Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لزراعة خلايا IDG-SW3 في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الخلية.
Abstract
تعتبر الخلايا العظمية خلايا غير تكاثرية متمايزة بشكل نهائي عن بانيات العظم. تعبر بانيات العظم المضمنة في المصفوفة العظمية خارج الخلية (العظمية) عن جين Pdpn لتكوين الزوائد الشجيرية الخلوية والتحول إلى خلايا ما قبل العظم. في وقت لاحق ، تعبر الخلايا العظمية السابقة عن جين Dmp1 لتعزيز تمعدن المصفوفة وبالتالي تتحول إلى خلايا عظمية ناضجة. وتسمى هذه العملية تكوين الخلايا العظمية. IDG-SW3 هو خط خلايا معروف للدراسات في المختبر لتكوين الخلايا العظمية. استخدمت العديد من الطرق السابقة الكولاجين I باعتباره المكون الرئيسي أو الوحيد لمصفوفة الاستزراع. ومع ذلك ، بالإضافة إلى الكولاجين الأول ، يحتوي العظم العظمي أيضا على مادة أرضية ، وهي عنصر مهم في تعزيز نمو الخلايا والالتصاق والهجرة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مادة المصفوفة شفافة ، مما يزيد من شفافية هلام الكولاجين I ، وبالتالي يساعد في استكشاف تكوين التغصنات من خلال تقنيات التصوير. وبالتالي ، فإن هذه الورقة تفصل بروتوكولا لإنشاء هلام ثلاثي الأبعاد باستخدام مصفوفة خارج الخلية جنبا إلى جنب مع الكولاجين I لبقاء IDG-SW3. في هذا العمل ، تم تحليل تكوين التغصنات والتعبير الجيني أثناء تكوين الخلايا العظمية. بعد 7 أيام من الثقافة العظمية ، لوحظت شبكة تغصنات واسعة النطاق بوضوح تحت مجهر متحد البؤر مضان. أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أن مستويات mRNA من Pdpn و Dmp1 زادت باستمرار لمدة 3 أسابيع. في الأسبوع 4 ، كشف المجهر المجسم عن هلام معتم مليء بالجزيئات المعدنية ، بما يتفق مع مقايسة مضان الأشعة السينية (XRF). تشير هذه النتائج إلى أن مصفوفة الثقافة هذه تسهل بنجاح الانتقال من بانيات العظم إلى الخلايا العظمية الناضجة.
Introduction
الخلايا العظمية هي خلايا متمايزة بشكل نهائي مشتقة من بانيات العظم 1,2. بمجرد دفن بانيات العظم بواسطة العظم العظمي ، فإنه يخضع لتكوين الخلايا العظمية ويعبر عن جين Pdpn لتشكيل الخلايا العظمية ، وجين Dmp1لتمعدن العظم ، وجينات Sost و Fgf23 لتعمل كخلية عظمية ناضجة في أنسجة العظام3. هنا ، يتم تقديم نظام زراعة 3D لتحديد امتداد التغصنات والتعبير الجيني علامة في عملية تكوين الخلايا العظمية.
خلايا IDG-SW3 هي خط خلايا أولي خالد مشتق من الفئران المعدلة وراثيا ويمكنها توسيع أو تكرار بانيات العظم إلى تمايز الخلايا العظمية المتأخرة عند زراعتها في وسائط مختلفة4. بالمقارنة مع MLO-A5 و MLO-Y4 وخطوط الخلايا الأخرى ، من المرجح أن يكون ملف تعريف التعبير للبروتينات الوظيفية ، والقدرة على أداء ترسب ملح الكالسيوم ، والاستجابات للهرمونات المختلفة في خلايا IDG-SW3 هي نفسها تلك الموجودة في الخلايا العظمية الأولية في الأنسجة العظمية4.
