Summary
접합은 두 개의 서로 다른 세포에 걸쳐 플라스미드 DNA를 동원하여 유익한 유전자의 확산을 촉진함으로써 수평적 유전자 전달을 매개합니다. 이 연구는 접합 플라스미드, 공여체 및 수용자에서 차등 마커를 사용하여 형질전환을 검출하는 것을 기반으로 접합 플라스미드 전달의 효율적인 검출을 위해 널리 사용되는 방법을 설명합니다.
Abstract
접합은 그람 음성 박테리아에서 수평 유전자 전달을 촉진하는 주요 메커니즘 중 하나를 나타냅니다. 이 연구는 두 개의 자연 발생 플라스미드를 예로 사용하여 자연 발생 접합 플라스미드의 동원 연구 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 기증자, 수용자 및 접합 플라스미드에서 선택 가능한 마커의 차등적 존재에 의존합니다. 구체적으로, 기술된 방법은 1) 천연 접합 플라스미드의 동정, 2) 고체 배양에서의 접합 속도의 정량화, 및 3) 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 형질접합체 수용자의 항생제 내성 유전자 및 플라스미드 플리콘 유형의 진단 검출을 포함한다. 여기에 설명된 프로토콜은 환경에서 발견되는 박테리아에서 항생제 내성 유전자를 운반하는 접합 플라스미드의 존재를 스크리닝하기 위해 수평 유전자 전달의 진화 생태학을 연구하는 맥락에서 개발되었습니다. 배양에서 이러한 실험에서 관찰된 접합 플라스미드의 효율적인 전달은 일반적으로 수평적 유전자 전달을 촉진하는 메커니즘으로서 접합의 생물학적 관련성과 특히 항생제 내성의 확산을 강조합니다.
Introduction
1946년 Lederberg와 Tatum1은 현재 접합으로 알려진 대장균 K-12의 성과정을 설명했습니다. 박테리아 접합은 박테리아 세포(기증자)가 직접적인 세포 간 접촉을 통해 단방향 유전 물질을 다른 세포(수용자)로 전달하는 과정입니다. 접합은 박테리아2,3에 광범위하게 분포하지만, 접합 기계를 발현하는 공여 세포의 분율은 일반적으로 매우 작다4.
플라스미드는 자율적으로 복제되는 염색체외 DNA 요소입니다. 플라스미드는 플라스미드 복제 및 유지에 관여하는 유전자 외에도 중금속이나 항생제 노출과 같은 환경 문제에 대한 적응에 관여하는 유전자를 운반하는 경우가 많다5. 접합 플라스미드(Conjugative plasmids)는 수용 세포로의 전달을 허용하고 전달 후 지속성을 지원하는 일련의 특수 유전자를 가진 플라스미드 부류이다6. 접합 플라스미드의 크기는 슈도모나도타문(프로테오박테리아와 동의어)의 박테리아에서 21.8kb에서 1.35Mb까지 다양하며 중앙값은 약 100kb 5,7입니다. 이들은 또한 일반적으로 낮은 복제 수를 가지며, 아마도 숙주에 대한 대사 부담을 낮게 유지하기 위해 8,9.
전형적인 접합 장치는 전달 기원(oriT), 이완효소, IV형 결합 단백질 및 IV형 분비 시스템(기증자가 수혜자와 접촉할 수 있도록 하는 필루스라고 하는 튜브 모양의 구조)의 네 가지 구성 요소로 구성됩니다6. 접합 플라스미드를 운반하는 세포의 극소량만이 접합 기계4를 발현하지만, 플라스미드가 적합성 이점을 제공한다면, 트랜스접합체는 집단에서 급속히 확장될 수 있다. 서로 다른 서식지에서 채취한 대장균 분리주의 35%에서 80% 이상은 적어도 하나의 항생제에 내성을 부여하는 유전자를 가진 접합 플라스미드를 가지고 있다10,11; 따라서, 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평적 유전자 전달은 항생제 내성 유전자12의 세계적 확산을 주도하는 주요 메커니즘이다.
