Summary
Her presenterer vi en protokoll for dyrking av IDG-SW3-celler i en tredimensjonal (3D) ekstracellulær matrise.
Abstract
Osteocytter anses å være ikke-proliferative celler som er terminalt differensiert fra osteoblaster. Osteoblaster innebygd i beinets ekstracellulære matriks (osteoid) uttrykker Pdpn-genet for å danne cellulære dendritter og transformere til preosteocytter. Senere uttrykker preosteocytter Dmp1-genet for å fremme matriksmineralisering og derved transformere til modne osteocytter. Denne prosessen kalles osteocytogenese. IDG-SW3 er en velkjent cellelinje for in vitro-studier av osteocytogenese. Mange tidligere metoder har brukt kollagen I som hovedkomponent eller eneste komponent i dyrkingsmatrisen. Men i tillegg til kollagen I inneholder osteoiden også et grunnstoff, som er en viktig komponent for å fremme cellulær vekst, vedheft og migrasjon. I tillegg er matriksstoffet gjennomsiktig, noe som øker gjennomsiktigheten av kollagen I-formet gel og dermed hjelper utforskningen av dendrittdannelse gjennom avbildningsteknikker. Dermed beskriver dette papiret en protokoll for å etablere en 3D-gel ved hjelp av en ekstracellulær matrise sammen med kollagen I for IDG-SW3-overlevelse. I dette arbeidet ble dendrittdannelse og genuttrykk analysert under osteocytogenese. Etter 7 dager med osteogen kultur ble et omfattende dendrittnettverk tydelig observert under et fluorescens konfokalmikroskop. Sanntids PCR viste at mRNA-nivåene av Pdpn og Dmp1 kontinuerlig økte i 3 uker. I uke 4 avslørte stereomikroskopet en ugjennomsiktig gel fylt med mineralpartikler, i samsvar med røntgenfluorescensanalysen (XRF). Disse resultatene indikerer at denne kulturmatrisen vellykket letter overgangen fra osteoblaster til modne osteocytter.
Introduction
Osteocytter er terminalt differensierte celler avledet fra osteoblaster 1,2. Når osteoblasten er begravet av osteoiden, gjennomgår den osteocytogenese og uttrykker Pdpn-genet for å danne preosteocytter, Dmp1-genetfor å mineralisere osteoiden og Sost- og Fgf23-gener for å fungere som en moden osteocyt i beinvev3. Her introduseres et 3D-dyrkingssystem for å identifisere dendrittforlengelse og markørgenuttrykk i osteocytogeneseprosessen.
IDG-SW3-celler er en udødeliggjort primærcellelinje avledet fra transgene mus og kan utvide eller replikere osteoblast til sen osteocytdifferensiering når de dyrkes i forskjellige medier4. Sammenlignet med MLO-A5, MLO-Y4 og andre cellelinjer, er ekspresjonsprofilen til funksjonelle proteiner, evnen til å utføre kalsiumsaltavsetning og responsene på forskjellige hormoner i IDG-SW3-celler mer sannsynlig å være de samme som for primære osteocytter i beinvevet4.
Sammenlignet med 2D-systemer er 3D-dyrkingssystemer bedre i stand til å etterligne det in vivo cellulære vekstmiljøet, inkludert næringsgradienten, lav mekanisk stivhet og omkringliggende mekanisk område (tabell 1). De fleste av de tidligere metodene for dyrking av osteoblastiske celler i et 3D-system brukte kollagen I som den unike komponenten i formuleringer 4,5,6, fordi kollagen I-fibre tjener som stedet for kalsium- og fosforavsetning. Imidlertid inneholder en uunnværlig bestanddel i osteoid, den ekstracellulære matrisen, en stor gruppe cellulære faktorer som fremmer cellulær vekst, vedheft og migrasjon 7,8 og er gjennomsiktig og praktisk for bildeobservasjon. Dermed bruker denne protokollen Matrigel (heretter referert til som kjellermembranmatrise) som en sekundær komponent for osteocytogenesestudien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen er egnet for dyrking av celler i fire brønner med 24-brønnplater. Ved tilberedning av flere prøver eller plater bør mengden av reagensene økes tilsvarende.
1. Fremstilling av kollagen I-blandingen
MERK: Kollagen I og kjellermembranmatriksgel raskt ved romtemperatur. Kollagen bør derfor håndteres på is (2 °C til 8 °C). Alle tips og rør som brukes må være forkjølt med mindre annet er angitt. Alle prosedyrene skal utføres i en sikkerhetshette.