بالمقارنة مع أنظمة 2D ، فإن أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد أكثر قدرة على محاكاة بيئة النمو الخلوي في الجسم الحي ، بما في ذلك تدرج المغذيات ، والصلابة الميكانيكية المنخفضة ، والنطاق الميكانيكي المحيط (الجدول 1). استخدمت معظم الطرق السابقة لزراعة الخلايا العظمية في نظام ثلاثي الأبعاد الكولاجين I كمكون فريد في التركيبات4،5،6 ، لأن ألياف الكولاجين I تعمل كموقع لترسب الكالسيوم والفوسفور. ومع ذلك ، فإن المكون الذي لا غنى عنه في العظم ، المصفوفة خارج الخلية ، يحتوي على مجموعة كبيرة من العوامل الخلوية التي تعزز النمو الخلوي والالتصاق والهجرة 7,8 وهو شفاف ومناسب لمراقبة التصوير. وبالتالي ، يستخدم هذا البروتوكول Matrigel (المشار إليه فيما يلي باسم مصفوفة الغشاء القاعدي) كمكون ثانوي لدراسة تكوين الخلايا العظمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول مناسب لزراعة الخلايا في أربعة آبار من 24 صفيحة. في حالة تحضير عينات أو ألواح متعددة ، يجب زيادة كميات الكواشف وفقا لذلك.
1. تحضير خليط الكولاجين الأول
ملاحظة: الكولاجين I وهلام مصفوفة الغشاء القاعدي بسرعة في درجة حرارة الغرفة. لذلك ، يجب التعامل مع الكولاجين على الثلج (2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية). يجب تبريد جميع الأطراف والأنابيب المستخدمة ما لم يذكر خلاف ذلك. يجب تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء أمان.
- ضع جميع الكواشف وأنابيب الطرد المركزي على الجليد.
- ماصة ببطء 0.48 مل من الكولاجين I (5 مجم / مل) و 0.1 مل من 10x الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) (مع الفينول الأحمر) في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل يتم الاحتفاظ به على الجليد. تخلط جيدا عن طريق سحب اللأعلى ولأسفل برفق.
- وفقا للوحة ألوان مؤشر الفينول الأحمر ، استخدم حجما مناسبا بنسبة 7.5٪ (وزن / حجم) NaHCO3 (حوالي 0.2 مل) لضبط مؤشر الفينول الأحمر إلى اللون البرتقالي ، مما يشير إلى أن قيمة الأس الهيدروجيني في حدود 7.0-7.4.
ملاحظة: اعتمادا على الرقم الهيدروجيني للوسط ، يتم استخدام حجم NaHCO3 لرفع الرقم الهيدروجيني إلى حوالي 7.0-7.4. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام NaOH لتحييد الأس الهيدروجيني. - ارفع الحجم النهائي للخليط إلى 1 مل عن طريق إضافة حجم مناسب من ddH2O. امزج جيدا عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل للتحضير للاستخدام.
ملاحظة: يعتمد الحجم النهائي ل ddH2O على كمية NaHCO 3 أو NaOH المستخدمة في الخطوة1.3 .
2. تحضير خليط مصفوفة الخلية
- ماصة ببطء 0.9 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل على الجليد.
- استزرع خلايا IDG-SW3 في دورق T25 مع 4 مل من الوسط الكامل (alpha-MEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني [FBS]) مع 50 وحدة / مل INF-γ عند 33 درجة مئوية.
- بمجرد أن تصل خلايا IDG-SW3 إلى التقاء 90٪ ، قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4 طوال البروتوكول) باستخدام ماصة. هضم الخلايا مع 0.5 مل من 0.25٪ حمض التربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
- قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 3.5 مل من الوسط الكامل (alpha-MEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني [FBS]). انقل تعليق الخلية 4 مل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
- قم بتدوير معلق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من الوسط الكامل على الثلج.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم واضبط كثافة الخلية النهائية باستخدام الوسط الكامل إلى 4 × 105 خلايا / مل. أضف 0.1 mL من معلق الخلية المحضر إلى 0.9 mL من المصفوفة خارج الخلية من الخطوة 2.1. تخلط جيدا عن طريق سحب بلطف لأعلى ولأسفل.
ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى عنصر تحكم خال من الخلايا ، أضف 0.1 مل من الوسط الكامل إلى 0.9 مل من المصفوفة خارج الخلية كعنصر تحكم سلبي.
3. تصفيح خليط هلام الخلية
- اخلطي الخليطين جيدا من الخطوة 2.6 والخطوة 1.4 إلى 2 مل عن طريق سحب الثلج لأعلى ولأسفل. ماصة 0.5 مل من الخليط النهائي في كل بئر (أربعة آبار من صفيحة 24 بئر). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتشكيل خليط هلام الخلية.
