Summary
Her præsenterer vi en protokol til dyrkning af IDG-SW3-celler i en tredimensionel (3D) ekstracellulær matrix.
Abstract
Osteocytter anses for at være ikke-proliferative celler, der er terminalt differentieret fra osteoblaster. Osteoblaster indlejret i knogleekstracellulær matrix (osteoid) udtrykker Pdpn-genet til dannelse af cellulære dendritter og omdannes til preosteocytter. Senere udtrykker preosteocytter Dmp1-genet for at fremme matrixmineralisering og derved omdanne til modne osteocytter. Denne proces kaldes osteocytogenese. IDG-SW3 er en velkendt cellelinje til in vitro-undersøgelser af osteocytogenese. Mange tidligere metoder har brugt kollagen I som hoved- eller den eneste komponent i dyrkningsmatrixen. Ud over kollagen I indeholder osteoidet imidlertid også et grundstof, som er en vigtig komponent i at fremme cellulær vækst, vedhæftning og migration. Derudover er matrixsubstansen gennemsigtig, hvilket øger gennemsigtigheden af den kollagen I-formede gel og hjælper således udforskningen af dendritdannelse gennem billeddannelsesteknikker. Således beskriver dette papir en protokol til etablering af en 3D-gel ved hjælp af en ekstracellulær matrix sammen med kollagen I til IDG-SW3-overlevelse. I dette arbejde blev dendritdannelse og genekspression analyseret under osteocytogenese. Efter 7 dages osteogen kultur blev et omfattende dendritnetværk tydeligt observeret under et fluorescenskonfokalmikroskop. PCR i realtid viste, at mRNA-niveauerne af Pdpn og Dmp1 kontinuerligt steg i 3 uger. I uge 4 afslørede stereomikroskopet en uigennemsigtig gel fyldt med mineralpartikler, i overensstemmelse med røntgenfluorescensanalysen (XRF). Disse resultater indikerer, at denne kulturmatrix med succes letter overgangen fra osteoblaster til modne osteocytter.
Introduction
Osteocytter er terminalt differentierede celler afledt af osteoblaster 1,2. Når osteoblasten er begravet af osteoiden, gennemgår den osteocytogenese og udtrykker Pdpn-genet til dannelse af preosteocytter, Dmp1-genettil mineralisering af osteoiden og Sost- og Fgf23-generne til at fungere som en moden osteocyt i knoglevæv3. Her introduceres et 3D-dyrkningssystem til at identificere dendritforlængelse og markørgenekspression i osteocytogeneseprocessen.
IDG-SW3-celler er en udødeliggjort primær cellelinje afledt af transgene mus og kan udvide eller replikere osteoblast til sen osteocytdifferentiering, når de dyrkes i forskellige medier4. Sammenlignet med MLO-A5, MLO-Y4 og andre cellelinjer er ekspressionsprofilen for funktionelle proteiner, evnen til at udføre calciumsaltaflejring og reaktionerne på forskellige hormoner i IDG-SW3-celler mere tilbøjelige til at være de samme som for primære osteocytter i knoglevævet4.
Sammenlignet med 2D-systemer er 3D-dyrkningssystemer mere i stand til at efterligne in vivo-cellulært vækstmiljø, herunder næringsgradienten, lav mekanisk stivhed og omgivende mekanisk rækkevidde (tabel 1). De fleste af de tidligere metoder til dyrkning af osteoblastiske celler i et 3D-system brugte kollagen I som den unikke komponent i formulering 4,5,6, fordi kollagen I-fibre tjener som stedet for calcium- og fosforaflejring. Imidlertid indeholder en uundværlig bestanddel i osteoiden, den ekstracellulære matrix, en stor gruppe cellulære faktorer, der fremmer cellulær vækst, vedhæftning og migration 7,8 og er gennemsigtig og praktisk til billeddannelsesobservation. Denne protokol anvender således Matrigel (i det følgende benævnt kældermembranmatrix) som en sekundær komponent til osteocytogeneseundersøgelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er egnet til dyrkning af celler i fire brønde med 24-brøndplader. Ved tilberedning af flere prøver eller plader bør mængden af reagenser øges tilsvarende.
1. Fremstilling af kollagen I-blandingen
BEMÆRK: Kollagen I og kældermembranmatrixgel hurtigt ved stuetemperatur. Derfor bør kollagen håndteres på is (2 °C til 8 °C). Alle anvendte spidser og rør skal forkøles, medmindre andet er angivet. Alle procedurer skal udføres i en sikkerhedshætte.
