Summary
Nous présentons ici un protocole de culture de cellules IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle (3D).
Abstract
Les ostéocytes sont considérés comme des cellules non prolifératives qui se différencient de manière terminale des ostéoblastes. Les ostéoblastes intégrés dans la matrice extracellulaire osseuse (ostéoïde) expriment le gène Pdpn pour former des dendrites cellulaires et se transformer en préostéocytes. Plus tard, les préostéocytes expriment le gène Dmp1 pour favoriser la minéralisation de la matrice et ainsi se transformer en ostéocytes matures. Ce processus s’appelle l’ostéocytogenèse. IDG-SW3 est une lignée cellulaire bien connue pour les études in vitro de l’ostéocytogenèse. De nombreuses méthodes précédentes ont utilisé le collagène I comme composant principal ou unique de la matrice de culture. Cependant, en plus du collagène I, l’ostéoïde contient également une substance fondamentale, qui est un élément important pour favoriser la croissance, l’adhésion et la migration cellulaires. De plus, la substance matricielle est transparente, ce qui augmente la transparence du gel de collagène formé en I et, ainsi, facilite l’exploration de la formation de dendrites grâce à des techniques d’imagerie. Ainsi, cet article détaille un protocole pour établir un gel 3D utilisant une matrice extracellulaire avec du collagène I pour la survie d’IDG-SW3. Dans ce travail, la formation des dendrites et l’expression des gènes ont été analysées au cours de l’ostéocytogenèse. Après 7 jours de culture ostéogénique, un vaste réseau de dendrites a été clairement observé au microscope confocal à fluorescence. La PCR en temps réel a montré que les niveaux d’ARNm de Pdpn et Dmp1 ont continuellement augmenté pendant 3 semaines. À la semaine 4, le stéréomicroscope a révélé un gel opaque rempli de particules minérales, ce qui correspond au test de fluorescence X (XRF). Ces résultats indiquent que cette matrice de culture facilite avec succès la transition des ostéoblastes vers les ostéocytes matures.
Introduction
Les ostéocytes sont des cellules différenciées en phase terminale dérivées d’ostéoblastes 1,2. Une fois que l’ostéoblaste est enterré par l’ostéoïde, il subit une ostéocytogenèse et exprime le gène Pdpn pour former des préostéocytes, le gène Dmp1 pour minéraliser l’ostéoïde, et les gènes Sost et Fgf23 pour fonctionner comme un ostéocyte mature dans le tissu osseux3. Ici, un système de culture 3D est introduit pour identifier l’extension de la dendrite et l’expression des gènes marqueurs dans le processus d’ostéocytogenèse.
Les cellules IDG-SW3 sont une lignée cellulaire primaire immortalisée dérivée de souris transgéniques et peuvent étendre ou répliquer l’ostéoblaste à la différenciation tardive des ostéocytes lorsqu’elles sont cultivées dans différents milieux4. Par rapport à MLO-A5, MLO-Y4 et à d’autres lignées cellulaires, le profil d’expression des protéines fonctionnelles, la capacité à effectuer un dépôt de sels de calcium et les réponses à diverses hormones dans les cellules IDG-SW3 sont plus susceptibles d’être les mêmes que celles des ostéocytes primaires dans le tissu osseux4.
Par rapport aux systèmes 2D, les systèmes de culture 3D sont plus capables d’imiter l’environnement de croissance cellulaire in vivo, y compris le gradient de nutriments, la faible rigidité mécanique et la plage mécanique environnante (tableau 1). La plupart des méthodes précédentes de culture de cellules ostéoblastiques dans un système 3D utilisaient le collagène I comme composant unique dans les formulations 4,5,6, car les fibres de collagène I servent de site de dépôt de calcium et de phosphore. Cependant, un constituant indispensable de l’ostéoïde, la matrice extracellulaire, contient un grand groupe de facteurs cellulaires qui favorisent la croissance, l’adhésion et la migration cellulaires 7,8 et est transparent et pratique pour l’observation par imagerie. Ainsi, ce protocole utilise le Matrigel (ci-après dénommé matrice membranaire basale) comme composant secondaire pour l’étude de l’ostéocytogenèse.
