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Genetics

ई कोलाई में प्राकृतिक वैवाहिक प्लास्मिड द्वारा मध्यस्थ क्षैतिज जीन हस्तांतरण का पता लगाना

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64523
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1, 2
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

Summary

संयुग्मन दो अलग-अलग कोशिकाओं में प्लास्मिड डीएनए को जुटाकर क्षैतिज जीन हस्तांतरण की मध्यस्थता करता है, जिससे लाभकारी जीन के प्रसार की सुविधा मिलती है। यह काम संयुग्मित प्लास्मिड ट्रांसफर का कुशल पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि का वर्णन करता है, जो ट्रांसकोन्जेशन का पता लगाने के लिए वैवाहिक प्लास्मिड, दाता और प्राप्तकर्ता में अंतर मार्करों के उपयोग पर आधारित है।

Abstract

संयुग्मन ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में क्षैतिज जीन हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करने वाले मुख्य तंत्रों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। यह काम एक उदाहरण के रूप में दो स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले प्लास्मिड का उपयोग करके, स्वाभाविक रूप से होने वाले वैवाहिक प्लास्मिड के जुटाने के अध्ययन के तरीकों का वर्णन करता है। ये प्रोटोकॉल दाता, प्राप्तकर्ता और वैवाहिक प्लास्मिड में चयन योग्य मार्करों की अंतर उपस्थिति पर निर्भर करते हैं। विशेष रूप से, वर्णित विधियों में 1) प्राकृतिक वैवाहिक प्लास्मिड की पहचान, 2) ठोस संस्कृति में संयुग्मन दरों की मात्रा का परिमाणीकरण, और 3) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा ट्रांसकोन्जुगेंट प्राप्तकर्ताओं में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन और प्लास्मिड रिप्लिकॉन प्रकारों का नैदानिक पता लगाना शामिल है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल क्षैतिज जीन हस्तांतरण के विकासवादी पारिस्थितिकी का अध्ययन करने के संदर्भ में विकसित किए गए हैं, ताकि पर्यावरण में पाए जाने वाले बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन ले जाने वाले वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति की जांच की जा सके। संस्कृति में इन प्रयोगों में देखे गए वैवाहिक प्लास्मिड का कुशल हस्तांतरण सामान्य रूप से क्षैतिज जीन हस्तांतरण और विशेष रूप से एंटीबायोटिक प्रतिरोध के प्रसार को बढ़ावा देने वाले तंत्र के रूप में संयुग्मन की जैविक प्रासंगिकता पर प्रकाश डालता है।

Introduction

1946 में, लेडरबर्ग और टैटम1 ने एस्चेरिचिया कोलाई के -12 में एक यौन प्रक्रिया का वर्णन किया जिसे अब संयुग्मन के रूप में जाना जाता है। बैक्टीरियल संयुग्मन वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक जीवाणु कोशिका (दाता) प्रत्यक्ष सेल-टू-सेल संपर्क द्वारा यूनिडायरेक्शनल आनुवंशिक सामग्री को दूसरे सेल (प्राप्तकर्ता) में स्थानांतरित करती है। संयुग्मन मोटे तौर पर बैक्टीरिया 2,3 में वितरित किया जाता है, हालांकि संयुग्मन मशीनरी को व्यक्त करने वाली दाता कोशिकाओं का अंश आमतौर पर बहुत छोटाहोता है।

प्लास्मिड स्वायत्त रूप से प्रतिकृति एक्स्ट्राक्रोमोसोमल डीएनए तत्व हैं। प्लास्मिड प्रतिकृति और रखरखाव में शामिल जीन के अलावा, प्लास्मिड अक्सर पर्यावरणीय चुनौतियों के अनुकूलन में शामिल जीन का एक कार्गो ले जाते हैं, जैसे कि भारी धातुएं या एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्कमें 5. वैवाहिक प्लास्मिड विशेष जीन के एक सेट के साथ प्लास्मिड का एक वर्ग है जो प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को उनके हस्तांतरण की अनुमति देता है और स्थानांतरण 6 के बाद उनकी दृढ़ता का समर्थन करताहै। वैवाहिक प्लास्मिड फ़ाइलम स्यूडोमोनाडोटा (प्रोटीओबैक्टीरिया का पर्याय) में बैक्टीरिया में 21.8 केबी से 1.35 एमबी तक आकार में भिन्न होते हैं, जिसका औसत लगभग 100 केबी 5,7 होता है। उनके पास आम तौर पर कम कॉपी संख्या भी होती है, संभवतः मेजबान पर चयापचय बोझ को कम 8,9 रखने के लिए।

विशिष्ट वैवाहिक तंत्र में चार घटक होते हैं: स्थानांतरण की उत्पत्ति (ओरिट), एक रिलैक्सेज, एक प्रकार IV युग्मन प्रोटीन, और एक प्रकार IV स्राव प्रणाली (एक ट्यूब जैसी संरचना जिसे पिलस कहा जाता है जो दाताओं को प्राप्तकर्ताओं से संपर्क करने की अनुमति देता है)6. वैवाहिक प्लास्मिड ले जाने वाली कोशिकाओं का केवल एक बहुत छोटा अंश संयुग्मन मशीनरी4 को व्यक्त करता है, लेकिन अगर प्लास्मिड एक फिटनेस लाभ प्रदान करते हैं, तो ट्रांसकोनजुगेंट्स आबादी में तेजी से विस्तार कर सकते हैं। विभिन्न आवासों से एकत्र किए गए ई कोलाई आइसोलेट्स के 35% और 80% से अधिक के बीच जीन के साथ वैवाहिक प्लास्मिड होते हैं जो कम से कम एक एंटीबायोटिक10,11 के लिए प्रतिरोध प्रदान करते हैं; इसलिए, वैवाहिक प्लास्मिड द्वारा मध्यस्थ क्षैतिज जीन स्थानांतरण एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन12 के वैश्विक प्रसार को चलाने वाला एक प्रमुख तंत्र है।

प्रयोगशाला संस्कृति में किए गए संभोग प्रयोगों से पता चला है कि संयुग्मन आवृत्ति कई कारकों से प्रभावित होती है, जिसमें प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की प्रकृति, विकास चरण, कोशिका घनत्व, दाता-से-प्राप्तकर्ता अनुपात, चाहे संयुग्मन तरल या ठोस मीडिया, कार्बन, ऑक्सीजन, पित्त लवण, धातु सांद्रता, स्तनधारी कोशिकाओं की उपस्थिति, तापमान, पीएच और संभोग समय13,14 में आयोजित किया जाता है। 15.

यह काम किसी दिए गए मेजबान तनाव में वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, ठोस संस्कृति में संयुग्मन दरों को निर्धारित करने के लिए, और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में उनके हस्तांतरण को दोगुना करने के लिए। इन प्रोटोकॉल का उपयोग अनुसंधान के लिए उपयुक्त प्राकृतिक वैवाहिक प्लास्मिड की पहचान के लिए पहले कदम के रूप में किया जा सकता है। वे सरलीकृत चरणों की न्यूनतम संख्या का उपयोग करते हैं क्योंकि उन्हें पैमाने पर कई स्रोतों (पर्यावरणीय, कॉमेंसल और रोगजनक) से प्राप्त बैक्टीरिया में वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति को स्क्रीन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है (दर्जनों से सैकड़ों दाताओं तक)।

इसके अलावा, यह पता लगाने के लिए परीक्षण कि क्या किसी दिए गए वैवाहिक प्लास्मिड की लामबंदी पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक से स्वतंत्र है (यानी, चयन के तहत एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन की प्रासंगिकता) और विभिन्न पर्यावरणीय आइसोलेट्स में पाए जाने वाले दो वैवाहिक प्लास्मिड की संयुग्मन दरों की तुलना करने के लिए परीक्षण दिखाए गए हैं।

प्रासंगिक वैवाहिक प्लास्मिड (प्लास्मिड रिप्लिकॉन और एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन मेकअप) की आनुवंशिक संरचना के आधार पर, प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को संयुग्मन दर को प्रभावित करने की संभावना वाले विभिन्न कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

सामान्य प्रयोगात्मक डिजाइन:
संभोग प्रयोग स्थापित करने के लिए आवश्यक आवश्यक घटक दाता कोशिकाएं, एक प्राप्तकर्ता तनाव, और दाताओं (एंटीबायोटिक ए), प्राप्तकर्ताओं (एंटीबायोटिक बी), और ट्रांसकोनजुगेंट्स (एंटीबायोटिक ए और बी) का चयन करने के लिए ठोस मीडिया हैं। ट्रांसकोनजुगेंट्स प्राप्तकर्ता कोशिकाएं हैं जो दाता के वैवाहिक प्लास्मिड को स्थिर रूप से बनाए रखती हैं।