- أضف 0.5 مل من الوسط العظمي المنشأ (وسط كامل يحتوي على 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك و 4 مللي مول β-glycerophosphate ، المعروف أيضا باسم وسط الحث العظمي)4 إلى خليط هلام الخلية في كل بئر لبدء التمايز العظمي عند 37 درجة مئوية. اعتبر هذا اليوم 0.
- كل 2 يوم، استبدل نصف الوسط بوسط عظمي جديد يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية. استمر في الزراعة لمدة 35 يوما.
4. تحديد صلاحية الخلية والتشعبات الخلوية باستخدام مجهر متحد البؤر
- تلطيخ الخلايا
ملاحظة: Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) عبارة عن صبغة ذات خلايا يمكن استخدامها لتحديد صلاحية الخلية. Ethidium homodimer-I (EthD-1) لا يعبر غشاء الخلايا السليمة / القابلة للحياة9. وبالتالي ، يمكن استخدام الكالسيين AM / EthD-1 لتحديد صلاحية الخلية والتشعبات الخلوية.- في اليوم الأول واليوم 7 من المزرعة ، قم بإزالة محلول مخزون calcein AM (4 mM في DMSO) ومحلول مخزون EthD-1 (2 mM في DMSO / H2O 1: 4 [v / v]) من الفريزر ، واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: تحتوي المصفوفة المعدنية على إشارة تألق ذاتي قوية ، وبالتالي فإن مرحلة الخلايا قبل العظمية بدون تعبير Dmp1 في غضون 7 أيام من الزراعة4 تكون أكثر ملاءمة لمراقبة تلطيخ الخلايا. - أضف 4 ميكرولتر من محلول مخزون EthD-1 2 mM و 5 ميكرولتر من محلول مخزون 4 mM Calcein AM إلى 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (D-PBS) ، واخلطه جيدا. هذا يعطي ما يقرب من 2 ميكرومتر كالسيين AM و 4 ميكرومتر EthD-1 كحلول عمل.
- ماصة 0.5 مل من محلول العمل في الآبار في لوحة 24 بئرا. احتضان لمدة 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ مصفوفة هلام الخلية.
- بعد الحضانة ، أضف ما يقرب من 0.5 مل من D-PBS الطازج إلى طبق استزراع جديد بقاع زجاجي مقاس 35 مم. قم بتغطية الطبق لمنع تلوث العينات أو تجفيفها.
- باستخدام ملقط ذو رأس الكوع ، انقل بعناية مصفوفة هلام الخلية الملطخة من الخطوة 4.1.3 إلى طبق الاستزراع 35 مم من الخطوة 4.1.4. تجنب إتلاف أو قص مصفوفة هلام الخلية.
- عرض الخلايا المسمى تحت المجهر الفلوري متحد البؤر بالليزر.
- في اليوم الأول واليوم 7 من المزرعة ، قم بإزالة محلول مخزون calcein AM (4 mM في DMSO) ومحلول مخزون EthD-1 (2 mM في DMSO / H2O 1: 4 [v / v]) من الفريزر ، واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة.
- مجموعة المسح المجهري
- ضع طبق 35 مم على المسرح. حدد مناطق مصفوفة هلام الخلية المراد مسحها ضوئيا من خلال العدسة باستخدام هدف 10x. لا يوصى بأهداف التكبير العالي بسبب حجم التشعبات الممتدة.
- حدد المرشحات البصرية. يمكن النظر إلى Calcein على أنه أخضر مع مرشح تمرير نطاق فلوريسئين قياسي ، ويمكن رؤية EthD-1 باللون الأحمر مع مرشحات ليوديد البروبيديوم أو صبغة تكساس الحمراء. حدد "وضع الخط" للمسح واضبط "الثقب" على 2 ميكرومتر.
- حدد عمق بيانات يبلغ 8 بت ودقة وضوح صورة تبلغ 1024 بكسل × 1024 بكسل.
- الصورة باستخدام المسح الضوئي الخطي المتسلسل مع إعدادات الليزر والكاشف المثلى (احتفظ بأقل قدر من طاقة الليزر لتجنب التبييض الضوئي المحتمل).
ملاحظة: يعتمد الإعداد الأمثل للكاشف على إشارات التألق النهائية.
- جمع "z-stack" من الصور
- وفقا لإشارة القناة الخضراء ، حدد المواضع العلوية والسفلية لمصفوفة هلام الخلية المراد مسحها ضوئيا من خلال التركيز عبر العينة أثناء المسح المستمر.