실험실 배양에서 수행된 짝짓기 실험은 접합 빈도가 수용자 세포의 특성, 성장 단계, 세포 밀도, 공여체 대 수용자 비율, 접합이 액체 또는 고체 배지에서 수행되는지 여부, 탄소, 산소, 담즙염, 금속 농도, 포유류 세포의 존재, 온도, pH 및 짝짓기 시간13,14, 15.
이 작업은 주어진 숙주 균주에서 접합 플라스미드의 존재를 검출하고, 고체 배양에서 접합 속도를 정량화하고, 수용자 세포로의 전달을 다시 확인하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 연구에 적합한 천연 접합 플라스미드를 식별하기 위한 첫 번째 단계로 사용할 수 있습니다. 여러 출처(환경, 공생 및 병원성)에서 대규모(수십에서 수백 명의 기증자)에서 얻은 박테리아에서 접합 플라스미드의 존재를 스크리닝하도록 설계되었기 때문에 최소한의 단순화된 단계를 사용합니다.
또한, 주어진 접합 플라스미드의 동원이 검출에 사용된 항생제와 무관한지 여부(즉, 선택 하에서 항생제 내성 유전자의 관련성)를 검출하고 상이한 환경 분리주에서 발견된 2개의 접합 플라스미드의 접합률을 비교하기 위한 시험이 제시된다.
관련 접합 플라스미드(플라스미드 레플리콘 및 항생제 내성 유전자 구성)의 유전적 구성에 기초하여, 프로토콜의 각 단계는 접합 속도에 영향을 미칠 가능성이 있는 다양한 인자의 영향을 연구하기 위해 수정될 수 있다.
일반 실험 설계:
짝짓기 실험을 설정하는 데 필요한 필수 구성 요소는 기증자 세포, 수용자 균주 및 기증자(항생제 A), 수용자(항생제 B) 및 형질전환체(항생제 A 및 B)를 선택하기 위한 고체 배지입니다. 트랜스접합체는 공여자의 접합 플라스미드를 안정적으로 유지하는 수용자 세포이다.
공여 세포는 항생제(항생제 A)에 내성이 있고 수용자 세포를 선택하는 데 사용되는 마커(항생제 B)에 민감합니다. 항생제 내성 유전자의 게놈 위치(즉, 그것이 염색체 또는 공여자 세포의 플라스미드에 위치하는지 여부)는 선험적으로 알려질 필요가 없는데, 그 이유는 항생제 내성 마커를 수용자에게 동원하기 때문에(직접 기증자-수혜자 접촉 후) 공여자-제공된 마커가 플라스미드에 있었다는 것을 의미한다.
수용자 균주(접합 플라스미드를 취하는 것으로 알려짐)는 공여자에게 존재하지 않는 안정적인 선택 가능한 마커를 가질 필요가 있습니다. 이 선택 가능한 마커는 일반적으로 염색체에 위치한 항생제 또는 살생물제에 내성이 있습니다. 교미 실험에 사용할 수용자의 선택은 매우 중요한데, 그 이유는 일부 대장균 균 주가 접합 플라스미드를 채취하는 능력이 다양하기 때문이다16.