दाता कोशिकाएं एंटीबायोटिक (एंटीबायोटिक ए) के लिए प्रतिरोधी होती हैं और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं (एंटीबायोटिक बी) का चयन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर या मार्करों के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के जीनोमिक स्थान (यानी, चाहे वह गुणसूत्र में स्थित हो या दाता कोशिका के प्लास्मिड में स्थित हो) को प्राथमिकता से ज्ञात करने की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि प्राप्तकर्ता को एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों को जुटाना (प्रत्यक्ष दाता-प्राप्तकर्ता संपर्क के बाद) का अर्थ है कि दाता-प्रदान किए गए मार्कर प्लास्मिड में थे।

एक प्राप्तकर्ता तनाव (संयुग्मित प्लास्मिड लेने के लिए जाना जाता है) को दाता में मौजूद नहीं होने वाले स्थिर चयन योग्य मार्कर की आवश्यकता होती है; यह चयन योग्य मार्कर आम तौर पर गुणसूत्र में स्थित एंटीबायोटिक या बायोसाइड के लिए प्रतिरोधी होता है। संभोग प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले प्राप्तकर्ता का चयन महत्वपूर्ण है, क्योंकि कुछ ई कोलाई उपभेदों में वैवाहिक प्लास्मिड लेने की उनकी क्षमता भिन्नहोती है।

एक बार जब ये घटक स्थापित हो जाते हैं, तो कोई भी कॉलोनी जो दाता-प्राप्तकर्ता जोड़ी संपर्क के बाद दोनों एंटीबायोटिक दवाओं (ए और बी) के साथ मीडिया पर बढ़ती है, वह एक कथित ट्रांसकोनजुगेंट है (चित्रा 1)। यह माना जाता है कि दाता एंटीबायोटिक ए के साथ मीडिया में बढ़ सकते हैं, लेकिन एंटीबायोटिक बी के साथ मीडिया में नहीं बढ़ सकते हैं, और प्राप्तकर्ता एंटीबायोटिक बी के साथ मीडिया में बढ़ने में सक्षम हैं, लेकिन एंटीबायोटिक ए के साथ बढ़ने में सक्षम नहीं हैं। पहले परीक्षण में ट्रांसकोनजुगेंट कॉलोनियों में वैवाहिक प्लास्मिड में पाए जाने वाले जीनों का पता लगाना (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन [पीसीआर] जीन के प्रवर्धन, या अन्य तरीकों से) शामिल है। दूसरे परीक्षण में लैक्टोज चयापचय के आधार पर विभेदक कॉलोनी रंग मार्करों का उपयोग शामिल है। अंतर कॉलोनी रंग मैककॉन्की एगर के उपयोग से प्रकट होता है; आगर में लैक्टोज का उपयोग लैक्टोज-किण्वन (लाख +) सूक्ष्मजीवों द्वारा किण्वन स्रोत के रूप में किया जा सकता है। ये सूक्ष्मजीव कार्बनिक एसिड, विशेष रूप से लैक्टिक एसिड का उत्पादन करते हैं, जो पीएच को कम करते हैं। न्यूट्रल रेड मीडिया में शामिल एक पीएच संकेतक है जो ऑफ-व्हाइट से चमकदार लाल / गुलाबी में बदल जाता है क्योंकि पीएच 6.817 से नीचे गिर जाता है। इस प्रकार, ई कोलाई लैक्टोज-पॉजिटिव उपभेद मैककॉन्की एगर पर बड़ी गुलाबी कॉलोनियों का उत्पादन करते हैं, जबकि लैक्टोज-नकारात्मक उपभेद मैककॉनकी एगर पर हल्के पीले और छोटे उपनिवेशों का उत्पादन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: दाता उपभेदों में वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन का उपयोग किया जाता है। इस उदाहरण में, दाता एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के साथ एक वैवाहिक प्लास्मिड को वहन करता है जो एंटीबायोटिक ए के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है, लेकिन वे एंटीबायोटिक बी के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इसके विपरीत, प्राप्तकर्ता में एक क्रोमोसोमल प्रतिरोध निर्धारक होता है जो एंटीबायोटिक बी से सुरक्षा प्रदान करता है, लेकिन यह एंटीबायोटिक ए के लिए अतिसंवेदनशील होता है। ट्रांसकोनजुगेंट्स दोनों एंटीबायोटिक दवाओं (ए और बी) के लिए प्रतिरोधी होते हैं, क्योंकि उनके पास दाता का वैवाहिक प्लास्मिड है जो एंटीबायोटिक ए और प्राप्तकर्ता के गुणसूत्र के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है जो एंटीबायोटिक बी से सुरक्षा प्रदान करता है।

दाता-प्राप्तकर्ता जोड़ी (दी गई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत) के लिए संयुग्मन दर की गणना दाताओं की संख्या या प्राप्तकर्ताओं की संख्या से ट्रांसकोन्जुगेंट्स की संख्या को विभाजित करके की जा सकती है; पहली दर दाता16,18 द्वारा संयुग्मन मशीनरी की कार्यात्मक अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करने वाले दाता कोशिकाओं के अंश को इंगित करती है, जबकि दूसरी दर प्राप्तकर्ता की वैवाहिक प्लास्मिड19,20 लेने की क्षमता को इंगित करती है। इस अध्ययन में, जब तक अन्यथा नहीं कहा गया है, संयुग्मन दर प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के अंश का प्रतिनिधित्व करती है जो ट्रांसकोनजुगेंट (यानी, प्रति प्राप्तकर्ता दर) बन जाते हैं।

यहां, दो स्वतंत्र संभोग प्रयोगों की सूचना दी गई है, जिसमें एक ई कोलाई प्राप्तकर्ता और दो ई कोलाई दाता शामिल हैं। इसके अलावा, दाताओं में से एक के लिए ट्रांसकोनजुगेंट्स का चयन करने के लिए विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किया गया था ताकि यह पुष्टि की जा सके कि एक एकल मल्टीड्रग-प्रतिरोधी प्लास्मिड को वैवाहिक प्लास्मिड में पाए जाने वाले किसी भी एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के साथ चुना जा सकता है।

इस काम में उपयोग किए जाने वाले दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों को इस प्रयोगात्मक प्रणाली के सभी घटकों को समझने के लिए पूरी तरह से अनुक्रमित किया गया है; हालांकि, इन प्रोटोकॉल को अज्ञात अनुक्रम के मेजबानों में वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, और इसका उपयोग इस प्रयोगात्मक संदर्भ में भी किया जा सकता है; हालांकि, इस मामले में, संबंधित जीन पहले अनुक्रमित होते हैं।

प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले दाता और प्राप्तकर्ता उपभेद निम्नलिखित हैं:

दाता 1. ई कोलाई SW4955 बैटन रूज (एलए, यूएसए) में एक झील में एकत्र किया गया था। इसमें 134,797 बीपी वैवाहिक प्लास्मिड (पी 134797) है, जिसमें इंकफिक (एफआईआई) और इंकएफआईबी (एपी001918) रिप्लिकॉन हैं। इस वैवाहिक प्लास्मिड में जीन होते हैं जो तीसरी पीढ़ी के सेफलोस्पोरिन (बीएलएसीटीएक्स-एम -55), एमिनोग्लाइकोसाइड्स (एएसी (3)-आईआईए और एडीए 1), फेनिकॉल्स (कैटए 2), टेट्रासाइक्लिन (टेट (ए)), ट्राइमेथोप्रिम (डीएफआरए 14), और सल्फोनामाइड्स (सुल 3) के प्रतिरोध प्रदान करते हैं। p134797 के पूर्ण मानचित्र के लिए, कृपया चित्र 2A देखें। ई कोलाई एसडब्ल्यू 4955 लैक्टोज-पॉजिटिव है, जो मैककॉन्की एगर पर गुलाबी कॉलोनियों का उत्पादन करता है।

दाता 2. ई कोलाई SW7037 झील एरी (ओटावा काउंटी, ओएच, यूएसए) में एकत्र किया गया था। इसमें 101,718 बीपी संयुग्मित प्लास्मिड (पी 101718) होता है, जिसमें एक इंकआई 1-आई (अल्फा) रिप्लिकॉन होता है। इस वैवाहिक प्लास्मिड में एक जीन होता है जो बीटा-लैक्टम (बीएलएसीएमवाई -2) के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है। p101718 के पूर्ण मानचित्र के लिए, कृपया चित्र 2B देखें। ई कोलाई एसडब्ल्यू 7037 लैक्टोज-पॉजिटिव भी है, जो मैककॉन्की एगर पर गुलाबी कॉलोनियों का उत्पादन करता है।