- Legg alle reagensene og sentrifugerørene på is.
- Pipett sakte 0,48 ml kollagen I (5 mg/ml) og 0,1 ml 10x minimum essensielt medium (MEM) (med fenolrødt) til et sterilt 15 ml sentrifugerør som holdes på is. Bland godt ved å pipettere forsiktig opp og ned.
- I henhold til fargepaletten til den fenolrøde indikatoren, bruk et passende volum på 7,5% (w / v) NaHCO3 (ca. 0,2 ml) for å justere fenolrødindikatoren til oransje, noe som indikerer at pH-verdien ligger i området 7,0-7,4.
MERK: Avhengig av pH i mediet, brukes et volum av NaHCO3 for å bringe pH til ca. 7,0-7,4. I tillegg brukes NaOH til pH-nøytralisering. - Bring det endelige volumet av blandingen opp til 1 ml ved å tilsette et passende volum ddH2O. Bland godt ved å pipetere forsiktig opp og ned for å klargjøre for bruk.
MERK: Det endelige volumet av ddH2O vil avhenge av mengden NaHCO 3 eller NaOH som brukes i trinn1.3 .
2. Fremstilling av cellematriseblandingen
- Pipetter sakte 0,9 ml kjellermembranmatrise inn i et nytt 15 ml sentrifugerør på isen.
- Dyrkning: IDG-SW3-cellene i en T25-kolbe med 4 ml komplett medium (alfa-MEM inneholdende 10% føtalt bovint serum [FBS]) supplert med 50 U/ml INF-γ ved 33 °C.
- Når IDG-SW3-cellene når 90% konfluens, fjern mediet og vask cellene med fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4 gjennom hele protokollen) med en pipette. Fordøy cellene med 0,5 ml 0,25% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ved 37 °C i 30 s.
- Inaktiver trypsinet ved å tilsette 3,5 ml komplett medium (alfa-MEM inneholdende 10% føtalt bovint serum [FBS]). Overfør 4 ml cellesuspensjonen til et 15 ml sentrifugerør.
- Spinn ned cellesuspensjonen ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml av hele mediet på is.
- Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer og juster den endelige celletettheten med hele mediet til 4 × 105 celler / ml. Tilsett 0,1 ml av den klargjorte cellesuspensjonen til 0,9 ml av den ekstracellulære matriksen fra trinn 2,1. Bland godt ved å pipettere forsiktig opp og ned.
MERK: Hvis en cellefri kontroll er nødvendig, legg til 0,1 ml av hele mediet til 0,9 ml ekstracellulær matrise som en negativ kontroll.
3. Plettering av celle-gelblandingen
- Bland forsiktig de to blandingene fra trinn 2,6 og trinn 1,4 til 2 ml godt ved å pipettere opp og ned på isen. Pipette 0,5 ml av den endelige blandingen i hver brønn (fire brønner med en 24-brønnsplate). Inkuber ved 37 °C i 1 time for å danne en celle-gelblanding.
- Tilsett 0,5 ml osteogent medium (komplett medium inneholdende 50 μg/ml askorbinsyre og 4 mM β-glycerofosfat, også kjent som osteogent induksjonsmedium)4 til cellegelblandingen i hver brønn for å starte den osteogene differensieringen ved 37 °C. Betrakt dette som dag 0.
- Hver 2. dag erstattes halvparten av mediet med friskt osteogent medium ved 37 °C. Fortsett dyrkingen i 35 dager.
4. Identifisere cellens levedyktighet og cellulære dendritter ved hjelp av et konfokalmikroskop
- Cellefarging
MERK: Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) er en celle-permeant fargestoff som kan brukes til å bestemme celle levedyktighet. Ethidium homodimer-I (EthD-1) krysser ikke membranen til intakte/levedyktige celler9. Dermed kan kalcein AM / EthD-1 brukes til å identifisere celle levedyktighet og cellulære dendritter.- På dag 1 og dag 7 av kulturen, fjern calcein AM-stamløsningen (4 mM i DMSO) og EthD-1-stamløsningen (2 mM i DMSO / H2O 1: 4 [v / v]) fra fryseren, og la dem varme til romtemperatur.
MERK: Den mineraliserte matrisen har et sterkt autofluorescenssignal, så preosteocytstadiet uten Dmp1-uttrykk innen 7 dager etter dyrking4 er mer egnet for observasjon av cellefarging. - Tilsett 4 μL av 2 mM EthD-1 stamløsning og 5 μL av 4 mM calcein AM-stamløsning til 2 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (D-PBS), og bland godt. Dette gir ca. 2 μM kalsein AM og 4 μM EthD-1 som arbeidsløsninger.
- Pipette 0,5 ml av arbeidsløsningen inn i brønnene i 24-brønnplaten. Inkuber i 30-45 minutter ved romtemperatur for å flekke celle-gelmatrisen.
- Etter inkubering, tilsett ca. 0,5 ml fersk D-PBS i en ny 35 mm glassbunnsform. Dekk fatet for å forhindre forurensning eller tørking av prøvene.
- Bruk albuetippede tang til å overføre den fargede cellegelmatrisen forsiktig fra trinn 4.1.3 til 35 mm kulturfat fra trinn 4.1.4. Unngå å skade eller skjære cellegelmatrisen.
- Se de merkede cellene under et laserkonfokalfluorescensmikroskop.
- På dag 1 og dag 7 av kulturen, fjern calcein AM-stamløsningen (4 mM i DMSO) og EthD-1-stamløsningen (2 mM i DMSO / H2O 1: 4 [v / v]) fra fryseren, og la dem varme til romtemperatur.
- Mikroskop skanning sett
- Plasser 35 mm tallerkenen på scenen. Velg regionene i cellegelmatrisen som skal skannes gjennom okularet ved hjelp av et 10x mål. Høyere forstørrelsesmål anbefales ikke på grunn av størrelsen på de utvidede dendrittene.
- Velg de optiske filtrene. Calcein kan sees på som grønn med et standard fluoresceinbåndpassfilter, og EthD-1 kan sees på som rødt med filtre for propidiumjodid eller Texas Red fargestoff. Velg "linjemodus" for skanning og sett "pinhole" til 2 μm.
- Velg en datadybde på 8 biter datadybde og en bildeoppløsning på 1 024 piksler x 1 024 piksler.
- Bilde ved hjelp av sekvensiell linjeskanning med optimale laser- og detektorinnstillinger (hold en minimal laserenergi for å unngå potensiell fotobleking).
MERK: Den optimale detektorinnstillingen avhenger av de endelige fluorescenssignalene.
- Samle en "z-stack" med bilder
- I henhold til det grønne kanalsignalet, definer topp- og bunnposisjonene til cellegelmatrisen som skal skannes ved å fokusere gjennom prøven mens du kontinuerlig skanner, .
- Når toppen og bunnen av prøven er spesifisert, velger du ønsket skanneramme. Begynn å skanne. Prøven blir skannet fra topp til bunn med de valgte innstillingene fra trinn 4.2, og genererer et galleri med bilder.
- Identifisering av levedyktighet i cellen.
- Velg ett stykke fra trinn 4.3. De grønne og røde kanalene indikerer henholdsvis levende og døde celler.
- Cell dendrit identifikasjon.
- Velg den ene grønne kanalen for å generere 3D-rekonstruksjoner med bildeinnsamlingsprogramvaren. Dybdeinformasjonen vises som en serie regnbue-pseudofargebilder. Dendrittene som ligger i bunnen av gelen vises i rødt, mens de øverst vises i blått.
5. Identifisere utseende ved hjelp av et stereomikroskop
- På dag 1, dag 7, dag 21 og dag 35 av kulturen, fjern dyrkingsmediet og vask gelene i tallerkenen to ganger med D-PBS. Tilsett 0,5 ml 4% (v/v) paraformaldehyd i D-PBS til brønnen for å feste cellegelmatrisen i platen i 10 minutter ved romtemperatur.
- Fjern paraformaldehydet i brønnen og vask cellegelmatrisen to ganger til med D-PBS i platen. La det være 0,5 ml D-PBS i hver brønn for avbildning.
- Plasser platen på scenen og velg den optimale posisjonen gjennom okularet ved hjelp av et 0,5x objektiv. Bilde fullfeltvisningen av cellegelmatrisen i platen individuelt ved hjelp av "automatisk eksponering" under det lyse feltet.
6. Identifisering av mineralavsetning med en XRF-analyse
- På dag 35 av kulturen, kontroller om flytende nitrogen er tilstrekkelig. Start XRF-systemet. Åpne prøverommet og overfør gelene med albuetippede tang fra platen til midten av prøvetrinnet på instrumentet. Lukk prøverommet og vent i 30 minutter for å la instrumentet avkjøles før bruk.