- Alle reagenser og centrifugeglas anbringes på is.
- Langsomt pipetteres 0,48 ml kollagen I (5 mg/ml) og 0,1 ml minimum essentielt medium (MEM) (med phenolrødt) ind i et sterilt 15 ml centrifugerør, der holdes på is. Bland godt ved at pipettere forsigtigt op og ned.
- I henhold til farvepaletten på den phenolrøde indikator skal du bruge et passende volumen på 7,5% (w / v) NaHCO3 (ca. 0,2 ml) til at justere den phenolrøde indikator til orange, hvilket indikerer, at pH-værdien ligger i området 7,0-7,4.
BEMÆRK: Afhængigt af mediets pH anvendes et volumen NaHCO3 til at bringe pH-værdien til ca. 7,0-7,4. Derudover anvendes NaOH til pH-neutralisering. - Det endelige volumen af blandingen bringes op på 1 ml ved tilsætning af en passende mængde ddH2O. Bland godt ved at pipettere forsigtigt op og ned for at forberede brug.
BEMÆRK: Det endelige volumen af ddH2O afhænger af mængden af NaHCO 3 eller NaOH, der anvendes i trin1.3 .
2. Fremstilling af cellematrixblandingen
- Pipette langsomt 0,9 ml kældermembranmatrix ind i et nyt 15 ml centrifugerør på isen.
- IDG-SW3-cellerne dyrkes i en T25-kolbe med 4 ml komplet substrat (alfa-MEM indeholdende 10 % føtalt bovint serum [FBS]) suppleret med 50 E/ml INF-γ ved 33 °C.
- Når IDG-SW3-cellerne når 90% sammenløb, fjernes mediet, og cellerne vaskes med fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4 i hele protokollen) med en pipette. Fordøje cellerne med 0,5 ml 0,25% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) ved 37 °C i 30 s.
- Inaktiver trypsin ved at tilføje 3,5 ml komplet medium (alfa-MEM indeholdende 10% føtalt bovint serum [FBS]). Overfør 4 ml cellesuspensionen til et 15 ml centrifugeglas.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml af hele substratet på is.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, og juster den endelige celletæthed med det komplette medium til 4 × 105 celler / ml. Der tilsættes 0,1 ml af den fremstillede cellesuspension til 0,9 ml af den ekstracellulære matrix fra trin 2.1. Bland godt ved at pipettere forsigtigt op og ned.
BEMÆRK: Hvis der er behov for en cellefri kontrol, tilsættes 0,1 ml af det komplette medium til 0,9 ml ekstracellulær matrix som en negativ kontrol.
3. Plating af celle-gel-blandingen
- Bland forsigtigt de to blandinger godt fra trin 2.6 og trin 1.4 til 2 ml ved pipettering op og ned på isen. Der pipetteres 0,5 ml af den endelige blanding i hvert hul (fire brønde i en plade med 24 brønde). Der inkuberes ved 37 °C i 1 time for at danne en celle-gel-blanding.
- Der tilsættes 0,5 ml osteogent medium (komplet medium indeholdende 50 μg/ml ascorbinsyre og 4 mM β-glycerophosphat, også kendt som osteogent induktionsmedium)4 til celle-gel-blandingen i hvert hul for at starte den osteogene differentiering ved 37 °C. Betragt dette som dag 0.
- Hver 2. dag udskiftes halvdelen af substratet med frisk osteogent medium, der holdes ved 37 °C. Fortsæt dyrkningen i 35 dage.
4. Identifikation af cellelevedygtighed og cellulære dendritter ved hjælp af et konfokalmikroskop
- Cellefarvning
BEMÆRK: Calcein acetoxymethylester (calcein AM) er et cellepermeaneret farvestof, der kan bruges til at bestemme cellelevedygtighed. Ethidium homodimer-I (EthD-1) krydser ikke membranen i intakte/levedygtige celler9. Således kan calcein AM / EthD-1 bruges til at identificere cellelevedygtighed og cellulære dendritter.- På dag 1 og dag 7 i kulturen fjernes calcein AM-stamopløsningen (4 mM i DMSO) og EthD-1-stamopløsningen (2 mM i DMSO/H2O 1:4 [v/v]) fra fryseren og lader dem varme op til stuetemperatur.