Figure 2
चित्रा 2: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले वैवाहिक प्लास्मिड का आनुवंशिक मानचित्र। (ए) प्लास्मिड पी 134797, ई कोलाई स्ट्रेन एसडब्ल्यू 4955 में पाया जाने वाला वैवाहिक प्लास्मिड। (बी) प्लास्मिड पी 101718, ई कोलाई स्ट्रेन एसडब्ल्यू 7037 में पाया जाने वाला वैवाहिक प्लास्मिड। एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को नीले रंग में हाइलाइट किया जाता है, और वैवाहिक तंत्र से संबंधित जीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राप्तकर्ता. ई कोलाई LMB100 प्राप्तकर्ता के रूप में प्रयोग किया जाता है। यह एक प्लास्मिडलेस स्ट्रेन है जो रिफैम्पिन (100 मिलीग्राम / एल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एल) के लिए प्रतिरोधी है। दो एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध होने से दाता में उत्पन्न प्रतिरोध उत्परिवर्तन की संभावना कम हो जाती है जो परिणामों की व्याख्या में हस्तक्षेप करेगी। इसके अलावा, ई कोलाई एलएमबी 100 लैक्टोज-नकारात्मक है, और इसे दो दाता उपभेदों से अलग किया जा सकता है क्योंकि यह मैककॉन्की एगर पर हल्के पीले और छोटे उपनिवेशों (बड़ी, गुलाबी कॉलोनियों के विपरीत) का उत्पादन करता है।

जब दाता लैक्टोज-नकारात्मक होता है, तो हम लैक्टोज-पॉजिटिव प्राप्तकर्ता (जैसे, ई कोलाई जे 53) का उपयोग करने की सलाह देते हैं। एलएमबी 100 और जे 53 उपभेद उपयोग के लिए अन्य प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध हैं। कृपया एक पते और FedEx नंबर के साथ डॉ गेरार्डो कोर्टेस-कोर्टेस को एक अनुरोध भेजें।

दाताओं, प्राप्तकर्ताओं और ट्रांसकॉन्जुगेंट्स का चयन करने और गिनने के लिए आवश्यक ठोस मीडिया 100 मिमी व्यास में पेट्री व्यंजन में मैककॉनकी एगर है। निम्नलिखित एंटीबायोटिक दवाओं के अतिरिक्त की आवश्यकता है: (i) मीडिया ए: कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम / एल) दाताओं की गिनती करने के लिए और यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्राप्तकर्ता इस एंटीबायोटिक के साथ नहीं बढ़ सकते हैं। (ii) मीडिया बी: रिफैम्पिन (100 मिलीग्राम / एल) + स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एल) प्राप्तकर्ताओं की गिनती करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि दाता इन दो एंटीबायोटिक दवाओं में नहीं बढ़ सकते हैं। (iii) ट्रांसकोनजुगेंट्स प्राप्त करने और गिनने के लिए मीडिया एबी: कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम/लीटर) + रिफैम्पिन (100 मिलीग्राम/एल) + स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम/एल)। (iv) मीडिया सी: अध्ययन किए गए सभी आइसोलेट्स को लागू करने के लिए कोई एंटीबायोटिक्स नहीं।

ई कोलाई एसडब्ल्यू 4955 और ई कोलाई एसडब्ल्यू 7037 से ई कोलाई एलएमबी 100 तक वैवाहिक प्लास्मिड की संयुग्मन दर की तुलना की जाती है। इसके अलावा, पी 134797 वैवाहिक प्लास्मिड (एसडब्ल्यू 4955 स्ट्रेन) के मामले में, एंटीबायोटिक कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम / एल) को जेंटामाइसिन (2 मिलीग्राम / एल), क्लोरैम्फेनिकॉल (25 मिलीग्राम / एल), टेट्रासाइक्लिन (10 मिलीग्राम / एल), ट्राइमेथोप्रिम (20 मिलीग्राम / एल), या सल्फामेथोक्साज़ोल (100 मिलीग्राम / एल) द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है ताकि यह स्थापित किया जा सके कि चयन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर का कोई प्रभाव पड़ता है या नहीं।

Protocol

1. विधि 1: संयुग्मन

  1. दिन 1: दाताओं और प्राप्तकर्ता को आकर्षित करें। स्ट्रीक मीडिया सी पर ग्लिसरॉल स्टॉक से अलग है (मैककॉनकी एगर बिना एंटीबायोटिक दवाओं के), और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है।
    नोट: यह कदम यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि प्रयोग शुद्ध आइसोलेट्स के साथ आयोजित किया जाता है और कॉलोनियों के रंग से लैक्टोज फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए।
  2. दिन 2: प्रत्येक दाता और प्राप्तकर्ता के लिए 14.0 एमएल संस्कृति ट्यूब लेबल करें। प्रत्येक दाता और प्राप्तकर्ता की एक एकल कॉलोनी का चयन करें, और उन्हें रात भर (18 घंटे) अलग-अलग 14.0 एमएल कल्चर ट्यूबों में उगाएं, जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एमएल मुलर हिंटन शोरबा होता है और 200 आरपीएम पर हिलता है।
    नोट: उपयोग किए गए उपभेदों में, स्थिर चरण 18 घंटे की रात भर की संस्कृति के बाद पहुंच जाता है।
  3. दिन 3: खारा घोल के 900 μL और रात भर की संस्कृति के 1:10 कमजोर पड़ने और रात भर की संस्कृति के 100 μL का उपयोग करके प्रत्येक दाता और प्राप्तकर्ता (कोई भंवर नहीं) की रात भर की संस्कृति के 600 nm (OD600) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
  4. प्रत्येक दाता और प्राप्तकर्ता के ऑप्टिकल घनत्व को 2.0 (ओडी600 = 2.0) में स्टरलाइज़्ड खारा घोल (पानी में 0.85% NaCl) के साथ समायोजित करें।
    नोट: OD600 = 2.0 के साथ E. coli की रातोंरात संस्कृति में 1.6 x 109 CFU / mL है।
  5. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को "संभोग ट्यूब" लेबल करें, जो दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों को दर्शाता है। प्रत्येक दाता और प्राप्तकर्ता के समायोजित (OD600 = 2.0 ) निलंबन के 500 μL को स्थानांतरित करें, और उन्हें संभोग ट्यूब में रखें (इस संभोग ट्यूब में प्रत्येक दाता और प्राप्तकर्ता का 0.8 x 109 CFU / mL होगा)। धीरे से व्युत्क्रमण द्वारा संभोग ट्यूब मिलाएं।
  6. कमरे के तापमान पर 500 x g पर 10 मिनट के लिए संभोग ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. गोली को परेशान किए बिना, संयुग्मन ट्यूब के 800 μL को बाहर निकालें। संयुग्मन ट्यूब में 200 μL बचा होना चाहिए।
    नोट: निलंबन में बैक्टीरिया को निष्क्रिय करने के लिए सुपरनैटेंट को 10% ब्लीच कंटेनर में फेंक दें।
  8. एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे (रात भर) के लिए संभोग ट्यूब को इनक्यूबेट करें। संभोग इनक्यूबेशन समय के दौरान होता है।
    नोट: यह कदम बिना हिलाए किया जाना चाहिए ताकि वैवाहिक पिली को तोड़ा न जा सके।
  9. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, मीडिया B पर दाताओं और मीडिया A पर प्राप्तकर्ताओं की रातोंरात संस्कृति को लागू करें।
  10. दिन 4: संभोग ट्यूब और भंवर में 800 μL खारा घोल जोड़ें (यह संभोग मिश्रण को 1 एमएल में पुनर्गठित करता है)।
    नोट: वोर्टेक्सिंग संभोग बैक्टीरिया को अलग करता है और सीएफयू / एमएल को मापने के लिए संस्कृति को समरूप करता है।
  11. संभोग मिश्रण के 1: 10 कमजोर पड़ने (1 x10 0 से 1 x 10-7 तक) तैयार करें। प्लेट 100 μL मीडिया A और मीडिया B पर 10-5 से 10-7 तक कमजोर पड़ जाता है, और मीडिया AB पर सभी कमजोर पड़ जाता है।
    नोट: Dlution 100 साफ ट्यूब को संदर्भित करता है।
  12. प्लेटों को उल्टा इनक्यूबेटर में रखने से पहले सूखने दें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे (रात भर) के लिए इनक्यूबेट करें।
  13. दिन 5: यह सुनिश्चित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रणों का निरीक्षण करें कि दाताओं की शुद्ध रातोंरात संस्कृतियों की लकीरें मीडिया बी पर नहीं बढ़ीं, और प्राप्तकर्ताओं की शुद्ध रातोंरात संस्कृति मीडिया ए पर नहीं बढ़ी।
  14. कॉलोनियों और कमजोर पड़ने की संख्या रिकॉर्ड करें जिन्हें गिना जा सकता है:
    1. मीडिया ए में उपनिवेशों की गणना करें; ये दाता हैं। कॉलोनियों को गुलाबी होना चाहिए (चित्रा 3 ए, बी)।
    2. मीडिया बी में उपनिवेशों की गणना करें; ये प्राप्तकर्ता और ट्रांसकॉन्जुगेंट्स हैं। कॉलोनियों को हल्का पीला होना चाहिए (चित्रा 3 सी)।
    3. मीडिया एबी में उपनिवेशों की गणना करें; ये ट्रांसकोन्जुगेट्स हैं। कॉलोनियों को हल्के पीले रंग का होना चाहिए।
      नोट: एक गिनने योग्य प्लेट का चयन करें। एक गणना योग्य प्लेट में 30 और 300 कॉलोनियों के बीच होती है (300 से अधिक कॉलोनियों को गिनना मुश्किल होगा, और 30 से कम कॉलोनियों को मूल नमूने का सटीक प्रतिनिधित्व प्रस्तुत करने के लिए नमूना आकार में बहुत छोटा माना जाता है)।
  15. प्रति दाता या प्रति प्राप्तकर्ता संयुग्मन की आवृत्ति की गणना करें
    प्रति दाता संयुग्मन की आवृत्ति = (ट्रांसकोनजुगेंट [मीडिया एबी]) का सीएफयू / एमएल / (सीएफयू / एमएल दाताओं का [मीडिया ए]) x 100
    प्रति प्राप्तकर्ता संयुग्मन की आवृत्ति = (ट्रांसकोनजुगेंट [मीडिया एबी]) का सीएफयू / एमएल / (प्राप्तकर्ताओं और ट्रांसकोनजुगेंट्स [मीडिया बी]) का सीएफयू / एमएल) x 100
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए संयुग्मन आवृत्ति की गणना प्राप्तकर्ता की संख्या से विभाजित ट्रांसकोनजुगेंट्स के रूप में की गई थी, जिसे 100 से गुणा किया गया था। साहित्य के अनुसार, संयुग्मन की परिणामी मात्रा को एक्सकोनजुगेंट आवृत्ति, जीन स्थानांतरण आवृत्ति, संयुग्मन आवृत्ति, पुनः संयोजक उपज, प्लास्मिड हस्तांतरण दक्षता, कुल जीवाणु गणना के आधार पर संयुग्मन आवृत्ति, ट्रांसकोन्जुगेंट्स का अनुपात, प्राप्तकर्ता आबादी में ट्रांसकोन्जुगेंट्स का अंश, ट्रांसकोनजुगेंट आवृत्ति, संयुग्मन आवृत्ति, संयुग्मन दर का लघुगणक, हस्तांतरण दर स्थिर, संयुग्मन दर प्रति संभोग जोड़ी, संयुग्मन दर के रूप में नामित किया जा सकता है। संयुग्मन गुणांक, या संयुग्मन दक्षता20. यह प्रोटोकॉल संयुग्मन दक्षता शब्द को संदर्भित करता है।
  16. -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल स्टॉक में ट्रांसकोनजुगेंट्स स्टोर करें। ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करने के लिए उप-चरणों का पालन करें।
    1. ट्रांसकोन्जुगेंट्स की एक एकल कॉलोनी का चयन करें और उन्हें रात भर (18 घंटे) 5.0 एमएल कल्चर ट्यूबों में उगाएं, जिसमें 2 एमएल म्यूलर हिंटन शोरबा होता है, जो कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम / एल) के साथ पूरक होता है, 37 डिग्री सेल्सियस पर और 200 आरपीएम पर हिलता है।
    2. लेबल क्रायोजेनिक शीशियों, ट्रांसकोनजुगेंट के नाम को इंगित करते हुए, निम्नानुसार: टीसी + दाता का नाम + मीडिया ए में चयन का एंटीबायोटिक (क्योंकि वे ट्रांसकोनजंट्स हैं, यह ज्ञात है कि उनकी पृष्ठभूमि प्राप्तकर्ता तनाव है, जो पहले से ही स्ट्रेप्टोमाइसिन और रिफैम्पिन के लिए प्रतिरोधी है, लेकिन बीटा-लैक्टम प्रतिरोध जीन वाले प्लास्मिड को भी परेशान करता है); उदाहरण के लिए, TCU1Carb। एक ही दाता से एक से अधिक ट्रांसकोन्जुगेंट को संग्रहीत करने की आवश्यकता होने पर निरंतर संख्या जोड़ें (उदाहरण के लिए, TCU1Carb1, TCU1Carb2, आदि)।
    3. रात भर की संस्कृति के 1 एमएल को 50% ग्लिसरॉल (वी / वी; अंतिम ग्लिसरॉल एकाग्रता 25%) के 1 एमएल में स्थानांतरित करें और धीरे से व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण करें। क्रायोजेनिक शीशियों को सूखी बर्फ पर 15 मिनट के लिए रखें और भविष्य के प्रयोगों के लिए क्रायोवियल्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  17. डीएनए निष्कर्षण के लिए, मुलर हिंटन एगर पर ग्लिसरॉल स्टॉक से ट्रैसनकोनजुगेंट्स को कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम / एल) के साथ पूरक किया जाता है, और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है; तो, चरण 2.1 से सिफारिशों का पालन करें।