- Sett "Eksponeringstid" til 35 ms, "Spektrumområdet" til 0-40 keV og "Elektrisk strøm" til 770 μA for innsamlingsoppsett.
- Velg tre til fem skannesteder for analyse ved å flytte prøvetrinnet.
- Velg elementene (Ca og P) for gjenkjenning. Start gjenkjenningen og eksporter resultatene.
MERK: Ca og P er de mest tallrike elementene i hydroksyapatitt.
7. Identifisere funksjonelt genuttrykk
- På dag 1, dag 7, dag 21, dag 28 og dag 35 av kulturen, fjern dyrkingsmediet og vask cellegelmatrisen to ganger med iskald D-PBS i platen.
- Overfør gelene med albuetippede tang fra platen til et 2,0 ml rør (i henhold til kulturtiden vil cellegelmatrisen gradvis krympe til ca. 0,1 ml på dag 35). Pass på at en gel er plassert i ett rør. Tilsett 1 ml fenolkloroform og to sterile slagperler i rustfritt stål (4 mm, som en lysmatrise) i hvert rør. Plasser rørene symmetrisk inn i det forkjølte prøvesporet til den mekaniske slående homogenisatoren.
- Sett slagene til en frekvens på 55 Hz og en amplitude på 1 cm i hver 1 min med mekanisk juling med en 10 s pause, med seks sykluser totalt. Start perleslagene.
- Ekstraher det totale RNA fra celle-gelmatrisen ved hjelp av fenol-kloroform-isoamylachohol-metoden. Omvendt transkribering av 2 μg totalt RNA til cDNA med tilfeldige heksameterprimere.
- Design primere rettet mot β-aktin, Pdpn, Dmp1, Sost og Fgf23 for sanntids PCR (tabell 2). β-Actin er housekeeping-genet som brukes til normalisering. Pdpn10 og Dmp1 11 gener uttrykkes hovedsakelig i pre-osteocytter og mineraliserte osteocytter, mens Sost12 og Fgf23 13 hovedsakelig uttrykkes i modne osteocytter.
- Plasser røret på en termosyklist med det oppvarmede lokket satt til 105 °C og utfør PCR-forsterkning ved hjelp av følgende PCR-sykkelinnstillinger: 95 °C i 5 s og 60 °C i 30 s i 35 sykluser med et innledende denatureringstrinn ved 95 °C i 5 minutter og et siste forlengelsestrinn ved 60 °C i 30 s. Analyser foldeendringene med ΔΔCt-metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter farging av levende/døde celler ble cellene visualisert ved hjelp av et konfokal lasermikroskop. Alle cellene var kalcein AM-positive (grønn farge), og det var nesten ingen EthD-1-positive celler (rød farge) i feltet, noe som indikerer at gelsystemet laget med denne metoden er svært egnet for osteocytogenese (figur 1A, til venstre). For bedre å bestemme den romlige fordeling av cellene ble det valgt et pseudofargebilde for å vise celledendrittene på forskjellige dybder av gelen; Rødt viser dendrittene på bunnen av gelen, og blått viser dendrittene øverst. Resultatene indikerte at IDG-SW3-cellene vokste godt i denne celle-gel-matrisen, og de cellulære dendrittene utvidet seg gradvis til et nettverk i det osteogene mediet på dag 7 (figur 1A, til høyre og figur 1B).
Under et stereomikroskop fortsatte gjennomsiktigheten til gelmatrisen å avta til den ble ugjennomsiktig på dag 35, i motsetning til den cellefrie gelmatrisen (figur 2A). XRF-spekteret til den ugjennomsiktige gelen ved dag 35 indikerte at gelen var fullstendig fylt med kalsium- og fosforavleiringer (figur 2B).
På dag 1, dag 7, dag 21, dag 28 og dag 35 av kulturen ble uttrykket av flere markørgener analysert ved sanntids PCR. Resultatene viste at mRNA-nivåene av Pdpn og Dmp1 kontinuerlig økte fra dag 1 til dag 21, mens mRNA-nivået av Pdpn sank etter dag 21 (figur 3). mRNA-nivåene av Fgf23 og Sost økte kontinuerlig i alle stadier (figur 3).