- بمجرد تحديد الجزء العلوي والسفلي من العينة ، حدد إطار المسح المطلوب. ابدأ المسح. سيتم مسح العينة ضوئيا من أعلى إلى أسفل باستخدام الإعدادات المحددة من الخطوة 4.2 ، مما يؤدي إلى إنشاء معرض للصور.
- تحديد صلاحية الخلية.
- حدد شريحة واحدة من الخطوة 4.3. تشير القنوات الخضراء والحمراء إلى الخلايا الحية والميتة ، على التوالي.
- تحديد الزوائد الشجيرية الخلوية.
- حدد القناة الخضراء الواحدة لإنشاء عمليات إعادة بناء 3D باستخدام برنامج الحصول على الصور. يتم عرض معلومات العمق كسلسلة من صور الألوان الزائفة لقوس قزح. يتم عرض الزوائد الشجيرية الموجودة في الجزء السفلي من الجل باللون الأحمر ، بينما يتم عرض تلك الموجودة في الجزء العلوي باللون الأزرق.
5. تحديد المظهر باستخدام المجهر المجسم
- في اليوم 1 واليوم 7 واليوم 21 واليوم 35 من الثقافة ، قم بإزالة وسط الاستزراع ، واغسل المواد الهلامية في الطبق مرتين باستخدام D-PBS. أضف 0.5 مل من 4٪ (v / v) بارافورمالدهيد في D-PBS إلى البئر لإصلاح مصفوفة هلام الخلية في اللوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة paraformaldehyde في البئر وغسل مصفوفة هلام الخلية مرتين أخريين باستخدام D-PBS في اللوحة. اترك 0.5 مل من D-PBS في كل بئر للتصوير.
- ضع اللوحة على المسرح وحدد الموضع الأمثل من خلال العدسة باستخدام هدف 0.5x. تخيل عرض المجال الكامل لمصفوفة هلام الخلية في اللوحة بشكل فردي باستخدام "التعرض التلقائي" أسفل الحقل الساطع.
6. تحديد ترسب المعادن باستخدام مقايسة XRF
- في اليوم 35 من الثقافة ، تحقق مما إذا كان النيتروجين السائل كافيا. بدء تشغيل نظام XRF. افتح غرفة العينة وانقل المواد الهلامية بالملقط ذي رأس الكوع من اللوحة إلى منتصف مرحلة العينة للأداة. أغلق غرفة العينة وانتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للأداة بالتبريد قبل الاستخدام.
- اضبط "وقت التعرض" على 35 مللي ثانية ، و "نطاق الطيف" على 0-40 كيلو فولت ، و "التيار الكهربائي" على 770 ميكروأمبير لإعداد الاستحواذ.
- اختر ثلاثة إلى خمسة مواقع مسح للتحليل عن طريق تحريك مرحلة العينة.
- حدد العناصر (Ca و P) للكشف. ابدأ الكشف وتصدير النتائج.
ملاحظة: الكالسيوم و P هما العنصران الأكثر وفرة في هيدروكسيباتيت.
7. تحديد التعبير الجيني الوظيفي
- في اليوم 1 واليوم 7 واليوم 21 واليوم 28 واليوم 35 من الثقافة ، قم بإزالة وسط الزراعة وغسل مصفوفة هلام الخلية مرتين باستخدام D-PBS البارد في اللوحة.
- انقل المواد الهلامية باستخدام ملقط برأس الكوع من اللوحة إلى أنبوب سعة 2.0 مل (وفقا لوقت المزرعة ، ستتقلص مصفوفة هلام الخلية تدريجيا إلى حوالي 0.1 مل في اليوم 35). تأكد من وضع هلام واحد في أنبوب واحد. أضف 1 مل من الفينول كلوروفورم واثنين من حبات الضرب المعقمة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ (4 مم ، كمصفوفة تحليل) في كل أنبوب. ضع الأنابيب بشكل متماثل في فتحة العينة المبردة مسبقا لمجاهد الضرب الميكانيكي.
- اضبط الضرب على تردد 55 هرتز وسعة 1 سم في كل دقيقة واحدة من الضرب الميكانيكي مع توقف مؤقت لمدة 10 ثوان ، مع ست دورات في المجموع. ابدأ الضرب بالخرزة.