2. विधि 2: ई कोलाई ट्रांसकोनजुगेंट्स में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन और प्लास्मिड रिप्लिकॉन को बढ़ाने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)

नोट: पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) 1983 में डॉ कैरी मुलिस द्वारा विकसित किया गया था। पीसीआर विशिष्ट प्राइमरों पर निर्भर करता है (किसी दिए गए डीएनए अनुक्रम के पूरक डीएनए का एक छोटा टुकड़ा जो एक बिंदु के रूप में कार्य करता है जिस पर प्रतिकृति आगे बढ़ सकती है, आमतौर पर लंबाई में 20-40 न्यूक्लियोटाइड और आदर्श रूप से 40% -60% की गुआनिन-साइटोसिन सामग्री के साथ), जो एक विकृत, डबल-फंसे डीएनए टेम्पलेट के विपरीत किस्में पर लगाए जाते हैं और थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ के माध्यम से विस्तारित होते हैं। इस प्रकार प्रतिक्रियाओं के अगले चक्र के लिए एक अतिरिक्त टेम्पलेट उत्पन्न करना, जिससे मूल टेम्पलेट 21 का घातीय प्रवर्धनहोता है। इस प्रोटोकॉल में, संयुग्मित प्लास्मिड में मौजूद रिप्लिकॉन और प्रतिरोध जीन को ट्रांसकोनजुगेंट प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में स्थानांतरण की पुष्टि करने के लिए प्रवर्धित किया गया था।