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Protocol
Ce protocole est adapté à la culture de cellules dans quatre puits de plaques de 24 puits. Si vous préparez plusieurs échantillons ou plaques, les quantités de réactifs doivent être augmentées en conséquence.
1. Préparation du mélange de collagène I
REMARQUE : Le collagène I et la matrice de la membrane basale se gèrent rapidement à température ambiante. Par conséquent, le collagène doit être manipulé sur de la glace (2 °C à 8 °C). Tous les embouts et tubes utilisés doivent être prérefroidis, sauf indication contraire. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une cagoule de sécurité.
- Placez tous les réactifs et les tubes à centrifuger sur de la glace.
- Pipeter lentement 0,48 mL de collagène I (5 mg/mL) et 0,1 mL de milieu essentiel (MEM) 10x minimum (avec du rouge phénolique) dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL maintenu sur de la glace. Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas.
- Selon la palette de couleurs de l’indicateur rouge phénol, utilisez un volume approprié de 7,5 % (p/v) NaHCO3 (environ 0,2 mL) pour régler l’indicateur rouge phénol à l’orange, ce qui indique que la valeur du pH est comprise entre 7,0 et 7,4.
REMARQUE : Selon le pH du milieu, un volume de NaHCO3 est utilisé pour amener le pH à environ 7,0-7,4. De plus, le NaOH est utilisé pour la neutralisation du pH. - Porter le volume final du mélange à 1 mL en ajoutant un volume approprié de ddH2O. Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas pour préparer l’utilisation.
REMARQUE : Le volume final de ddH2O dépendra de la quantité de NaHCO 3 ou de NaOH utilisée à l’étape1.3 .
2. Préparation du mélange cellule-matrice
- Pipeter lentement 0,9 mL de matrice de membrane basale dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL sur la glace.
- Cultivez les cellules IDG-SW3 dans un flacon T25 avec 4 mL de milieu complet (alpha-MEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal [FBS]) complété par 50 U/mL d’INF-γ à 33 °C.
- Une fois que les cellules IDG-SW3 ont atteint 90 % de confluence, retirez le milieu et lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4 tout au long du protocole) avec une pipette. Digérer les cellules avec 0,5 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % à 37 °C pendant 30 s.
- Inactiver la trypsine en ajoutant 3,5 mL de milieu complet (alpha-MEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal [FBS]). Transférez la suspension cellulaire de 4 mL dans un tube à centrifuger de 15 mL.
- Essorer la suspension cellulaire à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu complet sur glace.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la densité cellulaire finale avec le milieu complet à 4 × 105 cellules/mL. Ajouter 0,1 mL de la suspension cellulaire préparée à 0,9 mL de matrice extracellulaire à partir de l’étape 2.1. Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas.
REMARQUE : Si un témoin acellulaire est nécessaire, ajouter 0,1 mL du milieu complet à 0,9 mL de matrice extracellulaire comme témoin négatif.
3. Placage du mélange cellule-gel
- Délicatement, bien mélanger les deux mélanges de l’étape 2.6 et de l’étape 1.4 à 2 mL en pipetant de haut en bas sur la glace. Pipeter 0,5 mL du mélange final dans chaque puits (quatre puits d’une plaque de 24 puits). Incuber à 37 °C pendant 1 h pour former un mélange cellule-gel.
- Ajouter 0,5 mL de milieu ostéogénique (milieu complet contenant 50 μg/mL d’acide ascorbique et 4 mM de β-glycérophosphate, également connu sous le nom de milieu d’induction ostéogénique)4 au mélange cellule-gel dans chaque puits pour commencer la différenciation ostéogénique à 37 °C. Considérez ceci comme le jour 0.
