Здесь мы представляем протокол культивирования клеток IDG-SW3 в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе.
Остеоциты считаются непролиферативными клетками, которые терминально дифференцируются от остеобластов. Остеобласты, встроенные в костный внеклеточный матрикс (остеоид), экспрессируют ген Pdpn с образованием клеточных дендритов и превращением в преостеоциты. Позже преостеоциты экспрессируют ген Dmp1 , способствуя минерализации матрикса и, таким образом, превращаясь в зрелые остеоциты. Этот процесс называется остеоцитогенезом. IDG-SW3 — хорошо известная клеточная линия для исследований остеоцитогенеза in vitro . Во многих предыдущих методах коллаген I использовался в качестве основного или единственного компонента культивируемого матрикса. Однако, помимо коллагена I, остеоид также содержит основное вещество, которое является важным компонентом, способствующим клеточному росту, адгезии и миграции. Кроме того, матричное вещество прозрачно, что повышает прозрачность коллагенового геля I-образного типа и, таким образом, помогает исследовать образование дендритов с помощью методов визуализации. Таким образом, в данной работе подробно описан протокол создания 3D-геля с использованием внеклеточного матрикса вместе с коллагеном I для выживания IDG-SW3. В данной работе были проанализированы дендритообразование и экспрессия генов в процессе остеоцитогенеза. Через 7 дней остеогенного культивирования под флуоресцентным конфокальным микроскопом отчетливо наблюдалась обширная дендритная сеть. ПЦР в реальном времени показала, что уровни мРНК Pdpn и Dmp1 непрерывно повышались в течение 3 недель. На 4-й неделе стереомикроскоп показал непрозрачный гель, заполненный минеральными частицами, что соответствовало рентгенофлуоресцентному анализу (XRF). Эти результаты свидетельствуют о том, что данный культуральный матрикс успешно способствует переходу от остеобластов к зрелым остеоцитам.
Остеоциты представляют собой терминально дифференцированные клетки, полученные из остеобластов 1,2. После того, как остеобласт погребен остеоидом, он подвергается остеоцитогенезу и экспрессирует ген Pdpn для образования преостеоцитов, ген Dmp1 для минерализации остеоида и гены Sost и Fgf23 для функционирования в качестве зрелого остеоцита в костной ткани3. Здесь используется система 3D-культивирования для выявления удлинения дендритов и экспрессии генов-маркеров в процессе остеоцитогенеза.
Клетки IDG-SW3 представляют собой иммортализированную первичную клеточную линию, полученную от трансгенных мышей, и могут расширяться или реплицировать остеобласт до поздней дифференцировки остеоцитов при культивировании в различных средах4. По сравнению с MLO-A5, MLO-Y4 и другими клеточными линиями, профиль экспрессии функциональных белков, способность выполнять отложение солей кальция и реакция на различные гормоны в клетках IDG-SW3 с большей вероятностью будут такими же, как у первичных остеоцитов в костной ткани4.
По сравнению с 2D-системами, 3D-системы культивирования более способны имитировать среду клеточного роста in vivo, включая градиент питательных веществ, низкую механическую жесткость и окружающий механический диапазон (Таблица 1). Большинство предыдущих методов культивирования остеобластических клеток в 3D-системе использовали коллаген I в качестве уникального компонента в рецептурах 4,5,6, поскольку волокна коллагена I служат местом отложения кальция и фосфора. Тем не менее, незаменимый компонент остеоида, внеклеточный матрикс, содержит большую группу клеточных факторов, которые способствуют клеточному росту, адгезии и миграции 7,8 и является прозрачным и удобным для визуализирующего наблюдения. Таким образом, в этом протоколе используется Matrigel (далее именуемый матрицей базальной мембраны) в качестве вторичного компонента для исследования остеоцитогенеза.
Критическим моментом в этом протоколе является то, что шаги 1 и шаг 2 должны выполняться на льду, чтобы предотвратить спонтанную коагуляцию. В этом методе конечная концентрация коллагена I составила 1,2 мг/мл. Таким образом, оптимальный объемddH2Oдолжен быть рассчитан в соответствии с …
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-ра Линду Ф. Боневальд за предоставленную клеточную линию IDG-SW3. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82070902, 82100935 и 81700778) и Шанхайским парусным проектом «Научно-технические инновации» (21YF1442000).
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |