Summary
Apresentamos aqui um protocolo para cultivo de células IDG-SW3 em uma matriz extracelular tridimensional (3D).
Abstract
Os osteócitos são considerados células não proliferativas que se diferenciam terminalmente dos osteoblastos. Osteoblastos embutidos na matriz extracelular óssea (osteóide) expressam o gene Pdpn para formar dendritos celulares e transformar-se em preosteócitos. Posteriormente, os pré-osteócitos expressam o gene Dmp1 para promover a mineralização da matriz e, assim, transformar-se em osteócitos maduros. Esse processo é chamado de osteocitogênese. IDG-SW3 é uma linhagem celular bem conhecida para estudos in vitro de osteocitogênese. Muitos métodos anteriores utilizaram o colágeno I como principal ou único componente da matriz de cultivo. No entanto, além do colágeno I, o osteóide também contém uma substância fundamental, que é um componente importante na promoção do crescimento, adesão e migração celular. Além disso, a substância da matriz é transparente, o que aumenta a transparência do gel formado pelo colágeno I e, assim, auxilia a exploração da formação de dendritos por meio de técnicas de imagem. Assim, este trabalho detalha um protocolo para estabelecer um gel 3D usando uma matriz extracelular juntamente com colágeno I para a sobrevivência do IDG-SW3. Neste trabalho, a formação de dendritos e a expressão gênica foram analisadas durante a osteocitogênese. Após 7 dias de cultura osteogênica, uma extensa rede dendrítica foi claramente observada sob microscópio confocal de fluorescência. A PCR em tempo real mostrou que os níveis de RNAm de Pdpn e Dmp1 aumentaram continuamente por 3 semanas. Na semana 4, o estereomicroscópio revelou um gel opaco preenchido com partículas minerais, consistente com o ensaio de fluorescência de raios X (XRF). Estes resultados indicam que esta matriz de cultura facilita com sucesso a transição de osteoblastos para osteócitos maduros.
Introduction
Os osteócitos são células terminalmente diferenciadas derivadas dososteoblastos1,2. Uma vez sepultado pelo osteóide, o osteoblasto sofre osteocitogênese e expressa o gene Pdpn para formar preosteócitos, o gene Dmp1 para mineralizar o osteóide e os genes Sost e Fgf23 para funcionar como osteócito maduro no tecido ósseo3. Aqui, um sistema de cultura 3D é introduzido para identificar a extensão dos dendritos e a expressão gênica de marcadores no processo de osteocitogênese.
As células IDG-SW3 são uma linhagem celular primária imortalizada derivada de camundongos transgênicos e podem expandir ou replicar osteoblastos para diferenciação tardia de osteócitos quando cultivadas em diferentesmeios4. Em comparação com MLO-A5, MLO-Y4 e outras linhagens celulares, o perfil de expressão de proteínas funcionais, a capacidade de realizar deposição de sal de cálcio e as respostas a vários hormônios em células IDG-SW3 são mais prováveis de serem as mesmas que as de osteócitos primários no tecidoósseo4.
Comparados aos sistemas 2D, os sistemas de cultivo 3D são mais capazes de mimetizar o ambiente de crescimento celular in vivo, incluindo o gradiente de nutrientes, baixa rigidez mecânica e faixa mecânica circundante (Tabela 1). A maioria dos métodos anteriores de cultivo de células osteoblásticas em sistema 3D utilizava o colágeno I como único componente nas formulações 4,5,6, pois as fibras colágenas I servem como local de deposição de cálcio e fósforo. Entretanto, um constituinte indispensável no osteóide, a matriz extracelular, contém um grande grupo de fatores celulares que promovem o crescimento, adesão e migraçãocelular7,8 e é transparente e conveniente para a observação por imagem. Assim, este protocolo utiliza o Matrigel (doravante denominado matriz de membrana basal) como componente secundário para o estudo da osteocitogênese.
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Protocol
Este protocolo é adequado para o cultivo de células em quatro poços de placas de 24 poços. Se preparar várias amostras ou placas, as quantidades dos reagentes devem ser aumentadas em conformidade.
1. Preparação da mistura de colágeno I
NOTA: Colágeno I e gel de matriz de membrana basal rapidamente à temperatura ambiente. Portanto, o colágeno deve ser manipulado no gelo (2 °C a 8 °C). Todas as pontas e tubos utilizados devem ser pré-refrigerados, salvo indicação em contrário. Todos os procedimentos devem ser realizados em uma capa de segurança.
