Cultivo celular IDG-SW3 en matriz extracelular tridimensional

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de células IDG-SW3 en una matriz extracelular tridimensional (3D).

Resumen

Se considera que los osteocitos son células no proliferativas que se diferencian terminalmente de los osteoblastos. Los osteoblastos incrustados en la matriz extracelular ósea (osteoide) expresan el gen Pdpn para formar dendritas celulares y transformarse en preosteocitos. Más tarde, los preosteocitos expresan el gen Dmp1 para promover la mineralización de la matriz y, por lo tanto, transformarse en osteocitos maduros. Este proceso se denomina osteocitogénesis. IDG-SW3 es una línea celular bien conocida para estudios in vitro de osteocitogénesis. Muchos métodos anteriores han utilizado colágeno I como el componente principal o único de la matriz de cultivo. Sin embargo, además del colágeno I, el osteoide también contiene una sustancia fundamental, que es un componente importante para promover el crecimiento, la adhesión y la migración celular. Además, la sustancia de la matriz es transparente, lo que aumenta la transparencia del gel formado por colágeno I y, por lo tanto, ayuda a la exploración de la formación de dendritas a través de técnicas de imagen. Así, en este trabajo se detalla un protocolo para establecer un gel 3D utilizando una matriz extracelular junto con colágeno I para la supervivencia de IDG-SW3. En este trabajo se analizó la formación de dendritas y la expresión génica durante la osteocitogénesis. Después de 7 días de cultivo osteogénico, se observó claramente una extensa red de dendritas bajo un microscopio confocal de fluorescencia. La PCR en tiempo real mostró que los niveles de ARNm de Pdpn y Dmp1 aumentaron continuamente durante 3 semanas. En la semana 4, el microscopio estereoscópico reveló un gel opaco lleno de partículas minerales, consistente con el ensayo de fluorescencia de rayos X (XRF). Estos resultados indican que esta matriz de cultivo facilita con éxito la transición de osteoblastos a osteocitos maduros.

Introducción

Los osteocitos son células terminalmente diferenciadas derivadas de osteoblastos ^1,2. Una vez que el osteoblasto es enterrado por el osteoide, se somete a osteocitogénesis y expresa el gen Pdpn para formar preosteocitos, el gen Dmp1 para ^{mineralizar el osteoide y los} genes Sost y Fgf23 para funcionar como un osteocito maduro en el tejido óseo³. Aquí, se introduce un sistema de cultivo 3D para identificar la extensión de las dendritas y la expresión génica de marcadores en el proceso de osteocitogénesis.

Las célu....

Protocolo

Este protocolo es adecuado para el cultivo de células en cuatro pocillos de placas de 24 pocillos. Si se preparan varias muestras o placas, las cantidades de los reactivos deben aumentarse en consecuencia.

1. Preparación de la mezcla de colágeno I

NOTA: El colágeno I y la matriz de la membrana basal se gelifican rápidamente a temperatura ambiente. Por lo tanto, el colágeno debe manipularse en hielo (2 °C a 8 °C). Todas las puntas y tubos utilizados deben estar preenfriados a menos que se indique lo contrario. Todos los procedimientos deben realizarse en una capucha de seguridad.

1. Coloque....

Resultados

Después de la tinción de células vivas/muertas, las células se visualizaron utilizando un microscopio láser confocal. Todas las células eran calceína AM positivas (color verde), y casi no había células EthD-1 positivas (color rojo) en el campo, lo que indica que el sistema de gel producido por este método es altamente adecuado para la osteocitogénesis (Figura 1A, izquierda). Para determinar mejor la distribución espacial de las células, se eligió una imagen en pseudocolor para mostrar las de.......

Discusión

Un punto crítico en este protocolo es que los pasos 1 y 2 deben realizarse en hielo para evitar la coagulación espontánea. En este método, la concentración final de colágeno I fue de 1,2 mg/mL. Por lo tanto, se debe calcular un volumen óptimo de ddH₂O para que coincida con los diferentes colágenos de varios fabricantes.

In vivo, la osteocitogénesis implica un movimiento polar de los osteoblastos desde la superficie hacia el interior del hueso trabecular^14<.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.25% Tripsina-etilendiaminaácido tetraacético	Hidrocona	SH30042.01
Tubos de 15 mL	Corning, NY, EE. UU.	430791
7.5% (p/v) Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich, MO, EE. UU	S8761
ácido ascórbico	Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.	A4544
Colágeno I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
suero fetal bovino	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogeneizador	BiHeng  Biotecnología, Shanghái, China	Microscopía
	Carl  Zeiss, Oberkochen, Alemania	LSM 800
Kit de imágenes de células vivas/muertas	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel	matrix Corning, NY, EE. UU	. 356234
MEM (10X), sin glutamina	Thermo Fisher Scientific
paraformaldehído Sigma-Aldrich	, MO, EE. UU	tamponada
	Hyclone	SH30256.
	Carl  Zeiss, Oberkochen, Alemania	Zeiss Axio ZOOM. V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
fluorescencia de rayos	X EDAX, EE. UU	EAGLE III
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich, MO, EE. UU	G9422

. de fluorescencia confocal láser SKSI 21430079 . SOLUCIÓN SALINA con fosfato 158127 Microscopio estereoscópico FS . .