- Tous les 2 jours, remplacer la moitié du milieu par du milieu ostéogénique frais maintenu à 37 °C. Continuez la culture pendant 35 jours.
4. Identification de la viabilité cellulaire et des dendrites cellulaires à l’aide d’un microscope confocal
- Coloration cellulaire
REMARQUE : L’ester acétoxyméthylique de calcéine (calcéine AM) est un colorant perméable aux cellules qui peut être utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire. L’homodimère d’éthidium-I (EthD-1) ne traverse pas la membrane des cellules intactes/viables9. Ainsi, la calcéine AM/EthD-1 peut être utilisée pour identifier la viabilité cellulaire et les dendrites cellulaires.- Le jour 1 et le jour 7 de la culture, retirez la solution mère de calcéine AM (4 mM dans le DMSO) et la solution mère d’EthD-1 (2 mM dans le DMSO/H2O 1 :4 [v/v]) du congélateur et laissez-les se réchauffer à température ambiante.
REMARQUE : La matrice minéralisée a un fort signal d’autofluorescence, de sorte que le stade préostéocytaire sans expression de Dmp1 dans les 7 jours suivant la culture4 est plus approprié pour l’observation de la coloration cellulaire. - Ajouter 4 μL de la solution mère d’EthD-1 à 2 mM et 5 μL de la solution mère de calcéine AM à 4 mM à 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) de Dulbecco et bien mélanger. Cela donne environ 2 μM de calcéine AM et 4 μM d’EthD-1 comme solutions de travail.
- Pipeter 0,5 mL de la solution de travail dans les puits de la plaque à 24 puits. Incuber pendant 30 à 45 minutes à température ambiante pour colorer la matrice cellule-gel.
- Après l’incubation, ajouter environ 0,5 mL de D-PBS frais dans une nouvelle boîte de culture à fond en verre de 35 mm. Couvrez la boîte pour éviter la contamination ou le dessèchement des échantillons.
- À l’aide d’une pince à pointe coudée, transférez délicatement la matrice de gel cellulaire colorée de l’étape 4.1.3 dans la boîte de culture de 35 mm de l’étape 4.1.4. Évitez d’endommager ou de cisailler la matrice cellulaire-gel.
- Visualisez les cellules marquées sous un microscope à fluorescence confocale laser.
- Le jour 1 et le jour 7 de la culture, retirez la solution mère de calcéine AM (4 mM dans le DMSO) et la solution mère d’EthD-1 (2 mM dans le DMSO/H2O 1 :4 [v/v]) du congélateur et laissez-les se réchauffer à température ambiante.
- Kit de balayage de microscope
- Placez le plat de 35 mm sur la scène. Sélectionnez les régions de la matrice cellule-gel à scanner à travers l’oculaire à l’aide d’un objectif 10x. Les objectifs à fort grossissement ne sont pas recommandés en raison de la taille des dendrites étendues.
- Sélectionnez les filtres optiques. La calcéine peut être considérée comme verte avec un filtre passe-bande de fluorescéine standard, et l’EthD-1 peut être considérée comme rouge avec des filtres pour l’iodure de propidium ou le colorant rouge du Texas. Sélectionnez le « mode ligne » pour le balayage et réglez le « trou d’épingle » sur 2 μm.
- Sélectionnez une profondeur de données de 8 bits et une résolution d’image de 1 024 pixels x 1 024 pixels.
- Image à l’aide d’un balayage linéaire séquentiel avec les paramètres optimaux du laser et du détecteur (garder une énergie laser minimale pour éviter un photoblanchiment potentiel).
REMARQUE : Le réglage optimal du détecteur dépend des signaux de fluorescence finaux.
- Collecte d’une « pile z » d’images
- Selon le signal du canal vert, définissez les positions supérieure et inférieure de la matrice cellule-gel à scanner en faisant la mise au point sur l’échantillon tout en balayant en continu, .