- Coloque todos os reagentes e tubos de centrífuga no gelo.
- Pipetar lentamente 0,48 mL de colágeno I (5 mg/mL) e 0,1 mL de meio essencial mínimo (MEM) 10x (com vermelho de fenol) para um tubo centrífugo estéril de 15 mL mantido em gelo. Misture bem pipetando para cima e para baixo suavemente.
- De acordo com a paleta de cores do indicador vermelho fenol, use um volume apropriado de 7,5% (p/v) de NaHCO3 (aproximadamente 0,2 mL) para ajustar o indicador vermelho de fenol para laranja, o que indica que o valor de pH está na faixa de 7,0-7,4.
NOTA: Dependendo do pH do meio, um volume de NaHCO3 é usado para trazer o pH para aproximadamente 7,0-7,4. Além disso, o NaOH é usado para neutralização do pH. - Leve o volume final da mistura até 1 mL adicionando um volume apropriado de ddH2O. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo para se preparar para o uso.
NOTA: O volume final de ddH2O dependerá da quantidade de NaHCO 3 ou NaOH utilizada no passo1.3 .
2. Preparação da mistura célula-matriz
- Pipetar lentamente 0,9 mL de matriz de membrana basal para um novo tubo de centrífuga de 15 mL sobre o gelo.
- Cultivar as células IDG-SW3 em frasco T25 com 4 mL de meio completo (alfa-MEM contendo 10% de soro fetal bovino [SFB]) suplementado com 50 U/mL de INF-γ a 33 °C.
- Assim que as células IDG-SW3 atingirem 90% de confluência, retirar o meio e lavar as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4 durante todo o protocolo) com uma pipeta. Digerir as células com 0,5 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% a 37 °C por 30 s.
- Inativar a tripsina adicionando 3,5 mL de meio completo (alfa-MEM contendo 10% de soro fetal bovino [SFB]). Transfira a suspensão de 4 mL de células para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Gire a suspensão celular a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL do meio completo sobre gelo.
- Contar as células usando um hemocitômetro e ajustar a densidade celular final com o meio completo para 4 × 105 células/mL. Adicionar 0,1 ml da suspensão celular preparada a 0,9 ml da matriz extracelular do passo 2.1. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo.
NOTA: Se for necessário um controle livre de células, adicione 0,1 mL do meio completo a 0,9 mL de matriz extracelular como controle negativo.
3. Chapeamento da mistura célula-gel
- Delicadamente, misture bem as duas misturas da etapa 2.6 e da etapa 1.4 a 2 mL, pipetando para cima e para baixo sobre o gelo. Pipetar 0,5 mL da mistura final para cada poço (quatro poços de uma placa de 24 poços). Incubar a 37 °C durante 1 h para formar uma mistura célula-gel.
- Adicionar 0,5 mL de meio osteogênico (meio completo contendo 50 μg/mL de ácido ascórbico e 4 mM de β-glicerofosfato, também conhecido como meio de indução osteogênica)4 à mistura célula-gel em cada poço para iniciar a diferenciação osteogênica a 37 °C. Considere isso como Dia 0.
- A cada 2 dias, substituir metade do meio por meio osteogênico fresco mantido a 37 °C. Continuar o cultivo por 35 dias.
4. Identificação da viabilidade celular e dos dendritos celulares utilizando microscópio confocal
- Coloração celular
NOTA: Calceína acetoximetil éster (calceína AM) é um corante permeático celular que pode ser usado para determinar a viabilidade celular. O homodímero de etídio-I (EthD-1) não atravessa a membrana de células intactas/viáveis9. Assim, a calceína AM/EthD-1 pode ser usada para identificar a viabilidade celular e os dendritos celulares.- No Dia 1 e no Dia 7 da cultura, remova a solução-estoque de calceína AM (4 mM em DMSO) e a solução-estoque de EthD-1 (2 mM em DMSO/H2O 1:4 [v/v]) do freezer e deixe aquecer até a temperatura ambiente.
NOTA: A matriz mineralizada tem um forte sinal de autofluorescência, de modo que o estágio de pré-osteócito sem expressão de Dmp1 dentro de 7 dias após a cultura4 é mais adequado para a observação da coloração celular. - Adicionar 4 μL da solução-mãe de EthD-1 2 mM e 5 μL da solução-mãe de calceína AM de 4 mM a 2 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) e misturar bem. Isso dá aproximadamente 2 μM de calceína AM e 4 μM de EthD-1 como soluções de trabalho.
- Pipetar 0,5 mL da solução de trabalho para os poços na placa de 24 poços. Incubar por 30-45 min à temperatura ambiente para manchar a matriz célula-gel.
- Após a incubação, adicionar aproximadamente 0,5 mL de D-PBS fresco a uma nova placa de cultura com fundo de vidro de 35 mm. Cubra o prato para evitar contaminação ou secagem das amostras.
- Usando pinça com ponta de cotovelo, transfira cuidadosamente a matriz de gel de célula corada do passo 4.1.3 para a placa de cultura de 35 mm do passo 4.1.4. Evite danificar ou cisalhar a matriz celular-gel.
- Visualize as células marcadas sob um microscópio confocal de fluorescência a laser.
- No Dia 1 e no Dia 7 da cultura, remova a solução-estoque de calceína AM (4 mM em DMSO) e a solução-estoque de EthD-1 (2 mM em DMSO/H2O 1:4 [v/v]) do freezer e deixe aquecer até a temperatura ambiente.
- Conjunto de varredura do microscópio
- Coloque o prato de 35 mm no palco. Selecione as regiões da matriz célula-gel a serem escaneadas através da ocular usando uma objetiva de 10x. Objetivos de maior ampliação não são recomendados devido ao tamanho dos dendritos estendidos.
- Selecione os filtros ópticos. A calceína pode ser vista como verde com um filtro passa-banda fluoresceína padrão, e o EthD-1 pode ser visto como vermelho com filtros para iodeto de propídio ou corante Texas Red. Selecione o "modo de linha" para digitalização e defina o "pinhole" para 2 μm.
- Selecione uma profundidade de dados de 8 bits e uma resolução de imagem de 1.024 pixels x 1.024 pixels.
- Imagem usando varredura de linha sequencial com as configurações ideais de laser e detector (mantenha uma energia laser mínima para evitar potencial fotobranqueamento).
NOTA: A configuração ideal do detector depende dos sinais finais de fluorescência.
- Coletando uma "pilha z" de imagens
- De acordo com o sinal do canal verde, defina as posições superior e inferior da matriz célula-gel a ser escaneada, focalizando através da amostra enquanto escaneia continuamente, .
- Depois que a parte superior e inferior da amostra tiverem sido especificadas, selecione o quadro de digitalização desejado. Inicie a digitalização. A amostra será digitalizada de cima para baixo com as configurações selecionadas a partir da etapa 4.2, gerando uma galeria de imagens.
- Identificação da viabilidade celular.
- Selecione uma fatia na etapa 4.3. Os canais verde e vermelho indicam células vivas e mortas, respectivamente.
- Identificação de dendritos celulares.
- Selecione o único canal verde para gerar reconstruções 3D com o software de aquisição de imagens. As informações de profundidade são exibidas como uma série de imagens pseudocoloridas do arco-íris. Os dendritos localizados na parte inferior do gel são exibidos em vermelho, enquanto aqueles na parte superior são exibidos em azul.
5. Identificação da aparência usando um estereomicroscópio
- No Dia 1, Dia 7, Dia 21 e Dia 35 da cultura, retire o meio de cultura e lave os géis no prato duas vezes com D-PBS. Adicionar 0,5 mL de paraformaldeído a 4% (v/v) em D-PBS ao poço para fixar a matriz célula-gel na placa por 10 min à temperatura ambiente.
- Retire o paraformaldeído do poço e lave a matriz célula-gel mais duas vezes com D-PBS na placa. Deixar 0,5 mL de D-PBS em cada poço para aquisição de imagens.
- Coloque a placa no palco e selecione a posição ideal através da ocular usando uma objetiva de 0,5x. Imagem da visão de campo total da matriz célula-gel na placa individualmente usando "exposição automática" sob o campo brilhante.
6. Identificando a deposição mineral com um ensaio de XRF
- No 35º dia da cultura, verifique se o nitrogênio líquido é suficiente. Inicie o sistema XRF. Abra a sala de amostras e transfira os géis com pinça com ponta de cotovelo da placa para o meio do estágio de amostra do instrumento. Feche a sala de amostras e aguarde 30 min para permitir que o instrumento esfrie antes de usar.
- Defina o "Tempo de exposição" para 35 ms, a "faixa de espectro" para 0-40 keV e a "Corrente elétrica" para 770 μA para configuração de aquisição.
- Escolha de três a cinco locais de varredura para análise movendo o estágio de amostragem.
- Selecione os elementos (Ca e P) para detecção. Inicie a detecção e exporte os resultados.
NOTA: Ca e P são os elementos mais abundantes na hidroxiapatita.
7. Identificação da expressão gênica funcional
- No Dia 1, Dia 7, Dia 21, Dia 28 e Dia 35 da cultura, remova o meio de cultura e lave a matriz célula-gel duas vezes com D-PBS gelado na placa.
- Transfira os géis com pinça com ponta de cotovelo da placa para um tubo de 2,0 mL (de acordo com o tempo de cultura, a matriz célula-gel diminuirá gradualmente para aproximadamente 0,1 mL no Dia 35). Certifique-se de que um gel é colocado em um tubo. Adicionar 1 mL de fenol-clorofórmio e duas esferas estéreis de aço inoxidável (4 mm, como matriz lisante) em cada tubo. Coloque os tubos simetricamente no slot de amostra pré-resfriado do homogeneizador de batimento mecânico.
- Ajuste o batimento para uma frequência de 55 Hz e uma amplitude de 1 cm a cada 1 min de batimento mecânico com uma pausa de 10 s, com seis ciclos no total. Comece a bater as contas.
- Extrair o RNA total da matriz célula-gel usando o método fenol-clorofórmio-isoamilachool. Transcrever reversamente 2 μg de RNA total para cDNA com iniciadores hexâmeros aleatórios.
- Projete primers direcionados para β-actina, Pdpn, Dmp1, Sost e Fgf23 para PCR em tempo real (Tabela 2). β-Actina é o gene housekeeping usado para normalização. Os genes Pdpn10 e Dmp1 11 são expressos principalmente em pré-osteócitos e osteócitos mineralizados, enquanto Sost12 e Fgf23 13 são expressos principalmente em osteócitos maduros.
- Coloque o tubo num termociclador com a tampa aquecida regulada para 105 °C e efectue a amplificação por PCR utilizando as seguintes definições de ciclo de PCR: 95 °C para 5 s e 60 °C para 30 s durante 35 ciclos, com um passo inicial de desnaturação a 95 °C durante 5 minutos e um passo de extensão final a 60 °C durante 30 s. Analise as mudanças de dobra com o método ΔΔCt.
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Representative Results
Após a coloração de células vivas/mortas, as células foram visualizadas em microscópio confocal a laser. Todas as células eram positivas para calceína AM (cor verde) e quase não havia células positivas para EthD-1 (cor vermelha) no campo, indicando que o sistema de gel feito por este método é altamente adequado para osteocitogênese (Figura 1A, esquerda). Para melhor determinar a distribuição espacial das células, uma imagem pseudocolorida foi escolhida para exibir os dendritos celulares em diferentes profundidades do gel; O vermelho mostra os dendritos na parte inferior do gel, e o azul mostra os dendritos na parte superior. Os resultados indicaram que as células IDG-SW3 cresceram bem nessa matriz célula-gel, e os dendritos celulares gradualmente se estenderam em uma rede no meio osteogênico no Dia 7 (Figura 1A, à direita, e Figura 1B).
Sob um estereomicroscópio, a transparência da matriz de gel continuou a declinar até se tornar opaca aos 35 dias, ao contrário da matriz de gel livre de células (Figura 2A). O espectro de XRF do gel opaco no Dia 35 indicou que o gel estava completamente preenchido com depósitos de cálcio e fósforo (Figura 2B).
No Dia 1, Dia 7, Dia 21, Dia 28 e Dia 35 da cultura, a expressão de vários genes marcadores foi analisada por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que os níveis de RNAm de Pdpn e Dmp1 aumentaram continuamente do Dia 1 até o Dia 21, enquanto o nível de RNAm de Pdpn diminuiu após o Dia 21 (Figura 3). Os níveis de RNAm de Fgf23 e Sost aumentaram continuamente durante todos os estágios (Figura 3).