BEMÆRK: Den mineraliserede matrix har et stærkt autofluorescenssignal, så preosteocyttrinnet uden Dmp1-ekspression inden for 7 dage efter dyrkning4 er mere egnet til observation af cellefarvning. - Der tilsættes 4 μL af 2 mM EthD-1-stamopløsningen og 5 μL af 4 mM calcein AM-stamopløsningen til 2 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (D-PBS), og bland godt. Dette giver ca. 2 μM calcein AM og 4 μM EthD-1 som arbejdsløsninger.
- Pipette 0,5 ml af arbejdsløsningen ind i brøndene i 24-brøndpladen. Inkuber i 30-45 minutter ved stuetemperatur for at plette celle-gelmatrixen.
- Efter inkubation tilsættes ca. 0,5 ml frisk D-PBS til en ny 35 mm glasbundet kulturskål. Dæk fadet til for at forhindre kontaminering eller tørring af prøverne.
- Med pincet med albuespids overføres forsigtigt den farvede cellegelmatrix fra trin 4.1.3 til 35 mm kulturskålen fra trin 4.1.4. Undgå at beskadige eller skære celle-gelmatrixen.
- Se de mærkede celler under et laserkonfokal fluorescensmikroskop.
- På dag 1 og dag 7 i kulturen fjernes calcein AM-stamopløsningen (4 mM i DMSO) og EthD-1-stamopløsningen (2 mM i DMSO/H2O 1:4 [v/v]) fra fryseren og lader dem varme op til stuetemperatur.
- Mikroskop scanning sæt
- Placer 35 mm skålen på scenen. Vælg de områder af celle-gelmatrixen, der skal scannes gennem okularet ved hjælp af et 10x mål. Højere forstørrelsesmål anbefales ikke på grund af størrelsen af de udvidede dendritter.
- Vælg de optiske filtre. Calcein kan ses som grøn med et standard fluorescein båndpasfilter, og EthD-1 kan ses som rødt med filtre til propidiumiodid eller Texas Red dye. Vælg "linjetilstand" til scanning, og indstil "pinhole" til 2 μm.
- Vælg en datadybde på 8 bit datadybde og en billedopløsning på 1.024 pixel x 1.024 pixel.
- Billede ved hjælp af sekventiel linjescanning med de optimale laser- og detektorindstillinger (hold en minimal laserenergi for at undgå potentiel fotoblegning).
BEMÆRK: Den optimale detektorindstilling afhænger af de endelige fluorescenssignaler.
- Indsamling af en "z-stack" af billeder
- I henhold til det grønne kanalsignal skal du definere de øverste og nederste positioner af celle-gelmatrixen, der skal scannes, ved at fokusere gennem prøven, mens du kontinuerligt scanner, .
- Når toppen og bunden af prøven er angivet, skal du vælge den ønskede scanningsramme. Start scanningen. Eksemplet scannes fra top til bund med de valgte indstillinger fra trin 4.2 og genererer et galleri med billeder.
- Identifikation af cellelevedygtighed.
- Vælg ét udsnit fra trin 4.3. De grønne og røde kanaler angiver henholdsvis levende og døde celler.
- Identifikation af celledendrit.
- Vælg den enkelte grønne kanal for at generere 3D-rekonstruktioner med billedoptagelsessoftwaren. Dybdeoplysningerne vises som en række regnbuepseudofarvebilleder. Dendritterne placeret i bunden af gelen vises i rødt, mens de øverst vises i blåt.
5. Identifikation af udseende ved hjælp af et stereomikroskop
- På dag 1, dag 7, dag 21 og dag 35 i kulturen fjernes dyrkningsmediet, og gelerne vaskes to gange med D-PBS. Tilsæt 0,5 ml 4% (v/v) paraformaldehyd i D-PBS til brønden for at fastgøre cellegelmatrixen i pladen i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern paraformaldehydet i brønden og vask cellegelmatrixen to gange mere med D-PBS i pladen. Efterlad 0,5 ml D-PBS i hvert hul til billeddannelse.
- Placer pladen på scenen, og vælg den optimale position gennem okularet ved hjælp af et 0,5x mål. Forestil dig fuldfeltvisningen af cellegelmatrixen i pladen individuelt ved hjælp af "automatisk eksponering" under det lyse felt.
6. Identifikation af mineralaflejring med et XRF-assay
- På dag 35 i kulturen skal du kontrollere, om det flydende nitrogen er tilstrækkeligt. Start XRF-systemet. Åbn prøverummet, og overfør gelerne med pincet med albuespids fra pladen til midten af instrumentets prøvetrin. Luk prøverummet, og vent i 30 minutter for at lade instrumentet køle af før brug.