- Une fois que le haut et le bas de l’échantillon ont été spécifiés, sélectionnez le cadre de numérisation souhaité. Lancez la numérisation. L’échantillon sera numérisé de haut en bas avec les paramètres sélectionnés à l’étape 4.2, générant une galerie d’images.
- Identification de la viabilité cellulaire.
- Sélectionnez une tranche à partir de l’étape 4.3. Les canaux vert et rouge indiquent respectivement les cellules vivantes et mortes.
- Identification des dendrites cellulaires.
- Sélectionnez le seul canal vert pour générer des reconstructions 3D avec le logiciel d’acquisition d’images. Les informations de profondeur sont affichées sous la forme d’une série d’images pseudo-colorées arc-en-ciel. Les dendrites situées en bas du gel sont affichées en rouge, tandis que celles en haut sont affichées en bleu.
5. Identification de l’apparence à l’aide d’un stéréomicroscope
- Le jour 1, le jour 7, le jour 21 et le jour 35 de la culture, retirez le milieu de culture et lavez les gels dans la plaque deux fois avec du D-PBS. Ajouter 0,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % (v/v) dans le D-PBS dans le puits pour fixer la matrice cellule-gel dans la plaque pendant 10 min à température ambiante.
- Retirez le paraformaldéhyde dans le puits et lavez la matrice de gel cellulaire deux fois de plus avec du D-PBS dans la plaque. Laissez 0,5 mL de D-PBS dans chaque puits pour l’imagerie.
- Placez la plaque sur la platine et sélectionnez la position optimale à travers l’oculaire à l’aide d’un objectif 0,5x. Visualisez individuellement la vue plein champ de la matrice cellule-gel dans la plaque en utilisant « l’exposition automatique » sous le champ clair.
6. Identification des dépôts minéraux à l’aide d’un test XRF
- Au jour 35 de la culture, vérifiez si l’azote liquide est suffisant. Démarrez le système XRF. Ouvrez la salle d’échantillonnage et transférez les gels à l’aide d’une pince à pointe coudée de la plaque au milieu de la platine d’échantillonnage de l’instrument. Fermez la salle d’échantillonnage et attendez 30 minutes pour permettre à l’instrument de refroidir avant de l’utiliser.
- Réglez le « Temps d’exposition » sur 35 ms, la « Plage de spectre » sur 0-40 keV et le « Courant électrique » sur 770 μA pour la configuration de l’acquisition.
- Choisissez trois à cinq sites d’analyse pour l’analyse en déplaçant la platine d’échantillonnage.
- Sélectionnez les éléments (Ca et P) à détecter. Lancez la détection et exportez les résultats.
NOTE : Ca et P sont les éléments les plus abondants dans l’hydroxyapatite.
7. Identification de l’expression des gènes fonctionnels
- Le jour 1, le jour 7, le jour 21, le jour 28 et le jour 35 de la culture, retirez le milieu de culture et lavez la matrice cellulaire-gel deux fois avec du D-PBS glacé dans la plaque.
- Transférez les gels à l’aide d’une pince à pointe coudée de la plaque dans un tube de 2,0 ml (selon le temps de culture, la matrice cellule-gel rétrécira progressivement jusqu’à environ 0,1 ml au jour 35). Assurez-vous qu’un gel est placé dans un tube. Ajouter 1 mL de phénol-chloroforme et deux billes stériles en acier inoxydable (4 mm, comme matrice de lyse) dans chaque tube. Placez les tubes symétriquement dans la fente d’échantillon pré-refroidie de l’homogénéisateur à battement mécanique.
- Réglez le battement sur une fréquence de 55 Hz et une amplitude de 1 cm par 1 min de battement mécanique avec une pause de 10 s, avec six cycles au total. Commencez à battre les perles.