이러한 구성 요소가 확립되면 기증자-수혜자 쌍 접촉 후 항생제(A 및 B)가 모두 포함된 배지에서 자라는 모든 콜로니는 추정 형질전환체입니다(그림 1). 이는 기증자가 항생제 A가 있는 배지에서 성장할 수 있지만 항생제 B가 있는 배지에서는 성장할 수 없고, 수혜자가 항생제 B가 있는 배지에서 성장할 수 있지만 항생제 A로 성장할 수 없다고 가정합니다. 첫 번째 검사는 트랜스컨쥬간트 콜로니의 접합 플라스미드에서 발견되는 유전자의 검출(유전자의 중합효소 연쇄 반응[PCR] 증폭 또는 기타 방법에 의한)으로 구성됩니다. 두 번째 테스트는 유당 대사를 기반으로 한 차등 콜로니 색상 마커의 사용을 포함합니다. 차등 식민지 색상은 MacConkey 한천을 사용하여 나타납니다. 한천의 유당은 유당 발효(LAC+) 미생물에 의해 발효 공급원으로 사용될 수 있습니다. 이 미생물은 유기산, 특히 젖산을 생성하여 pH를 낮춥니다. 중성 적색은 pH가 6.8 이하로 떨어지면 회백색에서 밝은 적색/분홍색으로 변하는 배지에 포함된 pH 지표입니다17. 따라서 대장균 유당 양성 균주는 MacConkey 한천에서 더 큰 분홍색 콜로니를 생성하는 반면, 유당 음성 균 주는 MacConkey 한천에서 옅은 노란색과 더 작은 콜로니를 생성합니다.
그림 1: 기증자 균주에서 접합 플라스미드의 존재를 검출하는 데 사용되는 실험 설계. 이 예에서, 공여자는 항생제 A에 대한 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자를 갖는 접합 플라스미드를 보유하지만, 이들은 항생제 B에 감수성이 있다. 반대로, 수혜자는 항생제 B로부터 보호를 부여하는 염색체 내성 결정인자를 갖지만, 항생제 A에 감수성이 있다. 트랜스접합체는 항생제 (A 및 B) 모두에 내성이 있고, 항생제 A에 대한 내성을 부여하는 기증자의 접합 플라스미드와 항생제 B로부터 보호하는 수혜자의 염색체를 가지고 있기 때문입니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(주어진 실험 조건 하에서) 기증자-수혜자 쌍에 대한 접합률은 형질전환 접합체의 수를 기증자의 수 또는 수혜자의 수로 나누어 계산할 수 있습니다. 첫 번째 비율은 공여자에 의한 접합 기계의 기능적 발현을 나타내는 공여자 세포의 분획을 나타내고16,18, 두 번째 비율은 공여자 플라스미드19,20을 취하는 수용자의 능력을 나타냅니다. 본 연구에서, 달리 언급되지 않는 한, 접합률은 형질접합체가 되는 수용자 세포의 분율(즉, 수용자당 비율)을 나타낸다.
여기에서 1명의 대장균 수혜자와 2명의 대장균 기증자를 포함하는 두 개의 독립적인 짝짓기 실험이 보고됩니다. 또한, 공여자 중 한 명에 대한 형질전환 접합체를 선택하기 위해 상이한 항생제를 사용하여 단일 다제내성 플라스미드가 접합 플라스미드에서 발견되는 항생제 내성 유전자 중 하나로 선택될 수 있음을 확인했습니다.
이 작업에 사용된 기증자 및 수혜자 균주는 이 실험 시스템의 모든 구성 요소를 이해하기 위해 완전히 시퀀싱되었습니다. 그러나, 이들 프로토콜은 알려지지 않은 서열의 숙주에서 접합 플라스미드의 존재를 스크리닝하기 위해 설계되었으며, 이 실험적 맥락에서도 사용될 수 있다; 그러나 이 경우 관련 유전자가 먼저 시퀀싱됩니다.
프로토콜에 사용된 기증자 및 수혜자 균주는 다음과 같습니다.
기증자 1. 대장균 SW4955는 미국 LA 배턴루지의 호수에서 수집되었습니다. IncFIC(FII) 및 IncFIB(AP001918) 응답자를 갖는 134,797bp 접합 플라스미드(p134797)를 가지고 있습니다. 이 접합 플라스미드는 3세대 세팔로스포린(blaCTX-M-55), 아미노글리코사이드(aac(3)-IIa 및 aadA1), 페니콜(catA2), 테트라사이클린(tet(A)), 트리메토프림(dfrA14) 및 설폰아미드(sul3). p134797의 전체 지도는 그림 2A를 참조하십시오. 대장균 SW4955는 유당 양성이며 MacConkey 한천에서 분홍색 콜로니를 생성합니다.
