस प्रकार, विभिन्न निर्माताओं से विभिन्न कोलेजन से मेल खाने के लिए एक इष्टतम डीडीएच2ओ वॉल्यूम की गणना की जानी चाहिए।

विवो में, ओस्टियोसाइटोजेनेसिस में सतह से त्रिकोणीय हड्डीके इंटीरियर तक ओस्टियोब्लास्ट का एक ध्रुवीय आंदोलन शामिल है। यह प्रोटोकॉल दिशात्मक ध्रुवीयता के बिना मैट्रिक्स में कोशिकाओं को विकास से मुक्त करता है। बेशक, सेल-मुक्त जेल मैट्रिक्स सतह पर आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं को सीडिंग वैकल्पिक है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में प्रदान की गई कोलेजन एकाग्रता ओस्टियोब्लास्ट घुसपैठ के लिए सैद्धांतिक रूप से सपाट सतह बनाने के लिए पर्याप्त नहीं है। इस उद्देश्य के लिए कोलेजन I और बाह्य मैट्रिक्स के विभिन्न अनुपातों का परीक्षण किया जाना चाहिए।

ओस्टियोइड की तुलना में, इस जेल की कठोरता पर्याप्त नहीं है। कुछ लेख विवो 6,15 में ऑस्टियोइड की कठोरता की बेहतर नकल करने के लिए कई रासायनिक सामग्रियों को जोड़कर जैल की ताकत बढ़ाने की रिपोर्ट करते हैं। इस विधि का लाभ यह है कि गठित जेल हिस्टोलॉजिकल विधियों15 का उपयोग करने के बजाय सीटू में इमेजिंग और ट्रेसिंग कोशिकाओं के लिए अच्छी पारदर्शिता के साथ एक माध्यम प्रदान कर सकता है। फिर भी, इमेजिंग के लिए सामग्री की पारदर्शिता को संतुष्ट करना मुश्किल है, जबकि यह भी सुनिश्चित करना है कि इन विट्रो भौतिक और रासायनिक गुण ऑस्टियोइड की नकल कर सकते हैं। इसलिए, किसी भी विशिष्ट वैज्ञानिक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए अधिक संस्कृति मॉडल का पता लगाने की आवश्यकता है।

इसके अतिरिक्त, इस आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 खनिज जेल के भौतिक रासायनिक गुण, जिसमें रियोलॉजिकल गुण शामिल हैं, को पिछले अध्ययन16 में पेश किया गया था। इस प्रकार, इस विधि द्वारा गठित यह बायोजेनिक खनिज जेल भविष्य के आर्थोपेडिक्स अनुसंधान के लिए बायोमेडिकल सामग्री के रूप में उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 सेल लाइन उपहार में देने के लिए डॉ लिंडा एफ बोनवाल्ड को धन्यवाद देते हैं। इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82070902, 82100935 और 81700778) और शंघाई "विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार" नौकायन परियोजना (21वाईएफ 1442000) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid Hyclone SH30042.01
15 mL tubes Corning, NY, USA 430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, MO, USA S8761
ascorbic acid Sigma-Aldrich, MO, USA A4544
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10099141
homogenizer BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China SKSI
laser confocal fluorescence microscopy Carl Zeiss, Oberkochen, Germany LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit Thermo Fisher Scientific R37601
Matrigel matrix Corning, NY, USA 356234
MEM (10X), no glutamine Thermo Fisher Scientific 21430079
paraformaldehyde Sigma-Aldrich, MO, USA 158127
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.FS
stereo microscope Carl Zeiss, Oberkochen, Germany Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596026
X-ray fluorescence EDAX, USA EAGLE III
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich, MO, USA G9422

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 201 आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 ओस्टियोसाइटोजेनेसिस बाह्य मैट्रिक्स त्रि-आयामी
आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 सेल कल्चर एक त्रि-आयामी बाह्य मैट्रिक्स में
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Chen, K., Chen, H., Deng, L., Yang, K., Qi, J. IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (201), e64507, doi:10.3791/64507 (2023).

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