- Extraire l’ARN total de la matrice cellule-gel à l’aide de la méthode phénol-chloroforme-isoamylachohol. Transcrire inversement 2 μg d’ARN total en ADNc à l’aide d’amorces hexamères aléatoires.
- Concevoir des amorces ciblant la β-actine, le Pdpn, le Dmp1, le Sost et le Fgf23 pour la PCR en temps réel (tableau 2). β-actine est le gène d’entretien utilisé pour la normalisation. Les gènes Pdpn10 et Dmp1 11 sont principalement exprimés dans les pré-ostéocytes et les ostéocytes minéralisés, tandis que Sost12 et Fgf23 13 sont principalement exprimés dans les ostéocytes matures.
- Placez le tube sur un thermocycleur avec le couvercle chauffant réglé à 105 °C et effectuez l’amplification PCR en utilisant les paramètres de cycle PCR suivants : 95 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 30 s pendant 35 cycles avec une première étape de dénaturation à 95 °C pendant 5 min et une dernière étape d’extension à 60 °C pendant 30 s. Analysez les changements de pli avec la méthode ΔΔCt.
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Representative Results
Après coloration des cellules vivantes/mortes, les cellules ont été visualisées à l’aide d’un microscope laser confocal. Toutes les cellules étaient positives pour la calcéine AM (couleur verte), et il n’y avait presque pas de cellules EthD-1 positives (couleur rouge) dans le champ, ce qui indique que le système de gel fabriqué par cette méthode est très approprié pour l’ostéocytogenèse (Figure 1A, à gauche). Pour mieux déterminer la distribution spatiale des cellules, une image en pseudo-couleur a été choisie pour afficher les dendrites cellulaires à différentes profondeurs du gel ; Le rouge montre les dendrites au bas du gel et le bleu montre les dendrites en haut. Les résultats ont indiqué que les cellules IDG-SW3 se sont bien développées dans cette matrice cellule-gel, et que les dendrites cellulaires se sont progressivement étendues en un réseau dans le milieu ostéogénique au jour 7 (Figure 1A, à droite, et Figure 1B).
Sous un stéréomicroscope, la transparence de la matrice de gel a continué à diminuer jusqu’à ce qu’elle devienne opaque au jour 35, contrairement à la matrice de gel acellulaire (Figure 2A). Le spectre XRF du gel opaque au jour 35 indiquait que le gel était complètement rempli de dépôts de calcium et de phosphore (figure 2B).
Le jour 1, le jour 7, le jour 21, le jour 28 et le jour 35 de la culture, l’expression de plusieurs gènes marqueurs a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats ont montré que les niveaux d’ARNm de Pdpn et de Dmp1 ont continuellement augmenté du jour 1 au jour 21, tandis que le niveau d’ARNm de Pdpn a diminué après le jour 21 (Figure 3). Les niveaux d’ARNm de Fgf23 et de Sost ont continuellement augmenté au cours de tous les stades (Figure 3).
Figure 1 : Le réseau cellulaire de dendrites d’IDG-SW3 visualisé par microscopie confocale. (A) Images représentatives d’une partie du réseau étendu de dendrites dans le gel. La couleur verte indique les cellules vivantes et le réseau de dendrites cellulaires étendu. (B) Pseudo-couleur de l’image en A (à droite, jour 7). La couleur rouge (bleue) indique les dendrites situées en bas (en haut) du gel. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dépôt minéral des cellules IDG-SW3 après culture ostéogénique. (A) Images représentatives en plein champ du gel avec (en haut) et sans (en bas) cellules dans une plaque à 24 puits aux moments indiqués, tels que visualisés par un stéréomicroscope. (B) La teneur en calcium et en phosphore dans la matrice cellulaire-gel au jour 35, telle qu’analysée par le test XRF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’expression fonctionnelle des gènes des cellules IDG-SW3 après culture ostéogénique. Modifications des gènes fonctionnels dans les cellules IDG-SW3 cultivées avec un milieu ostéogénique aux moments indiqués. Abréviations : D = jour ; W = semaine. Les données sont représentées par la moyenne ± MEB. Les changements de plis ont été analysés avec la méthode Ct, en se référant au gène β-actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| 2D | .3D | |
| Difficulté de préparation | facile | Douleur moyenne |
| Gradient de nutriment | absent | présent |
| Disposition du collagène | monocouche | multiaxiale discrète |
| Rigidité mécanique de l’ECM | haut | bas |
| Gamme mécanique de l’ECM | unilatéral | entourer |
| Motilité cellulaire | surface plane | libre |
| Communication intercellulaire | insuffisant | suffisant |
Tableau 1 : Comparaison entre les systèmes de culture 2D et 3D pour les cellules IDG-SW3.