  1. डीएनए निष्कर्षण
    1. वैवाहिक प्लास्मिड द्वारा किए गए प्रतिरोध जीन के हस्तांतरण का पता लगाने के लिए, एक टेम्पलेट के रूप में ट्रांसकोनजुगेंट डीएनए का उपयोग करें। बैक्टीरियल सेल की दीवारों को हटाने के लिए सरल फोड़ा तैयारी निष्कर्षण का उपयोग करें।
      नोट: सरल फोड़ा तैयारी निष्कर्षण जीवाणु कोशिका की दीवारों को अलग करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण है। इस निष्कर्षण में जीनोमिक डीएनए के साथ मिश्रित प्लास्मिड डीएनए होता है, लेकिन जैसा कि प्राइमरों को रुचि के विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों के अनुसार डिज़ाइन किया गया है, यह टेम्पलेट पीसीआर के लिए भी उपयोगी है। प्लास्मिड को विशेष रूप से शुद्ध भी किया जा सकता है, हालांकि प्लास्मिड आकार22 बढ़ने के साथ पैदावार कम हो जाती है। यह एक सुविधाजनक स्टॉपिंग पॉइंट है। डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. पीसीआर
    1. यह देखते हुए कि प्रयोग में नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण है, 1.5 एमएल ट्यूब में सभी प्रतिक्रियाओं के लिए एक पूल स्थापित करना फायदेमंद है। जीन और नमूने (जैसे, OXA-U1) के नाम के साथ 1.5 एमएल ट्यूब और आवश्यक पीसीआर ट्यूबों को "पूल" के रूप में लेबल करें।
    2. पीसीआर अभिकर्मकों को निम्नलिखित क्रम में 1.5 एमएल ट्यूब में रखें: बाँझ पानी, 2x मास्टर मिक्स, प्राइमर, और पोलीमरेज़ (टेम्पलेट डीएनए को छोड़कर) ( तालिका 1 देखें)। धीरे से कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। पूरे समय बर्फ पर रखें।
      नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण या अभिकर्मकों को दूषित करने से बचने के लिए दस्ताने पहनें। अभिकर्मक संदूषण को रोकने के लिए एक ही क्षेत्र में अभिकर्मकों को खोलने और मिश्रण करने और नमूने को संभालने से बचने की कोशिश करें। न्यूक्लियस गतिविधि और निरर्थक प्राइमिंग को दबाने के लिए अभिकर्मकों को बर्फ की बाल्टी में रखें। प्रतिक्रिया स्थापित करने से पहले उन्हें पूरी तरह से पिघलने दें। पूरे प्रयोग के दौरान अभिकर्मकों को बर्फ पर रखें। टैक पोलीमरेज़ को अंत में जोड़ा जाता है क्योंकि यह पीएच परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील है; गिरावट या मिसफोल्डिंग से बचने के लिए इसे बफर करने की आवश्यकता है। प्राइमरों का अनुक्रम तालिका 2-एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन-और तालिका 3-रिप्लिकॉन 23,24,25,26,27,28 में सूचीबद्ध है।
    3. टेम्पलेट डीएनए को संबंधित ट्यूब में जोड़ें। पीसीआर ट्यूबों पर बुलबुले और सुरक्षित कैप पेश करने से बचें।
    4. पीसीआर ट्यूबों को थर्मल साइकिलर में रखें।
    5. प्रोग्राम प्रारंभ करें। तालिका 2 (प्रतिरोध जीन) और तालिका 3 (रिप्लिकॉन्स) में प्रत्येक जीन के लिए सूचीबद्ध प्रोग्राम सेटिंग्स देखें।
      नोट: रन के बाद नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए पीसीआर प्रोग्राम सेट करें।
      1. रिप्लिकॉन्स के लिए पीसीआर स्थितियां: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण का एक चक्र, इसके बाद 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 30 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाव, और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक चक्र का अंतिम विस्तार।
        नोट: ये कैराटोली एट अल.29 द्वारा मानकीकृत शर्तें हैं।
    6. जब प्रोग्राम समाप्त हो जाता है, तो पीसीआर ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह एक सुविधाजनक रोक बिंदु है। पीसीआर उत्पादों को -20 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है
    7. 250 एमएल फ्लास्क में 0.6 ग्राम अगारोस का वजन करके और 60 एमएल 1x Tris-एसीटेट-ईडीटीए (टीएई) बफर जोड़कर 1% अगारोस जेल तैयार करें (यदि एक अलग जेल आकार की आवश्यकता हो तो अभिकर्मकों को समायोजित करें)। फ्लास्क के ऊपर फैलने वाले अगारोस से बचने के लिए माइक्रोवेव में अगारोस को सावधानीपूर्वक और धीरे-धीरे पिघलाएं, और इसे लगभग 55 डिग्री सेल्सियस (10-15 मिनट) तक ठंडा होने दें।
      1. अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी और विश्लेषणात्मक ग्रेड अभिकर्मकों का उपयोग करके सभी अभिकर्मकों को तैयार करें:
      2. टीएई 50एक्स बफर (ट्रिस बेस, एसिटिक एसिड और ईडीटीए) (1 एल): 121.1 ग्राम ट्रिस बेस + 372.24 ग्राम ईडीटीए मिलाएं, और 500 एमएल आसुत पानी जोड़ें। चुंबकीय हलचल के साथ घुलें। एसिटिक एसिड के 57.1 एमएल जोड़ें, और 1,000 एमएल की कुल मात्रा में आसुत पानी जोड़ें।
      3. 15 पीएसआई, 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आटोक्लेव करें, और 6 महीने तक तैयार होने तक कमरे के तापमान पर रखें।
      4. टीएई 1 एक्स बफर (1 एल): टीएई 50 एक्स बफर के 20 एमएल को 980 एमएल आसुत जल के साथ मिलाएं और मिलाएं।
    8. एक फ्यूम हुड के नीचे, पिघले हुए अगारोस में 6 μL SYBR ग्रीन जोड़ें, मिलाएं, और ट्रे (और कंघी) में डालें, जिसे पहले चिपकने वाले टेप के साथ सील किया गया था ताकि फैलाव से बचा जा सके। जेल को 15-25 मिनट के लिए सेट होने दें जब तक कि टर्बिडिटी दिखाई न दे।
      नोट: अन्य वैकल्पिक रंग भी उपलब्ध हैं 30,31,32,33.
    9. चिपकने वाला टेप हटा दें और जेल को वैद्युतकणसंचलन कक्ष में रखें, जेल को कवर करने के लिए पर्याप्त 1x TAE बफर जोड़ें।
    10. प्रत्येक प्रतिक्रिया के 25 μL के साथ 6x DNA जेल लोडिंग डाई के 5 μL मिलाएं। धीरे से कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
      नोट: अपेक्षित उत्पाद की कल्पना करने के लिए सभी पीसीआर उत्पाद को जेल में लोड करने की आवश्यकता नहीं है (डाई की मात्रा को अनुरूप रूप से समायोजित करें)। शेष पीसीआर नमूना कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सहेजा और संग्रहीत किया जा सकता है।
    11. मिश्रण को कुओं में लोड करें (बुलबुले पेश करने से बचें) और कक्ष का ढक्कन नीचे रखें।
      नोट: पहले नमूने को दूसरे कुएं में लोड करें (पहले को सीढ़ी पर आरक्षित करें), नकारात्मक नियंत्रण से शुरू करें।
    12. पहले कुएं में 1 केबी डीएनए सीढ़ी के 4 μL लोड करें।
    13. वैद्युतकणसंचलन को 120 वी, 400 एमए और 60 मिनट पर चलाएं।
    14. यूवी प्रकाश (यूवी इलुमिनेटर के साथ) के तहत जेल की कल्पना करें और छवि रिकॉर्ड करें।
      नोट: यदि एक पीसीआर उत्पाद मौजूद है, तो एक मानक यूवी ट्रांसिल्युमिनेटर, एक दृश्य-प्रकाश ट्रांसिलुमिनेटर या लेजर-आधारित स्कैनर का उपयोग करके दाग वाले डीएनए बैंड का पता लगाया जा सकता है।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक समाधान वॉल्यूम 50 μL प्रतिक्रिया में जोड़ा गया (1x) आखिरी उदाहरण: वॉल्यूम उदाहरण: वॉल्यूम उदाहरण: प्रत्येक ट्यूब में जोड़ा गया वॉल्यूम अंतिम वॉल्यूम 50 μL मात्रा सकारात्मक नियंत्रण में जोड़ा गया नकारात्मक नियंत्रण में जोड़ा गया वॉल्यूम
एकाग्रता 1x में जोड़ा गया 3x (पूल) में जोड़ा गया
बाँझ पानी - 21.5 μL (q.s. to 50 μL) - 21.5 μL 64.5 μL 49 μL/tube 49 μL/tube 49 μL/tube
मास्टर मिश्रण 2x 25 μL 1x 25 μL 75 μL
फॉरवर्ड प्राइमर 25 μM 1 μL 0.5 μM 1 μL 3 μL
रिवर्स प्राइमर 25 μM 1 μL 0.5 μM 1 μL 3 μL
टेम्पलेट डीएनए चर (100–200 ng/μL) चर (1 μL) परिवर्तनशील 0.5 μL 1.5 μL
पोलीमरेज़ 5 Units/μL 0.5 μL 2.5 इकाइयाँ - - 1 μL (transconjugant) 1 μL (दाता) 1 μL (recipient)
नोट: q.s. क्वांटम सैटिस के लिए एक लैटिन संक्षिप्त नाम है जिसका अर्थ है कि आवश्यक राशि।

तालिका 1: पीसीआर अभिकर्मक और तीन प्रतिक्रियाओं के लिए पूल (एक उदाहरण)। 

प्राइमर (अनुक्रम 5 ' - 3 ' अभिविन्यास में सूचीबद्ध) पीसीआर कार्यक्रम अपेक्षित आकार
(बीपी) रेफरी।
BLACTX-M समूह 1 94 oC 7 मिनट (864) 23
CTX-M: GGTTAAAATCACTGCGYC 94 oC 50 s (35 चक्र)
सीटीएक्स-एम: टीटीजीजीटीजीएटीजीटीजीसीजीसी 50 oC 40 s
68 oC 1 मिनट
68 oC 5 मिनट
BLACMY-2 95 oC 3 मिनट (1855) 24
सीएमवाई -2-एफ: GATTCCTTGGACTCTCAG 95 oC 30 s (30 चक्र)
सीएमवाई -2-आर: TAAAACCAGGTTCCGAGACCAGC 53 oC 30 s
72 oC 30 s
72 oC 3 मिनट
aac(3')-II 94 oC 5 मिनट (237) 25
एएसी (3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC 94 oC 30 s (32 चक्र)
एएसी (3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGTA 60 oC 45 s
72 oC 2 मिनट
72 oC 8 मिनट
AadA 94 oC 5 मिनट (283) 26
aadA1: GCAGCCAATGACATTCTTG 94 oC 1 मिनट (35 चक्र)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG 60 oC 1 मिनट
72 oC 1 मिनट
72 oC 8 मिनट
sul-3 94 oC 5 मिनट (799) 27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94 oC 1 मिनट (30 चक्र)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTGGA 51 oC 1 मिनट
72 oC 1 मिनट
72 oC 5 मिनट
टेट (ए) 95 oC 5 मिनट (957) 28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95 oC 30 s (23 चक्र)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT 62 oC 30 s
72 oC 45 s
72 oC 7 मिनट
dfr एक 95 oC 5 मिनट (302) यह काम
dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG 95 oC 1 मिनट (30 चक्र)
55 oC 1 मिनट
dfrA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG 72 oC 1 मिनट
72 oC 7 मिनट
catA2 95 oC 5 मिनट
catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTC 95 oC 1 मिनट (25 चक्र) (225) यह काम
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATATAAT 60 oC 1 मिनट
72 oC 1 मिनट
72 oC 7 मिनट