- Indstil "Eksponeringstid" til 35 ms, "Spektrumområde" til 0-40 keV og "Elektrisk strøm" til 770 μA til anskaffelsesopsætning.
- Vælg tre til fem scanningssteder til analyse ved at flytte prøvefasen.
- Vælg elementerne (Ca og P) til registrering. Start registreringen, og eksportér resultaterne.
BEMÆRK: Ca og P er de mest rigelige elementer i hydroxyapatit.
7. Identifikation af funktionel genekspression
- På dag 1, dag 7, dag 21, dag 28 og dag 35 i kulturen fjernes dyrkningsmediet, og cellegelmatrixen vaskes to gange med iskold D-PBS i pladen.
- Overfør gelerne med albuespids tang fra pladen til et 2,0 ml rør (i henhold til dyrkningstiden vil celle-gelmatrixen gradvist krympe til ca. 0,1 ml på dag 35). Sørg for, at en gel er placeret i et rør. Der tilsættes 1 ml phenolchloroform og to sterile slagperler af rustfrit stål (4 mm som lyseringsmatrix) i hvert rør. Rørene anbringes symmetrisk i den forkølede prøveåbning på den mekaniske bankhomogenisator.
- Indstil slagene til en frekvens på 55 Hz og en amplitude på 1 cm i hver 1 minuts mekanisk slag med en pause på 10 s med seks cyklusser i alt. Start perleslagningen.
- Ekstrakter det samlede RNA fra cellegelmatrixen ved anvendelse af phenol-chloroform-isoamylachohol-metoden. Omvendt transskribere 2 μg total RNA til cDNA med tilfældige hexamerprimere.
- Design primere rettet mod β-actin, Pdpn, Dmp1, Sost og Fgf23 til PCR i realtid (tabel 2). β-Actin er husholdningsgenet, der anvendes til normalisering. Pdpn10 og Dmp1 11 generne udtrykkes hovedsageligt i præ-osteocytter og mineraliserede osteocytter, mens Sost12 og Fgf23 13 hovedsageligt udtrykkes i modne osteocytter.
- Anbring røret på en termocyklist med det opvarmede låg indstillet til 105 °C, og udfør PCR-forstærkning ved hjælp af følgende PCR-cykelindstillinger: 95 °C i 5 s og 60 °C i 30 s i 35 cyklusser med et indledende denatureringstrin ved 95 °C i 5 minutter og et sidste forlængelsestrin ved 60 °C i 30 s. Analyser foldændringerne med ΔΔCt-metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter levende / døde cellefarvning blev cellerne visualiseret ved hjælp af et konfokal lasermikroskop. Alle cellerne var calcein AM-positive (grøn farve), og der var næsten ingen EthD-1-positive celler (rød farve) i marken, hvilket indikerer, at gelsystemet fremstillet ved denne metode er yderst velegnet til osteocytogenese (figur 1A, venstre). For bedre at bestemme cellernes rumlige fordeling blev der valgt et pseudofarvebillede til at vise celledendritterne på forskellige dybder af gelen; Rød viser dendritterne i bunden af gelen, og blå viser dendritterne øverst. Resultaterne viste, at IDG-SW3-cellerne voksede godt i denne cellegelmatrix, og de cellulære dendritter udvidede sig gradvist til et netværk i det osteogene medium på dag 7 (figur 1A, højre og figur 1B).
Under et stereomikroskop fortsatte gelmatrixens gennemsigtighed med at falde, indtil den blev uigennemsigtig på dag 35, i modsætning til den cellefrie gelmatrix (figur 2A). XRF-spektret for den uigennemsigtige gel på dag 35 indikerede, at gelen var fuldstændigt fyldt med calcium- og fosforaflejringer (figur 2B).
På dag 1, dag 7, dag 21, dag 28 og dag 35 i kulturen blev ekspressionen af flere markørgener analyseret ved PCR i realtid. Resultaterne viste, at mRNA-niveauerne af Pdpn og Dmp1 konstant steg fra dag 1 til dag 21, mens mRNA-niveauet af Pdpn faldt efter dag 21 (figur 3). MRNA-niveauerne af Fgf23 og Sost steg kontinuerligt i alle faser (figur 3).