| Prénoms | Séquences (5'- 3') |
| Pdpn-pour | GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG |
| Pdpn-rev | GGTTGTACTCTCGTGTTCTCTG |
| Dmp1-pour | CCCAGTTGCCAGATACCAC |
| Dmp1-rev | CACTATTTGCCTGTCCCTCTG |
| Sost-pour | ACAACCAGACCATGAACCG |
| Sost-rev | CAGGAAGCGGGTGTAGTG |
| FGF23-POUR | GGTGATAACAGGAGCCATGAC |
| Fgf23-rev | TGCTTCTGCGACAAGTAGAC |
| β-actine pour | ACCTTCTACAATGAGCTGCG |
| β-actine-rev | CTGGATGGCTACGTACATGG |
Tableau 2 : Amorces utilisées dans le test de PCR en temps réel.
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Discussion
Un point critique de ce protocole est que les étapes 1 et 2 doivent être effectuées sur de la glace pour éviter la coagulation spontanée. Dans cette méthode, la concentration finale de collagène I était de 1,2 mg/mL. Ainsi, un volume optimal de ddH2O doit être calculé pour correspondre aux différents collagènes de différents fabricants.
In vivo, l’ostéocytogenèse implique un mouvement polaire des ostéoblastes de la surface vers l’intérieur de l’os trabéculaire14. Ce protocole libère les cellules de la croissance dans la matrice sans polarité directionnelle. Bien entendu, l’ensemencement des cellules IDG-SW3 sur la surface de la matrice de gel sans cellules est facultatif. Cependant, la concentration de collagène fournie dans ce protocole n’est pas suffisante pour former une surface théoriquement plane pour l’infiltration d’ostéoblastes. Différents ratios de collagène I et de matrice extracellulaire doivent être testés à cette fin.
Par rapport à celle de l’ostéoïde, la rigidité de ce gel est loin d’être suffisante. Certains articles rapportent une augmentation de la résistance des gels par l’ajout de plusieurs matériaux chimiques pour mieux imiter la rigidité de l’ostéoïde in vivo 6,15. L’avantage de cette méthode est que le gel formé peut fournir un milieu avec une bonne transparence pour l’imagerie et le traçage des cellules in situ plutôt que d’utiliser des méthodes histologiques15. Néanmoins, il est difficile de satisfaire la transparence du matériau pour l’imagerie tout en s’assurant que les propriétés physiques et chimiques in vitro peuvent imiter l’ostéoïde. Par conséquent, d’autres modèles de culture doivent être explorés pour répondre à des questions scientifiques spécifiques.
De plus, les propriétés physico-chimiques de ce gel minéralisé IDG-SW3, y compris les propriétés rhéologiques, ont été introduites dans une étude précédente16. Ainsi, ce gel minéralisé biogène formé par cette méthode pourrait être utile comme matériau biomédical pour de futures recherches orthopédiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions la Dre Lynda F. Bonewald d’avoir fait don de la lignée cellulaire IDG-SW3. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82070902, 82100935 et 81700778) et le projet de voile « Science and Technology Innovation » de Shanghai (21YF1442000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
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