तालिका 2: नैदानिक प्रतिरोध जीन को बढ़ाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर और पीसीआर प्रोग्राम। 

Replicon प्राइमर (अनुक्रम 5 ' - 3 ' अभिविन्यास में सूचीबद्ध) लक्ष्य पीसीआर कार्यक्रम अपेक्षित आकार (बीपी)
IncFIB एफ: टीसीटीजीटीजीटीसीसीएसी repA 94 oC 5 मिनट 683
आर: सीटीसीसीसीजीटीसीजीसीटीसीटीसीएजीजीसीएटीटी 94 oC 1 मिनट (30 चक्र)
60 oC 30 s
IncFIC F: GTGAACTGGCAGATGAGAGAGAGAGG repA2 72 oC 1 मिनट 262
आर: टीटीसीटीसीसीटीसीजीटीसीजीसीसीएएटीएजीएटी 72 oC 5 मिनट
IncI1 एफ: सीजीएएजीसीसीजीजीएसीजीसीएजीए RNAI 139
आर: टीसीजीटीसीजीटीटीसीजीसीएजीटीटीजीटी

तालिका 3: पीसीआर-आधारित रिप्लिकॉन टाइपिंग29 द्वारा प्लास्मिड पी 134797 और पी 101718 को वर्गीकृत करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर और पीसीआर प्रोग्राम। 

Representative Results

यह देखते हुए कि दाताओं एसडब्ल्यू 4955 और एसडब्ल्यू 7037 को अनुक्रमित किया गया है, इन दो दाता उपभेदों को उनके जीनोमिक अनुक्रम में पहचाने गए प्रतिरोध जीन प्रोफाइल के अनुरूप प्रतिरोध फेनोटाइप होने की उम्मीद है। प्लास्मिड पी 134797 (एसडब्ल्यू 4955 से) में जीन होते हैं जो तीसरी पीढ़ी के सेफलोस्पोरिन (बीएलएसीटीएक्स-एम -55) के प्रतिरोध प्रदान करते हैं, और एमिनोग्लाइकोसाइड्स (एएसी (3)-आईए और एएडीए 1), फिनिकोल्स (कैटा 2), टेट्रासाइक्लिन (टेट (ए)), ट्राइमेथोप्रिम (डीएफआरए 14), और सल्फोनामाइड्स (सल्3) के प्रतिरोध; एसडब्ल्यू 4955 गुणसूत्र में कोई एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन नहीं पाया गया। प्लास्मिड पी 101718 (एसडब्ल्यू 7037 से) केवल एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन (बीएलएसीएमवाई -2) को वहन करता है, जो तीसरी पीढ़ी के सेफलोस्पोरिन (बीएलएसीटीएक्स-एम -55) के प्रतिरोध को प्रदान करने की उम्मीद करता है। फिर से एसडब्ल्यू 7037 क्रोमोसोम में कोई एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन नहीं पाया गया।

संभोग के बाद, ऊपर उल्लिखित सभी प्रतिरोध जीनों को प्रभावित करने वाले दो वैवाहिक प्लास्मिड के हस्तांतरण का पता लगाने की उम्मीद थी। सकारात्मक संयुग्मन का पता लगाने का तात्पर्य है कि ट्रांसकोनजुगेंट्स के रूप में पहचाने जाने वाले प्राप्तकर्ताओं को वैवाहिक प्लास्मिड का अधिग्रहण करना चाहिए था। ट्रांसकोनजुगेंट्स (जैसा कि पीसीआर द्वारा पता लगाया गया है) में वैवाहिक प्लास्मिड के लिए नैदानिक प्रतिरोध जीन की उपस्थिति भी अपेक्षित थी।

यहां वर्णित तरीकों को स्पष्ट करने के लिए, संयुग्मन द्वारा प्लास्मिड डीएनए को स्थानांतरित करने के लिए दो ई कोलाई पर्यावरणीय आइसोलेट्स की क्षमता का परीक्षण किया गया था। प्रयोगात्मक सेटिंग का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में दिखाया गया है। दो दाताओं (ई कोलाई एसडब्ल्यू 4955 और एसडब्ल्यू 7037) और एक प्राप्तकर्ता (ई कोलाई एलएमबी 100) को स्वतंत्र रूप से जोड़ा गया था। ई कोलाई एसडब्ल्यू 4955 (पी 134797) और एसडब्ल्यू 7037 (पी 101718) में पाए जाने वाले वैवाहिक प्लास्मिड का जीन मानचित्र चित्रा 2 में दिखाया गया है।

वैवाहिक प्लास्मिड को कार्बेनिसिलिन के साथ चुना गया था और रिफैम्पिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन का उपयोग करके प्रति-चयनित किया गया था, जिनके प्रतिरोध निर्धारक प्राप्तकर्ता के गुणसूत्र में हैं। मैककॉन्की एगर का उपयोग लैक्टोज-पॉजिटिव दाताओं (जो बड़ी, गुलाबी कॉलोनियों का उत्पादन करते हैं) को प्राप्तकर्ता और ट्रांसकोनजुगेंट्स (जो लैक्टोज नकारात्मक हैं और छोटे, हल्के पीले उपनिवेशों का उत्पादन करते हैं) से अलग करने के लिए किया गया था (चित्रा 3)।

Figure 3
चित्रा 3: मैककॉन्की एगर पर दाता और प्राप्तकर्ता कॉलोनियों के लिए अंतर रंग मार्करों का चित्रण। दाताओं के अनुरूप कॉलोनियां मैककॉन्की एगर पर गुलाबी हैं क्योंकि वे लैक्टोज पॉजिटिव हैं। यह दाता को प्राप्तकर्ता कॉलोनियों से अलग करता है, जो हल्के पीले और छोटे (लैक्टोज नकारात्मक) होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संयुग्मित प्लास्मिड पी 134797 की लामबंदी का पता लगाया गया था, जिसमें प्लास्मिड में पाए जाने वाले प्रतिरोध जीन के पांच अलग-अलग वर्गों के अनुरूप पांच एंटीबायोटिक दवाओं में से प्रत्येक का पता लगाया गया था।

स्ट्रेन एसडब्ल्यू 4955 के लिए संयुग्मन दक्षता (सीई) की गणना कैसे करें, इसका एक उदाहरण प्रस्तुत किया गया है। स्ट्रेन एसडब्ल्यू 4955 के साथ परख से, ट्रांसकोनजुगेंट्स के 172 सीएफयू को प्लेट में कमजोर पड़ने से 10-2 से गिना गया था; संबंधित कमजोर पड़ने (10-2) से प्राप्तकर्ता की गिनती 10,300,000 सीएफयू / एमएल थी (तालिका 4)।

सीई की गणना निम्नानुसार की जाती है:

सीई = (174 सीएफयू /एमएल)/(10,300,000 सीएफयू/एमएल)

CE = 1.67 x 10-5 ट्रांसकोनजुगेंट्स/प्राप्तकर्ता

LMB100 कार्बेलिसिलिन के साथ चुने गए स्ट्रेन एसडब्ल्यू 4955 से ट्रांसकोनजुगेंट्स संयुग्मन दक्षता
तनूकरण सीएफयू (गणना योग्य प्लेट) लगभग CFU/ सीएफयू (गणना योग्य प्लेट)
100 confluent 1.03E+09
10-1 confluent 1.03E+08
10-2 confluent 10300000 172 1.67 x 10-5 ट्रांसकंजुगेंट्स/प्राप्तकर्ता
10-3 confluent 1030000
10-4 confluent 103000
10-5 confluent 10300
10-6 confluent 1030
10-7 103 103
सीई की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मूल्यों को बोल्ड में हाइलाइट किया गया है।

तालिका 4: स्ट्रेन एसडब्ल्यू 4955 के लिए संयुग्मन दक्षता (सीई) की गणना करने का एक उदाहरण।

परिणाम तालिका 5 में दिखाए गए हैं, जिसे प्रति प्राप्तकर्ता संयुग्मन दक्षता के रूप में व्यक्त किया गया है। दाता के रूप में स्ट्रेन एसडब्ल्यू 4955 का उपयोग करके प्राप्त पांच संयुग्मन क्षमताएं परिमाण के समान क्रम के भीतर थीं। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ट्रांसकोन्जुगेंट पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले चयन की परवाह किए बिना वैवाहिक प्लास्मिड की लामबंदी का पता लगाया जा सकता है।

एक दाता के रूप में स्ट्रेन एसडब्ल्यू 7037 का उपयोग करते हुए, प्राप्त संयुग्मन दक्षता परिमाण के तीन आदेश कम थी; ये परिणाम एक ही प्राप्तकर्ता के साथ विभिन्न दाताओं और प्लास्मिड प्रकारों की संयुग्मन क्षमता की तुलना की अनुमति देते हैं।