Figur 1: Det cellulære dendrittnettverket av IDG-SW3 visualisert ved konfokal mikroskopi . (A) Representative bilder av et delvis område av det omfattende dendrittnettverket i gelen. Den grønne fargen indikerer levende celler og det utvidede cellulære dendrittnettverket. (B) Pseudofarge for bildet i A (høyre, dag 7). Den røde (blå) fargen indikerer dendrittene som ligger nederst (øverst) av gelen. Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mineralavsetning av IDG-SW3-cellene etter osteogen dyrking . (A) Representative fullfeltsbilder av gelen med (øverst) og uten (bunn) celler i en 24-brønnsplate på de angitte tidspunktene, som visualisert av et stereomikroskop. (B) Kalsium- og fosforinnholdet i cellegelmatrisen på dag 35, som analysert ved XRF-analysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Det funksjonelle genuttrykket til IDG-SW3-cellene etter osteogen dyrking. Endringer i funksjonelle gener i IDG-SW3-cellene dyrket med et osteogent medium på de angitte tidspunktene. Forkortelser: D = dag; W = uke. Data er representert som gjennomsnittet ± SEM. Foldeendringer ble analysert med Ct-metoden, med henvisning til β-aktingenet . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 2D | .3D | |
| Vanskelighetsgrad ved forberedelse | lett | Middels |
| Gradient av næringsstoffer | fraværende | gave |
| Arrangement av kollagen | Monolag | multiaksial diskret |
| Mekanikk stivhet av ECM | høy | lav |
| Mekanisk utvalg av ECM | unilateral | omringe |
| Celle motilitet | Flat overflate | gratis |
| Intercellulær kommunikasjon | utilstrekkelig | tilstrekkelig |
Tabell 1: Sammenligning mellom 2D- og 3D-kultursystemer for IDG-SW3-celler.
| Navn | Sekvenser (5'- 3') |
| PDPN-for | GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG |
| Pdpn-rev | GGTTGTACTCTCGTGTTCTCTG |
| Dmp1-for | CCCAGTTGCCAGATACCAC |
| Dmp1-rev | CACTATTTGCCTGTCCCTCTG |
| Sost-for | ACAACCAGACCATGAACCG |
| Sost-rev | CAGGAAGCGGGTGTAGTG |
| FGF23-for | GGTGATAACAGGAGCCATGAC |
| FGF23-rev | TGCTTCTGCGACAAGTAGAC |
| β-aktin-for | ACCTTCTACAATGAGCTGCG |
| β-aktin-rev | CTGGATGGCTACGTACATGG |
Tabell 2: Primere brukt i sanntids PCR-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk punkt i denne protokollen er at trinn 1 og trinn 2 må utføres på is for å forhindre spontan koagulasjon. I denne metoden var den endelige konsentrasjonen av kollagen I 1,2 mg / ml. Dermed bør et optimalt ddH2O-volum beregnes for å matche de forskjellige kollagenene fra forskjellige produsenter.
In vivo involverer osteocytogenese en polar bevegelse av osteoblaster fra overflaten til det indre av trabekulært bein14. Denne protokollen frigjør celler fra vekst i matrisen uten retningspolaritet. Selvfølgelig er såing av IDG-SW3-celler på den cellefrie gelmatriseoverflaten valgfri. Kollagenkonsentrasjonen gitt i denne protokollen er imidlertid ikke nok til å danne en teoretisk flat overflate for osteoblastinfiltrasjon. Ulike forhold mellom kollagen I og ekstracellulær matrise bør testes for dette formålet.
Sammenlignet med osteoidens er stivheten til denne gelen langt fra tilstrekkelig. Noen artikler rapporterer å øke styrken av geler ved å legge til flere kjemiske materialer for bedre å etterligne stivheten til osteoiden in vivo 6,15. Fordelen med denne metoden er at gelen som dannes kan gi et medium med god gjennomsiktighet for avbildning og sporing av celler in situ i stedet for å bruke histologiske metoder15. Likevel er det vanskelig å tilfredsstille gjennomsiktigheten av materialet for avbildning, samtidig som man sikrer at de fysiske og kjemiske egenskapene in vitro kan etterligne osteoideen. Derfor må flere kulturmodeller utforskes for å løse spesifikke vitenskapelige spørsmål.
I tillegg ble de fysisk-kjemiske egenskapene til denne IDG-SW3 mineraliserte gelen, inkludert de reologiske egenskapene, introdusert i en tidligere studie16. Dermed kan denne biogene mineraliserte gelen dannet ved denne metoden være nyttig som et biomedisinsk materiale for fremtidig ortopedisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Lynda F. Bonewald for å gi IDG-SW3-cellelinjen i gave. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82070902, 82100935 og 81700778) og Shanghai "Science and Technology Innovation" Sailing Project (21YF1442000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
- Bonewald, L. F.
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell ... and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
