Summary

Клеточная культура IDG-SW3 в трехмерном внеклеточном матриксе

Published: November 13, 2023
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол культивирования клеток IDG-SW3 в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе.

Abstract

Остеоциты считаются непролиферативными клетками, которые терминально дифференцируются от остеобластов. Остеобласты, встроенные в костный внеклеточный матрикс (остеоид), экспрессируют ген Pdpn с образованием клеточных дендритов и превращением в преостеоциты. Позже преостеоциты экспрессируют ген Dmp1 , способствуя минерализации матрикса и, таким образом, превращаясь в зрелые остеоциты. Этот процесс называется остеоцитогенезом. IDG-SW3 — хорошо известная клеточная линия для исследований остеоцитогенеза in vitro . Во многих предыдущих методах коллаген I использовался в качестве основного или единственного компонента культивируемого матрикса. Однако, помимо коллагена I, остеоид также содержит основное вещество, которое является важным компонентом, способствующим клеточному росту, адгезии и миграции. Кроме того, матричное вещество прозрачно, что повышает прозрачность коллагенового геля I-образного типа и, таким образом, помогает исследовать образование дендритов с помощью методов визуализации. Таким образом, в данной работе подробно описан протокол создания 3D-геля с использованием внеклеточного матрикса вместе с коллагеном I для выживания IDG-SW3. В данной работе были проанализированы дендритообразование и экспрессия генов в процессе остеоцитогенеза. Через 7 дней остеогенного культивирования под флуоресцентным конфокальным микроскопом отчетливо наблюдалась обширная дендритная сеть. ПЦР в реальном времени показала, что уровни мРНК Pdpn и Dmp1 непрерывно повышались в течение 3 недель. На 4-й неделе стереомикроскоп показал непрозрачный гель, заполненный минеральными частицами, что соответствовало рентгенофлуоресцентному анализу (XRF). Эти результаты свидетельствуют о том, что данный культуральный матрикс успешно способствует переходу от остеобластов к зрелым остеоцитам.

Introduction

Остеоциты представляют собой терминально дифференцированные клетки, полученные из остеобластов 1,2. После того, как остеобласт погребен остеоидом, он подвергается остеоцитогенезу и экспрессирует ген Pdpn для образования преостеоцитов, ген Dmp1 для минерализации остеоида и гены Sost и Fgf23 для функционирования в качестве зрелого остеоцита в костной ткани3. Здесь используется система 3D-культивирования для выявления удлинения дендритов и экспрессии генов-маркеров в процессе остеоцитогенеза.

Клетки IDG-SW3 представляют собой иммортализированную первичную клеточную линию, полученную от трансгенных мышей, и могут расширяться или реплицировать остеобласт до поздней дифференцировки остеоцитов при культивировании в различных средах4. По сравнению с MLO-A5, MLO-Y4 и другими клеточными линиями, профиль экспрессии функциональных белков, способность выполнять отложение солей кальция и реакция на различные гормоны в клетках IDG-SW3 с большей вероятностью будут такими же, как у первичных остеоцитов в костной ткани4.

По сравнению с 2D-системами, 3D-системы культивирования более способны имитировать среду клеточного роста in vivo, включая градиент питательных веществ, низкую механическую жесткость и окружающий механический диапазон (Таблица 1). Большинство предыдущих методов культивирования остеобластических клеток в 3D-системе использовали коллаген I в качестве уникального компонента в рецептурах 4,5,6, поскольку волокна коллагена I служат местом отложения кальция и фосфора. Тем не менее, незаменимый компонент остеоида, внеклеточный матрикс, содержит большую группу клеточных факторов, которые способствуют клеточному росту, адгезии и миграции 7,8 и является прозрачным и удобным для визуализирующего наблюдения. Таким образом, в этом протоколе используется Matrigel (далее именуемый матрицей базальной мембраны) в качестве вторичного компонента для исследования остеоцитогенеза.

Protocol

Этот протокол подходит для культивирования клеток в четырех лунках 24-луночных планшетов. При подготовке нескольких образцов или планшетов количество реагентов должно быть соответственно увеличено. 1. Приготовление коллагеновой смеси I ПРИМЕЧАНИ?…

Representative Results

После окрашивания живых/мертвых клеток клетки визуализировали с помощью конфокального лазерного микроскопа. Все клетки были кальцеин-AM-положительными (зеленый цвет), а EthD-1-положительных клеток (красный цвет) в полевых условиях почти отсутствовали, что указывает на то, что гелевая сист?…

Discussion

Критическим моментом в этом протоколе является то, что шаги 1 и шаг 2 должны выполняться на льду, чтобы предотвратить спонтанную коагуляцию. В этом методе конечная концентрация коллагена I составила 1,2 мг/мл. Таким образом, оптимальный объемddH2Oдолжен быть рассчитан в соответствии с …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-ра Линду Ф. Боневальд за предоставленную клеточную линию IDG-SW3. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82070902, 82100935 и 81700778) и Шанхайским парусным проектом «Научно-технические инновации» (21YF1442000).

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid Hyclone SH30042.01
15 mL tubes Corning, NY, USA 430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, MO, USA S8761
ascorbic acid Sigma-Aldrich, MO, USA A4544
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10099141
homogenizer BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China SKSI
laser confocal fluorescence microscopy Carl Zeiss, Oberkochen, Germany LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit Thermo Fisher Scientific R37601
Matrigel matrix Corning, NY, USA 356234
MEM (10X), no glutamine Thermo Fisher Scientific 21430079
paraformaldehyde Sigma-Aldrich, MO, USA 158127
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.FS
stereo microscope Carl Zeiss, Oberkochen, Germany Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596026
X-ray fluorescence EDAX, USA EAGLE III
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich, MO, USA G9422

References

  1. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  2. Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell … and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
  3. Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
  4. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  5. Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
  6. Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
  7. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
  8. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  9. Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
  10. Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
  11. Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
  12. Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
  13. Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
  14. Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
  15. Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
  16. Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).

Play Video

Cite This Article
Chen, K., Chen, H., Deng, L., Yang, K., Qi, J. IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (201), e64507, doi:10.3791/64507 (2023).

View Video