संयुग्मन दक्षता
मोच कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम / जेंटामाइसिन (2 मिलीग्राम / क्लोरैम्फेनिकॉल (25 मिलीग्राम / टेट्रासाइक्लिन (10 मिलीग्राम / ट्राइमेथोप्रिम (20 मिलीग्राम /
SW4955 1.67 x 10-5 5.67 x 10-5 2.17 x 10-5 7.62 x 10-5 1.36 x 10-5
SW7037 2.14 x 10-6

तालिका 5: चयन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक के आधार पर ई कोलाई दाता उपभेदों एसडब्ल्यू 4955 और एसडब्ल्यू 7037 की संयुग्मन क्षमता।

ट्रांसकोनजुगेंट्स में, दो वैवाहिक प्लास्मिड में एन्कोड किए गए रिप्लिकॉन और सभी प्रतिरोध जीनों की उपस्थिति, और उनके संबंधित रिप्लिकॉन, पीसीआर द्वारा जांच की गई थी। इन नैदानिक पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए उपयोग की जाने वाली शर्तों को तालिका 3 में दिखाया गया है।

नैदानिक जैल चित्रा 4 में दिखाए गए हैं। ये जैल ट्रांसकोनजुगेंट्स (पी 1347975 में इंकफिक और इंकएफआईबी, और पी 101718 में इंकआई 1) में अपेक्षित रिप्लिकॉन की उपस्थिति की पुष्टि करते हैं। वे अपेक्षित एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन की उपस्थिति की भी पुष्टि करते हैं, अर्थात् बीएलएसीटीएक्स-एम -55 समूह (बीटा-लैक्टम), एएसी (3) -2 और एडीए (एमिनोग्लाइकोसाइड), कैटा 2 (फेनिकोल), टेट (ए) (टेट्रासाइक्लिन), डीएफआरए 14 (ट्राइमेथोप्रिम), और पी 1347975 के लिए सल्फोनमाइड , और पी 101718 के लिए बीएलएसीएमवाई -2 (चित्रा 4)।

Figure 4
चित्रा 4: नैदानिक वैद्युतकणसंचलन जैल। एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन और प्लास्मिड रिप्लिकॉन के पीसीआर उत्पादों के जेल वैद्युतकणसंचलन दाता कोशिकाओं (उपभेदएसडब्ल्यू 4955 और एसडब्ल्यू 7037, क्रमशः) और संबंधित एलएमबी 100 ट्रांसकोनजुगेंट्स में वैवाहिक प्लास्मिड पी 134797 और पी 101718 में पाए जाते हैं। प्लास्मिड चयन के लिए कार्बेनिसिलिन का उपयोग किया गया था। संक्षिप्त रूप। -: नकारात्मक नियंत्रण (तनाव एलएमबी 100 के डीएनए को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था); डी: दाता; टी: ट्रांसकोनजुगेंट। अपेक्षित एम्प्लिकॉन आकार: blaCTX-M-55: 864 pb; एएसी (3) -आईआईए: 237 बीपी; AadA1: 283 bp; कैटए 2: 225 बीपी; टेट (ए): 957 बीपी; डीएफआरए 14: 302 बीपी; sul3: 799 bp; IncFIC (FII): 262 bp; IncFIB: 683 bp; बीएलएसीएमवाई -2: 1,855 बीपी; IncI1-I: 139 bp. जेल में 1% अगारोस होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वैवाहिक प्लास्मिड पुनर्संयोजन और क्षैतिज जीन स्थानांतरण के माध्यम से एक विशेष पर्यावरणीय सेटिंग के भीतर जीन के सांप्रदायिक पूल तक पहुंच प्रदान करतेहैं। इस प्रकार, वैवाहिक प्लास्मिड विकासवादी संस्थाएं हैं जो कार्यों को प्राप्त करने और प्रदान करने में सक्षम हैं जो बैक्टीरिया को घंटों के अस्थायी पैमाने के भीतर कई स्थितियों (एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध, धातुओं के प्रतिरोध, धातुओं के लिए प्रतिरोध, धातुओं के अधिग्रहण, बायोफिल्म गठन और रोगजनक जीन सहित) के अनुकूल होने की अनुमति देती हैं।

यह काम बैक्टीरिया में वैवाहिक प्लास्मिड की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल के काम करने के लिए, उपयोग किए गए मार्करों को दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों को अलग करने की आवश्यकता होती है, जैसा कि मीडिया ए और बी में नियंत्रण द्वारा दिखाया गया है। उन्हें प्लास्मिड ले जाने वाली कोशिकाओं का प्रभावी ढंग से चयन करने की भी आवश्यकता होती है। संभोग प्रतिक्रिया महत्वपूर्ण है। इस प्रतिक्रिया में, दाताओं और प्राप्तकर्ताओं को संयुग्मन होने के लिए लंबे समय तक संपर्क (पिली के माध्यम से) करने की आवश्यकता होती है। कुछ भी जो सेल-टू-सेल संपर्क को बाधित कर सकता है, जैसे कि अपर्याप्त इनक्यूबेशन समय या संस्कृति को हिलाना या हिलाना, इस प्रकार संयुग्मन की दक्षता कम हो जाती है। प्राप्तकर्ता की पसंद भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि कुछ प्राप्तकर्ता उपभेद संयुग्मन35,36 के लिए दुर्दम्य हैं। एलएमबी 100 को पसंद के प्राप्तकर्ता के रूप में प्रस्तावित किया गया है, क्योंकि यह कई असंगति प्रकारों के प्लास्मिड लेने में सक्षम है।

संयुग्मन दर प्रत्येक प्लास्मिड-दाता गुणसूत्र जोड़ी, प्राप्तकर्ता और पर्यावरणीय स्थिति के लिए विशिष्ट है। विशिष्ट प्लास्मिड का संयुग्मन बड़ी संख्या में चर के प्रति संवेदनशील पाया गया है, जिसमें विकास चरण, सेल घनत्व, दाता-से-प्राप्तकर्ता अनुपात शामिल है, चाहे संयुग्मन तरल या ठोस मीडिया, कार्बन, ऑक्सीजन, पित्त लवण, धातु सांद्रता, स्तनधारी कोशिकाओं की उपस्थिति, तापमान, पीएच और संभोग समय 13,14,15 में आयोजित किया गया हो। . इन इंटरैक्शन का अध्ययन गहराई से अध्ययन किए जाने वाले एक वैवाहिक प्लास्मिड की प्रारंभिक पहचान पर निर्भर करता है। इस प्रकार, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रयोगात्मक चर के प्रभाव का पता लगाने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, हालांकि यह स्क्रीन किए गए दाताओं की संख्या को प्रतिबंधित करने की कीमत पर आता है। यह मेजबानों में मोबिलाइजेबल प्लास्मिड की भी पहचान कर सकता है जिनके पास हेल्पर प्लास्मिड हैं (यानी, प्लास्मिड जो ट्रांस6 में मोबिलाइजेबल प्लास्मिड से गायब कार्यों को प्रदान करके संयुग्मन को सक्षम करते हैं)।

वैवाहिक प्लास्मिड के अनुक्रम को जानने की सिफारिश की जाती है (लेकिन संयुग्मन का पता लगाने के लिए आवश्यक नहीं है, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है)। जब दाता लैक्टोज-नकारात्मक होते हैं (मैककॉन्की एगर पर पीली कॉलोनियों का उत्पादन करते हैं), तो एक लैक्टोज-पॉजिटिव प्राप्तकर्ता (मैककॉनकी एगर पर गुलाबी कॉलोनियों का उत्पादन) का उपयोग दाता कोशिकाओं से सच्चे ट्रांसकॉन्जुगेंट्स को अलग करने के लिए किया जा सकता है जो ट्रांसकॉन्जुगेंट्स का चयन करने के लिए मीडिया पर बढ़ने में सक्षम हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को एंटरोबैक्टीरिया परिवार के पर्यावरणीय, कॉमेंसल और रोगजनक सदस्यों से वैवाहिक प्लास्मिड का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है; हालांकि, इसका उपयोग किसी भी जीवाणु प्रजाति के साथ उपयुक्त दाता, प्राप्तकर्ता, एंटीबायोटिक (ओं) और रंग मार्करों के साथ किया जा सकता है। अन्य बैक्टीरिया में इन महत्वपूर्ण घटकों की पहचान के लिए कई दाताओं, प्राप्तकर्ताओं और मार्करों (एंटीबायोटिक्स और रंगों) का उपयोग करके व्यवस्थित अध्ययन की आवश्यकता होती है। ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया में इस प्रोटोकॉल का परीक्षण नहीं किया गया है।