- استخرج الحمض النووي الريبي الكلي من مصفوفة هلام الخلية باستخدام طريقة الفينول - الكلوروفورم - إيزاميلاتشوهول. نسخ عكسي 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام بادئات سداسية عشوائية.
- تصميم الاشعال التي تستهدف β-actin و Pdpn و Dmp1 و Sost و Fgf23 لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (الجدول 2). β-Actin هو جين التدبير المنزلي المستخدم للتطبيع. يتم التعبير عن جينات Pdpn10 و Dmp1 11 بشكل أساسي في الخلايا العظمية السابقة والخلايا العظمية المعدنية ، في حين يتم التعبير عن Sost12 و Fgf23 13 بشكل أساسي في الخلايا العظمية الناضجة.
- ضع الأنبوب على جهاز تدوير حراري مع ضبط الغطاء المسخن على 105 درجة مئوية وقم بإجراء تضخيم PCR باستخدام إعدادات دورة PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لمدة 35 دورة مع خطوة تمسخ أولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وخطوة تمديد نهائية عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تحليل تغييرات الطي باستخدام طريقة ΔΔCt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد تلطيخ الخلايا الحية / الميتة ، تم تصور الخلايا باستخدام مجهر ليزر متحد البؤر. كانت جميع الخلايا إيجابية للكالسيين AM (اللون الأخضر) ، ولم تكن هناك تقريبا خلايا إيجابية EthD-1 (اللون الأحمر) في الحقل ، مما يشير إلى أن نظام الهلام المصنوع بهذه الطريقة مناسب للغاية لتكوين الخلايا العظمية (الشكل 1 أ ، يسار). لتحديد التوزيع المكاني للخلايا بشكل أفضل ، تم اختيار صورة زائفة اللون لعرض التشعبات الخلوية على أعماق مختلفة من الهلام. يظهر اللون الأحمر الزوائد الشجيرية في الجزء السفلي من الهلام، ويظهر اللون الأزرق الزوائد الشجيرية في الأعلى. أشارت النتائج إلى أن خلايا IDG-SW3 نمت بشكل جيد في مصفوفة هلام الخلية هذه ، وامتدت التشعبات الخلوية تدريجيا إلى شبكة في الوسط العظمي في اليوم 7 (الشكل 1 أ ، على اليمين ، والشكل 1 ب).
تحت المجهر المجسم ، استمرت شفافية مصفوفة الهلام في الانخفاض حتى أصبحت معتمة في اليوم 35 ، على عكس مصفوفة الهلام الخالية من الخلايا (الشكل 2 أ). أشار طيف XRF للهلام غير الشفاف في اليوم 35 إلى أن الجل كان ممتلئا بالكامل برواسب الكالسيوم والفوسفور (الشكل 2 ب).
في اليوم 1 واليوم 7 واليوم 21 واليوم 28 واليوم 35 من الثقافة ، تم تحليل التعبير عن العديد من جينات العلامات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. أظهرت النتائج أن مستويات mRNA ل Pdpn و Dmp1 زادت باستمرار من اليوم الأول حتى اليوم 21 ، بينما انخفض مستوى mRNA ل Pdpn بعد اليوم 21 (الشكل 3). زادت مستويات mRNA ل Fgf23 و Sost باستمرار خلال جميع المراحل (الشكل 3).
الشكل 1: شبكة الزوائد الشجيرية الخلوية ل IDG-SW3 المرئية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر . (أ) صور تمثيلية لمنطقة جزئية من شبكة الزوائد الشجيرية الواسعة في الهلام. يشير اللون الأخضر إلى الخلايا الحية وشبكة التشعبات الخلوية الموسعة. (ب) اللون الزائف للصورة في A (يمين، اليوم 7). يشير اللون الأحمر (الأزرق) إلى التشعبات الموجودة في الجزء السفلي (العلوي) من الجل. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الترسب المعدني لخلايا IDG-SW3 بعد الزراعة العظمية . (أ) صور تمثيلية كاملة المجال للهلام مع خلايا (أعلى) وبدون خلايا (أسفلية) في صفيحة من 24 بئرا في الأوقات المشار إليها ، كما هو موضح بواسطة مجهر مجسم. (ب) محتوى الكالسيوم والفوسفور في مصفوفة هلام الخلية في اليوم 35 ، كما تم تحليله بواسطة اختبار XRF. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التعبير الجيني الوظيفي لخلايا IDG-SW3 بعد زراعة العظم . التغييرات في الجينات الوظيفية في خلايا IDG-SW3 المزروعة بوسط عظمي في الأوقات المحددة. الاختصارات: D = اليوم ؛ W = أسبوع. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SEM. تم تحليل تغييرات الطيات باستخدام طريقة Ct ، في إشارة إلى جين β-actin . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 2D | .3D | |
| صعوبة التحضير | سهل | متوسط |
| تدرج المغذيات | غائب | قدم |
| ترتيب الكولاجين | أحادي الطبقة | منفصل متعدد المحاور |
| ميكانيكا صلابة ECM | عال | منخفض |
| النطاق الميكانيكي ل ECM | انفرادي | أحاط |
| حركة الخلية | سطح مستو | خال |
| التواصل بين الخلايا | عدم كفايه | كاف |
الجدول 1: مقارنة بين أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد لخلايا IDG-SW3.