기증자 2. 대장균 SW7037은 Lake Erie (Ottawa County, OH, USA)에서 수집되었다. IncI1-I(알파) 레플리콘이 있는 101,718bp 접합 플라스미드(p101718)를 운반합니다. 이 접합 플라스미드는 베타-락탐(blaCMY-2)에 대한 내성을 부여하는 유전자를 가지고 있습니다. p101718의 전체 지도는 그림 2B를 참조하십시오. 대장균 SW7037은 또한 유당 양성이며 MacConkey 한천에서 분홍색 콜로니를 생성합니다.
그림 2: 이 연구에 사용된 접합 플라스미드의 유전자 지도. (A) 플라스미드 p134797, 대장균 균주 SW4955에서 발견되는 접합 플라스미드. (B) 플라스미드 p101718, 대장균 균주 SW7037에서 발견되는 접합 플라스미드. 항생제 내성 유전자는 파란색으로 강조 표시되고 접합 장치에 속하는 유전자는 빨간색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
받는 사람. 대장균 LMB100은 수신자로 사용됩니다. 이것은 리팜핀(100mg/L)과 스트렙토마이신(100mg/L)에 내성이 있는 플라스미드가 없는 균주입니다. 두 가지 항생제에 대한 내성이 있으면 결과 해석을 방해할 수 있는 기증자에서 내성 돌연변이가 발생할 가능성이 줄어듭니다. 또한, 대장균 LMB100은 유당 음성이며, MacConkey 한천에서 옅은 노란색과 작은 콜로니(더 큰 분홍색 콜로니와 반대)를 생성하기 때문에 두 기증자 균 주와 구별할 수 있습니다.
기증자가 유당 음성인 경우 유당 양성 수혜자(예: 대장균 J53)를 사용하는 것이 좋습니다. LMB100 및 J53 균주는 다른 실험실에서도 사용할 수 있습니다. Gerardo Cortés-Cortés 박사에게 주소 및 FedEx 번호와 함께 요청을 보내주십시오.
기증자, 수혜자 및 transconjugants를 선택하고 계산하는 데 필요한 고체 배지는 직경 100mm의 페트리 접시에 담긴 MacConkey 한천입니다. 다음 항생제의 추가가 필요합니다: (i) 배지 A: 카르베니실린(100mg/L)을 사용하여 기증자를 계산하고 수혜자가 이 항생제로 성장할 수 없도록 합니다. (ii) 배지 B: 리팜핀(100mg/L) + 스트렙토마이신(100mg/L)을 사용하여 수혜자의 수를 계산하고 기증자가 이 두 항생제에서 성장할 수 없도록 합니다. (iii) 배지 AB: 카르베니실린(100mg/L) + 리팜핀(100mg/L) + 스트렙토마이신(100mg/L)을 사용하여 트랜스콘쥬간트를 얻고 계산합니다. (iv) 배지 C: 연구된 모든 분리주를 줄무늬로 하는 항생제 없음.
대장균 SW4955 및 대장균 SW7037에서 대장균 LMB100에 대한 접합 플라스미드의 접합률을 비교합니다. 또한, p134797 접합 플라스미드(SW4955 균주)의 경우, 항생제 카르베니실린(100 mg/L)을 겐타마이신(2 mg/L), 클로람페니콜(25 mg/L), 테트라사이클린(10 mg/L), 트리메토프림(20 mg/L) 또는 설파메톡사졸(100 mg/L)로 대체하여 선택에 사용된 항생제 내성 마커가 결과에 영향을 미치는지 확인하기 위한 후속 실험에서.