Figura 1: Rede dendrítica celular do IDG-SW3 visualizada por microscopia confocal. (A) Imagens representativas de uma área parcial da extensa rede dendrítica no gel. A cor verde indica as células vivas e a rede de dendritos celulares estendida. (B) Pseudocor da imagem em A (à direita, Dia 7). A cor vermelha (azul) indica os dendritos localizados na parte inferior (superior) do gel. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Deposição mineral das células IDG-SW3 após cultivo osteogênico . (A) Imagens representativas de campo total do gel com células (superior) e sem células (inferior) em placa de 24 poços nos tempos indicados, visualizadas por estereomicroscópio. (B) O conteúdo de cálcio e fósforo na matriz célula-gel no 35º dia, analisado pelo ensaio de XRF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão gênica funcional das células IDG-SW3 após cultivo osteogênico. Alterações nos genes funcionais das células IDG-SW3 cultivadas com meio osteogênico nos tempos indicados. Abreviações: D = dia; W = semana. Os dados são representados como a média ± EPM. As alterações de dobras foram analisadas pelo método Ct, referindo-se ao gene da β-actina . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 2D | .3D | |
| Dificuldade de preparo | fácil | Média |
| Gradiente de nutrientes | ausente | presente |
| Arranjo do colágeno | monocamada | multiaxial discreta |
| Rigidez mecânica da MEC | alto | baixo |
| Faixa mecânica de ECM | unilateral | cercar |
| Motilidade celular | superfície plana | livre |
| Comunicação intercelular | insuficiente | suficiente |
Tabela 1: Comparação entre sistemas de cultura 2D e 3D para células IDG-SW3.
| Nomes | Sequências (5'- 3') |
| Pdpn-para | GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG |
| Pdpn-rev | GGTTGTACTCTCGTGTTCTCTG |
| Dmp1-para | CCCAGTTGCCAGATACCAC |
| Dmp1-rev | CACTATTTGCCTGTCCCTCTG |
| Sost-para | ACAACCAGACCATGAACCG |
| Sost-rev | CAGGAAGCGGGTGTAGTG |
| Fgf23-para | GGTGATAACAGGAGCCATGAC |
| Fgf23-rev | TGCTTCTGCGACAAGTAGAC |
| β-actina-para | ACCTTCTACAATGAGCTGCG |
| β-actina-rev | CTGGATGGCTACGTACATGG |
Tabela 2: Primers utilizados no ensaio de PCR em tempo real.
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Discussion
Um ponto crítico nesse protocolo é que as etapas 1 e 2 devem ser realizadas em gelo para evitar coagulação espontânea. Nesse método, a concentração final de colágeno I foi de 1,2 mg/mL. Assim, um volume ótimo de ddH2O deve ser calculado para corresponder aos diferentes colágenos de vários fabricantes.
In vivo, a osteocitogênese envolve um movimento polar de osteoblastos da superfície para o interior do osso trabecular14. Este protocolo libera as células do crescimento na matriz sem polaridade direcional. Naturalmente, a semeadura de células IDG-SW3 na superfície da matriz de gel livre de células é opcional. Entretanto, a concentração de colágeno prevista neste protocolo não é suficiente para formar uma superfície teoricamente plana para a infiltração osteoblástica. Diferentes proporções de colágeno I e matriz extracelular devem ser testadas para esse fim.
Em comparação com a do osteóide, a rigidez deste gel está longe de ser suficiente. Alguns artigos relatam o aumento da resistência dos géis pela adição de vários materiais químicos para melhor mimetizar a rigidez do osteóide in vivo 6,15. O benefício desse método é que o gel formado pode fornecer um meio com boa transparência para obtenção de imagens e rastreamento de células in situ, ao invés de utilizar métodos histológicos15. No entanto, é difícil satisfazer a transparência do material para aquisição de imagens e, ao mesmo tempo, garantir que as propriedades físicas e químicas in vitro possam mimetizar o osteóide. Portanto, mais modelos de cultura precisam ser explorados para abordar quaisquer questões científicas específicas.
Adicionalmente, as propriedades físico-químicas desse gel mineralizado IDG-SW3, incluindo as propriedades reológicas, foram introduzidas em estudo prévio16. Assim, este gel mineralizado biogênico formado por este método poderá ser útil como material biomédico para futuras pesquisas ortopédicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos à Dra. Lynda F. Bonewald por presentear a linhagem celular IDG-SW3. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82070902, 82100935 e 81700778) e pelo Projeto de Vela "Ciência e Inovação Tecnológica" de Xangai (21YF1442000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
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