यहां प्रस्तुत विधि के कई रूपों को साहित्य में बताया गया है, हाल ही में समीक्षा की गई20। गुणात्मक परिणाम को विभिन्न तरीकों से भी संदर्भित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक्सकोनजुगेंट आवृत्ति और जीन हस्तांतरण आवृत्ति), और आयाम रहित इकाइयों का उपयोग संयुग्मन दक्षता (एमएल / सीएफयू एक्स एच) 20 की रिपोर्ट करने के लिए किया जा सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल कई सीमाओं को हल करता है जो पहले मौजूदा तरीकों 16,18,19,20 द्वारा संबोधित नहीं किए गए थे। सबसे पहले, एक उपयुक्त प्राप्तकर्ता की पहचान की गई है। दूसरा, सच्चे ट्रांसकोनजुगेंट्स का चयन करने के लिए दो एंटीबायोटिक दवाओं (रिफैम्पिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) का उपयोग इस संभावना को कम करता है कि दाता सहज म्यूटेनेसिस के माध्यम से ट्रांसकोनजुगेंट्स का चयन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं में से एक के लिए प्रतिरोध विकसित करते हैं। दाता द्वारा बड़ी मात्रा में उत्पादित एंजाइमों (जैसे, बीटा-लैक्टामेस) द्वारा ट्रांसकोनजुगेंट्स का चयन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक के हाइड्रोलिसिस द्वारा झूठी ट्रांसकोनजुगेंट्स द्वारा दर्शक संरक्षण के परिणामस्वरूप भी हो सकते हैं। तीसरा, यह सुनिश्चित करने के लिए कई प्रयोगात्मक नियंत्रण शामिल हैं कि संभोग का उत्पाद एक सच्चा ट्रांसकोनजुगेंट है (यानी, एक प्राप्तकर्ता सेल जिसने दाता के वैवाहिक प्लास्मिड को स्थिर रूप से शामिल किया है)। यहां, हमने ट्रांसकोनजुगेंट्स की प्रामाणिकता का परीक्षण करने के लिए दो स्वतंत्र तरीके प्रस्तुत किए, अर्थात् मैककॉन्की एगर में एक रंगीन मार्कर, और प्राप्तकर्ता में वैवाहिक प्लास्मिड के रिप्लिकॉन और एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का पीसीआर पता लगाना। इसके अलावा, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को पर्यावरणीय, कमेंसल और परिवार के रोगजनक सदस्यों (एस्चेरिचिया, क्लेबसिएला, एंटरोबैक्टर, सिट्रोबैक्टर, साल्मोनेला, शिगेला और अन्य प्रजातियों) से वैवाहिक प्लास्मिड को अलग करने और चिह्नित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

संयुग्मन के यांत्रिकी को समझने के लिए, कंप्यूटर सिमुलेशन का उपयोग करके प्रयोगात्मक टिप्पणियों का मॉडलिंग किया गया है। ये पूर्वानुमानित मॉडल दाताओं, प्राप्तकर्ताओं और ट्रांसकोनजुगेंट्स के दिए गए विकास घनत्व के लिए प्लास्मिड हस्तांतरण की आवृत्ति का अनुमान लगाते हैं। एंडपॉइंट मॉडल के रूप में जाना जाने वाला एक मॉडल ने थ्रेसहोल्ड पाया जिसके ऊपर तरल संस्कृति में प्लास्मिड ट्रांसफर की दर थी, और निष्कर्ष निकाला कि स्थानांतरण दर सेल घनत्व, दाता: प्राप्तकर्ता अनुपात और संभोग समय19 से अप्रभावित है। फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) का उपयोग ट्रांसकोनजुगेंट प्लास्मिड का पता लगाने की वैकल्पिक विधि के रूप में किया गया है। मछली डीएनए जांच और लक्ष्य डीएनए के संकरण के माध्यम से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्लास्मिड विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। इस प्रकार, फिश विभिन्न सेल आबादी37 में प्लास्मिड प्रवाह का दृश्य पता लगाने की अनुमति देता है, हालांकि इसमें यहां प्रस्तुत विधि के समान संवेदनशीलता नहीं है यदि चयन के विपरीत दृश्य स्क्रीनिंग द्वारा ट्रांसकोन्जुगेंट्स का पता लगाया जाता है।

वैवाहिक प्लास्मिड के जीव विज्ञान को समझने की भारी आवश्यकता है जो पारिस्थितिकी तंत्र के विभिन्न घटकों (क्लिनिक, कृषि, सीवेज, वन्यजीव, घरेलू जानवरों, मिट्टी, नदियों और झीलों) के माध्यम से एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को फैला रहे हैं। संक्षेप में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सरलीकृत प्रयोगात्मक स्थितियां पैमाने पर दाताओं की स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करती हैं, और इस प्रकार विभिन्न स्रोतों से वैवाहिक प्लास्मिड में उत्पन्न क्षैतिज जीन हस्तांतरण के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करती हैं। उनका उपयोग कई स्रोतों और बैक्टीरिया से वैवाहिक प्लास्मिड में एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन या अन्य चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक जीन की व्यापकता की जांच करने के लिए किया जा सकता है। उन्हें विवो में संयुग्मन के अध्ययन के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, कशेरुक की आंत में) और उन स्थितियों का अध्ययन करने के लिए जो संयुग्मन की दक्षता को संशोधित करते हैं। ये सभी अध्ययन यह समझने में बहुत वृद्धि करेंगे कि मल्टीड्रग-प्रतिरोधी वैवाहिक प्लास्मिड की लामबंदी मल्टीड्रग प्रतिरोध के प्रसार में कैसे योगदान देती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एलएम-बी, आईएमजी, एटी और आईएस को एनआईएच अनुदान जीएम 055246 द्वारा समर्थित किया गया था। जीसी-सी को लगातार दो वर्षों के लिए यूसी एमईएक्सयूएस-कोनासाइट पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप से सम्मानित किया गया: एवाई 2017-18 और 2018-19। हम प्रयोगों में उनके तकनीकी समर्थन के लिए जेनटेक-फाउंडेशन प्रायोजित अकादमिक प्रेरणा नेटवर्क (जीएआईएन) सलाह कार्यक्रम से सेज शावेज और पेपर सेंट क्लेयर के छात्रों को बहुत धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 22-313630 It can be replaced for another brand
2.0 mL Cryogenic vials Corning 430659 It can be replaced for another brand
14 mL conical tubes FALCON 149597 It can be replaced for another brand
14 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 8850 It can be replaced for another brand
1 kb DNA ladder New England Biolabs N0552G 
250 mL sterile flasks  PYREX 5320 It can be replaced for another permanent marker brand
Acetic acid Fisher Scientific A38SI-212 It can be replaced for another brand
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) Fisher Scientific BP160-500 It can be replaced for another brand
Carbenicillin GOLD BIOTECHNOLOGY C-103-50 It can be replaced for another brand
Disposable inoculating loops: 1 µL Fisherbrand 22-363-595 It can be replaced for another brand
DNA gel loading dye 6x  New England Biolabs B7024S It can be replaced for another brand
EDTA Fisher Scientific BP119-500 It can be replaced for another brand
Electronic digital scale Denver Instrument APX-2001 It can be replaced for another brand
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL Eppendorf 14-282-302 It can be replaced for another brand
Equipment for agarose gel electrophoresis Fisher Scientific FP300 It can be replaced for another brand
Ethanol-resistant markers Sharpie 37001; 37002; 37003 It can be replaced for another brand
Gel documentation systems (UVP GelSolo) Analytakjena SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 It can be replaced for another brand
Gloves X-GEN 44-100M Any nitrile gloves brand works
Ice bucket Thermo Fisher Scientific 432128 It can be replaced for another brand
MacConkey agar  BD DIFCO 212123
Master Mix  BioLabs M0496S  It can be replaced for another brand
Methanol Fisher Scientific A452-4 It can be replaced for another brand
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL Fisherbrand 05-408-138 It can be replaced for another brand
Mueller Hinton agar BD DIFCO DF0479-17-3
Mueller Hinton broth BD DIFCO 275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL 740588. 250
PCR tube racks AXYGEN   R96PCRFSP It can be replaced for another brand
PCR tubes (0.2 mL) AXYGEN  PCR-02-C It can be replaced for another brand
Rifampicin Fisher Scientific 50-164-7517
Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) RAININ 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand
Sodium chloride Fisher Scientific S671-3 It can be replaced for another brand
Spectrophotometer Thermo Scientific 335905P It can be replaced for another brand
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL  Eclipse 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 It can be replaced for another brand
Streptomycin Fisher Scientific BP910-50
SYBR Safe DNA gel stain  Thermo Fisher Scientific S33102
Taq DNA Polymerase BioLabs M0273S
Thermal cycler C1000 Touch  Bio-Rad 1851196 It can be replaced for another brand
Tris  Fisher Scientific BP153-500 It can be replaced for another brand

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References

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आनुवंशिकी अंक 193 प्रायोगिक विकास क्षैतिज जीन हस्तांतरण वैवाहिक प्लास्मिड एंटीबायोटिक प्रतिरोध एस्चेरिचिया कोलाई
<em>ई कोलाई</em> में प्राकृतिक वैवाहिक प्लास्मिड द्वारा मध्यस्थ क्षैतिज जीन हस्तांतरण का पता लगाना
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Mota-Bravo, L., Camps, M., Muñoz-Gutiérrez, I., Tatarenkov, A., Warner, C., Suarez, I., Cortés-Cortés, G. Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli. J. Vis. Exp. (193), e64523, doi:10.3791/64523 (2023).

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