Protocol
1. 방법 1 : 활용
- 1일차: 기증자와 수혜자를 연속으로 표시합니다. 글리세롤 스톡을 배지 C(항생제가 없는 MacConkey 한천)에서 별도로 줄무늬로 만들고 37°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 이 단계는 실험이 순수 분리주로 수행되도록 하고 콜로니의 색상으로 유당 표현형을 확인하는 데 필요합니다. - 2일차: 각 기증자와 수혜자에 대해 14.0mL 배양 튜브에 라벨을 붙입니다. 각 공여자와 수용자의 단일 콜로니를 선택하고, 37°C에서 2mL의 Mueller Hinton 브로스가 들어있는 별도의 14.0mL 배양 튜브에서 밤새(18시간) 성장시키고 200rpm에서 진탕했습니다.
참고: 사용된 균주에서 18시간의 하룻밤 배양 후 고정상에 도달합니다. - 3일: 900μL의 식염수와 100μL의 하룻밤 배양물을 1:10 희석하여 각 기증자와 수용자의 하룻밤 배양(와류 없음)의 600nm(OD600)에서 광학 밀도를 측정합니다.
- 멸균된 식염수(물 중 0.85% NaCl)를 사용하여 각 기증자와 수혜자의 광학 밀도를 2.0(OD600 = 2.0)으로 조정합니다.
참고: OD600 = 2.0인 대장균의 하룻밤 배양에는 1.6 x 109 CFU/mL가 있습니다. - 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 "짝짓기 튜브"라는 라벨을 붙여 기증자와 수혜자 균주를 표시합니다. 각 기증자와 수혜자의 조정된(OD 600 = 2.0) 현탁액 500μL를 옮기고 짝짓기 튜브에 넣습니다(이 짝짓기 튜브는 각 기증자와 수혜자의 0.8 x10 9 CFU/mL를 가짐). 결합 튜브를 반전으로 부드럽게 혼합합니다.
- 실온에서 500 x g 에서 10분 동안 결합 튜브를 원심분리합니다.
- 펠릿을 방해하지 않고 접합 튜브 800μL를 피펫팅합니다. 접합 튜브에 200μL가 남아 있어야 합니다.
알림: 상층액을 10% 표백제 용기에 버리고 현탁액의 박테리아를 비활성화합니다. - 짝짓기 튜브를 인큐베이터에서 37°C에서 18시간(하룻밤) 동안 인큐베이션합니다. 짝짓기는 잠복기 동안 발생합니다.
알림: 이 단계는 공액 기둥을 깨뜨리지 않도록 흔들지 않고 수행해야 합니다. - 음성 대조군으로, 배지 B의 기증자와 배지 A의 수혜자의 하룻밤 배양을 줄무늬로 합니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다
- 4일: 800μL의 식염수를 결합 튜브에 추가하고 와류하여 재현탁합니다(이렇게 하면 결합 혼합물이 1mL로 재구성됨).
참고: Vortexing은 짝짓기 박테리아를 분해하고 배양물을 균질화하여 CFU/mL를 정량화합니다. - 짝짓기 혼합물의 1:10 희석액 (1 x 100 에서 1 x 10-7까지)을 준비하십시오. 배지 A 및 배지 B에서 희석액 10-5 내지 10-7 의 100 μL와 배지 AB의 모든 희석액을 플레이트에 넣는다.
알림: 희석 100은 깔끔한 튜브를 나타냅니다. - 접시를 거꾸로 인큐베이터에 넣기 전에 건조시키십시오. 플레이트를 37°C에서 18시간(하룻밤) 동안 인큐베이션한다.
- 5일차: 음성 대조군을 검사하여 기증자의 순수한 하룻밤 문화의 줄무늬가 미디어 B에서 자라지 않았고 수혜자의 순수한 하룻밤 문화가 미디어 A에서 자라지 않았는지 확인합니다.
- 계산할 수있는 식민지 및 희석액의 수를 기록하십시오.
- 미디어 A의 식민지를 세십시오. 이들은 기증자입니다. 식민지는 분홍색이어야합니다 (그림 3A, B).