Figur 1: Det cellulære dendritnetværk af IDG-SW3 visualiseret ved konfokal mikroskopi . (A) Repræsentative billeder af et delvist område af det omfattende dendritnetværk i gelen. Den grønne farve angiver de levende celler og det udvidede cellulære dendritnetværk. (B) Pseudofarve af billedet i A (højre, dag 7). Den røde (blå) farve angiver dendritterne placeret i bunden (øverst) af gelen. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mineralaflejring af IDG-SW3-cellerne efter osteogen dyrkning . (A) Repræsentative fuldfeltsbilleder af gelen med (øverste) og uden (nederste) celler i en plade med 24 brønde på de angivne tidspunkter, visualiseret ved hjælp af et stereomikroskop. (B) Calcium- og fosforindholdet i cellegelmatrixen på dag 35, som analyseret ved XRF-assayet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Den funktionelle genekspression af IDG-SW3-cellerne efter osteogen dyrkning. Ændringer i de funktionelle gener i IDG-SW3-cellerne dyrket med et osteogent medium på de angivne tidspunkter. Forkortelser: D = dag; W = uge. Data er repræsenteret som gennemsnittet ± SEM. Foldændringer blev analyseret med Ct-metoden med henvisning til β-actin-genet . Klik her for at se en større version af denne figur.
| 2D | .3D | |
| Vanskeligheder ved forberedelse | let | Medium |
| Gradient af næringsstof | fraværende | gave |
| Arrangement af kollagen | Monolayer | multiaksial diskret |
| Mekanik stivhed af ECM | høj | lav |
| Mekanisk rækkevidde af ECM | ensidig | omgive |
| Cellemotilitet | flad overflade | fri |
| Intercellulær kommunikation | utilstrækkelig | tilstrækkelig |
Tabel 1: Sammenligning mellem 2D- og 3D-kultursystemer for IDG-SW3-celler.
| Navne | Sekvenser (5'- 3') |
| PDPN-for | GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG |
| PDPN-rev | GGTTGTACTCTCGTGTGTTCTCTG |
| DMP1-til | CCCAGTTGCCAGATACCAC |
| DMP1-omdr./R | CACTATTTGCCTGTCCCTCTG |
| Sost-for | ACAACCAGACCATGAACCG |
| Sost-rev | CAGGAAGCGGGTGTAGTG |
| Fgf23-for | GGTGATAACAGGAGCCATGAC |
| Fgf23-omdr./omdr. | TGCTTCTGCGAAGTAGAC |
| β-Actin-for | ACCTTCTACAATGAGCTGCG |
| β-actin-rev | CTGGATGGCTACGTACATGG |
Tabel 2: Primere anvendt i PCR-analysen i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk punkt i denne protokol er, at trin 1 og trin 2 skal udføres på is for at forhindre spontan koagulation. I denne metode var den endelige koncentration af kollagen I 1,2 mg/ml. Således bør et optimalt ddH2O-volumenberegnes for at matche de forskellige kollagener fra forskellige producenter.
In vivo involverer osteocytogenese en polær bevægelse af osteoblaster fra overfladen til det indre af trabekulær knogle14. Denne protokol frigør celler fra vækst i matrixen uden retningspolaritet. Selvfølgelig er såning af IDG-SW3-celler på den cellefrie gelmatrixoverflade valgfri. Imidlertid er kollagenkoncentrationen tilvejebragt i denne protokol ikke nok til at danne en teoretisk flad overflade til osteoblastinfiltration. Forskellige forhold mellem kollagen I og ekstracellulær matrix bør testes til dette formål.
Sammenlignet med osteoiden er stivheden af denne gel langt fra tilstrækkelig. Nogle artikler rapporterer at øge styrken af geler ved at tilføje flere kemiske materialer for bedre at efterligne stivheden af osteoid in vivo 6,15. Fordelen ved denne metode er, at den dannede gel kan give et medium med god gennemsigtighed til billeddannelse og sporing af celler in situ snarere end at bruge histologiske metoder15. Ikke desto mindre er det vanskeligt at tilfredsstille gennemsigtigheden af materialet til billeddannelse og samtidig sikre, at de fysiske og kemiske in vitro-egenskaber kan efterligne osteoiden. Derfor skal flere kulturmodeller udforskes for at løse specifikke videnskabelige spørgsmål.
Derudover blev de fysisk-kemiske egenskaber af denne IDG-SW3 mineraliserede gel, herunder de rheologiske egenskaber, introduceret i en tidligere undersøgelse16. Således kan denne biogene mineraliserede gel dannet ved denne metode være nyttig som et biomedicinsk materiale til fremtidig ortopædisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Lynda F. Bonewald for at give IDG-SW3-cellelinjen i gave. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82070902, 82100935 og 81700778) og Shanghai "Science and Technology Innovation" Sailing Project (21YF1442000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
- Bonewald, L. F.
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell ... and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