| اسماء | التسلسلات (5'- 3') |
| Pdpn-for | GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG |
| Pdpn-rev | GGTTGTACTCTCGTGTTCTCTG |
| Dmp1-for | CCCAGTTGCCAGATACCAC |
| Dmp1-rev | CACTATTTGCCTGTCCCTCTG |
| سوست فور | ACAACCAGACCATGAACCG |
| سوست ريف | CAGGAAGCGGGTAGTG |
| Fgf23-for | GGTGATAACAGGAGCCATGAC |
| Fgf23-rev | TGCTTCTGCGACAAGTAGAC |
| β-أكتين-فور | ACCTTCTACAATGAGCTGCG |
| β-أكتين-ريف | CTGGATGGCTACGTACATGG |
الجدول 2: البادئات المستخدمة في فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النقطة الحرجة في هذا البروتوكول هي أنه يجب تنفيذ الخطوتين 1 و 2 على الجليد لمنع التخثر التلقائي. في هذه الطريقة ، كان التركيز النهائي للكولاجين I 1.2 مجم / مل. وبالتالي ، يجب حساب حجم ddH2O الأمثل لمطابقة الكولاجين المختلفة من مختلف الشركات المصنعة.
في الجسم الحي ، ينطوي تكوين الخلايا العظمية على حركة قطبية لبانيات العظم من السطح إلى داخل العظم التربيقي14. يحرر هذا البروتوكول الخلايا من النمو في المصفوفة بدون قطبية اتجاهية. بالطبع ، يعد زرع خلايا IDG-SW3 على سطح مصفوفة الهلام الخالية من الخلايا أمرا اختياريا. ومع ذلك ، فإن تركيز الكولاجين المقدم في هذا البروتوكول لا يكفي لتشكيل سطح مستو نظريا لتسلل بانيات العظم. يجب اختبار نسب مختلفة من الكولاجين I والمصفوفة خارج الخلية لهذا الغرض.
بالمقارنة مع عظم العظم ، فإن صلابة هذا الجل بعيدة عن أن تكون كافية. تشير بعض المقالات إلى زيادة قوة المواد الهلامية عن طريق إضافة العديد من المواد الكيميائية لتقليد صلابة العظم بشكل أفضل في الجسم الحي 6,15. فائدة هذه الطريقة هي أن الجل المتكون يمكن أن يوفر وسيطا يتمتع بشفافية جيدة لتصوير وتتبع الخلايا في الموقع بدلا من استخدام الطرق النسيجية15. ومع ذلك ، من الصعب تلبية شفافية المواد للتصوير مع ضمان أن الخصائص الفيزيائية والكيميائية في المختبر يمكن أن تحاكي العظم. لذلك ، يجب استكشاف المزيد من نماذج الثقافة لمعالجة أي أسئلة علمية محددة.
بالإضافة إلى ذلك ، تم تقديم الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذا الجل المعدني IDG-SW3 ، بما في ذلك الخصائص الريولوجية ، في دراسة سابقة16. وبالتالي ، فإن هذا الجل المعدني الحيوي المنشأ الذي تشكله هذه الطريقة يمكن أن يكون مفيدا كمادة طبية حيوية لأبحاث جراحة العظام المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتورة ليندا ف. بونوالد على إهداء خط خلايا IDG-SW3. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82070902 و 82100935 و 81700778) ومشروع شنغهاي للإبحار "ابتكار العلوم والتكنولوجيا" (21YF1442000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
- Bonewald, L. F.
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell ... and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