- 미디어 B의 식민지를 세십시오. 이들은 수혜자와 transconjugants입니다. 콜로니는 옅은 노란색이어야합니다 (그림 3C).
- 미디어 AB에서 식민지를 세십시오. 이들은 transconjugants입니다. 식민지는 옅은 노란색이어야합니다.
알림: 셀 수 있는 플레이트를 선택하십시오. 셀 수 있는 플레이트에는 30개에서 300개 사이의 콜로니가 있습니다(300개 이상의 콜로니는 계산하기 어렵고 30개 미만의 콜로니는 샘플 크기가 너무 작아 원래 샘플을 정확하게 표현할 수 없는 것으로 간주됨).
- 기증자 또는 수혜자당 활용 빈도 계산
기증자당 접합 빈도 = (트랜스접합체의 CFU/mL[배지 AB])/ (공여자의 CFU/mL[배지 A]) x 100
수혜자당 접합 빈도 = (transconjugant [배지 AB]의 CFU/mL)/ (수혜자 및 transconjugants의 CFU/mL[배지 B]) x 100
참고: 이 프로토콜의 접합 빈도는 transconjugants를 수신자 수로 나눈 값에 100을 곱한 값으로 계산되었습니다. 문헌에 따르면, 접합의 결과적인 양은 접합 빈도, 유전자 전달 빈도, 접합 빈도, 재조합 수율, 플라스미드 전달 효율, 총 박테리아 수에 기초한 접합 빈도, 형질전환 접합체의 비율, 수용자 집단에서 접합체의 비율, 접합체 빈도, 접합 빈도, 접합 속도의 로그, 전달 속도 상수, 짝짓기 쌍당 접합 속도, 공액 계수 또는 공액 효율20. 이 프로토콜은 접합 효율이라는 용어를 나타냅니다. - 트랜스콘쥬간제를 글리세롤 스톡에 보관하여 -80°C에서 보관한다. 글리세롤 스톡을 준비하기 위한 하위 단계를 따르십시오.
- transconjugants의 단일 콜로니를 선택하고 37°C에서 200rpm으로 진탕하면서 carbenicillin(100mg/L)이 보충된 Mueller Hinton 배지 2mL가 들어 있는 5.0mL 배양 튜브에서 밤새(18시간) 성장시킵니다.
- 다음과 같이 transconjugant의 이름을 나타내는 극저온 바이알에 라벨을 붙입니다 : Tc + 기증자의 이름 + 배지 A에서 선택의 항생제 (트랜스 접합체이기 때문에, 그들의 배경은 이미 스트렙토 마이신 및 리팜핀에 내성이 있지만 추가로 베타 - 락탐 내성 유전자를 운반하는 플라스미드를 보유하고있는 수용자 균주 인 것으로 알려져 있음); 예를 들어, TcU1Carb. 동일한 기증자로부터 둘 이상의 transconjugant를 저장해야 하는 경우(예: TcU1Carb1, TcU1Carb2 등) 연속 숫자를 추가합니다.
- 하룻밤 배양 1mL를 50% 글리세롤 1mL(v/v, 최종 글리세롤 농도는 25%여야 함)로 옮기고 반전으로 부드럽게 혼합합니다. 극저온 바이알을 드라이 아이스에 15 분 동안 넣고 향후 실험을 위해 -80 ° C에서 극저온 바이알을 보관하십시오.
- DNA 추출을 위해 카르베니실린(100mg/L)이 보충된 Mueller Hinton 한천에 글리세롤 스톡에서 trasnconjugants를 줄무늬로 긋고 37°C에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 2.1단계의 권장 사항을 따릅니다.
2. 방법 2: 대장균 형질전환체에서 항생제 내성 유전자 및 플라스미드 레플리콘을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응(PCR)
참고: 중합효소연쇄반응(PCR)은 1983년 Kary Mullis 박사에 의해 개발되었습니다. PCR은 특정 프라이머(복제가 진행될 수 있는 지점으로 작용하는 주어진 DNA 서열에 상보적인 짧은 DNA 조각, 일반적으로 길이가 20-40 뉴클레오티드이고 이상적으로는 구아닌-시토신 함량이 40%-60%)에 따라 달라지며, 이는 변성된 이중 가닥 DNA 주형의 반대쪽 가닥에 어닐링되고 내열성 DNA 중합효소를 통해 확장됩니다. 따라서 반응의 다음 사이클을 위한 추가 주형을 생성하여, 원래의 주형(21)의 지수 증폭을 유도한다. 이 프로토콜에서, 접합 플라스미드에 존재하는 레플리콘 및 내성 유전자를 증폭하여 형질접합체 수용자 세포에서의 전사를 확인하였다.
- DNA 추출
- 접합 플라스미드에 의해 운반되는 내성 유전자의 전달을 검출하기 위해, 형질전환 접합 DNA를 주형으로 사용하십시오. 간단한 종기 준비 추출을 사용하여 박테리아 세포벽을 용해시킵니다.
알림: 간단한 끓이기 준비 추출은 박테리아 세포벽을 용해하는 간단한 방법입니다. 이 추출에는 게놈 DNA와 혼합된 플라스미드 DNA가 포함되어 있지만 프라이머는 관심 있는 특정 DNA 서열에 따라 설계되므로 이 템플릿은 PCR에도 유용합니다. 플라스미드는 특이적으로 정제할 수도 있지만, 플라스미드 크기가 증가함에 따라 수율이 떨어지는 경향이 있다22. 이것은 편리한 정지 지점입니다. DNA는 -20°C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 접합 플라스미드에 의해 운반되는 내성 유전자의 전달을 검출하기 위해, 형질전환 접합 DNA를 주형으로 사용하십시오. 간단한 종기 준비 추출을 사용하여 박테리아 세포벽을 용해시킵니다.
- PCR (PCR)
- 실험에 음성 대조군과 양성 대조군이 있다는 점을 감안할 때 1.5mL 튜브에 모든 반응에 대한 풀을 설정하는 것이 좋습니다. 1.5mL 튜브를 "풀"로 표시하고 필요한 PCR 튜브에 유전자 및 샘플(예: OXA-U1)의 이름을 표시합니다.
- PCR 시약을 1.5 mL 튜브에 넣은 순서대로 피펫팅합니다: 멸균수, 2x 마스터 믹스, 프라이머 및 중합효소(주형 DNA 제외)( 표 1 참조). 피펫팅으로 위아래로 10회 이상 부드럽게 섞습니다. 전체 시간 동안 얼음 상태를 유지하십시오.
알림: 반응 혼합물이나 시약이 오염되지 않도록 장갑을 착용하십시오. 시약을 개봉 및 혼합하지 말고 시약 오염을 방지하기 위해 동일한 영역에서 샘플을 취급하지 마십시오. 시약을 얼음 양동이에 넣어 뉴클레아제 활성과 비특이적 프라이밍을 억제합니다. 반응을 설정하기 전에 완전히 해동시키십시오. 실험 내내 시약을 얼음 위에 보관하십시오. Taq Polymerase는 pH 변화에 민감하기 때문에 마지막에 첨가됩니다. 성능 저하 또는 잘못 접히지 않도록 버퍼링해야 합니다. 프라이머의 서열은 표 2에 열거되어 있다 - 항생제 내성 유전자 - 및 표 3-레플리콘 23,24,25,26,27,28. - 해당 튜브에 템플릿 DNA를 추가합니다. PCR 튜브에 기포가 생기지 않도록 하고 캡을 고정하십시오.
- PCR 튜브를 열 순환기에 넣습니다.
- 프로그램을 시작합니다. 표 2 (저항성 유전자) 및 표 3 (레플리콘)의 각 유전자에 대해 나열된 프로그램 설정을 참조하십시오.
참고: PCR 프로그램을 설정하여 s를 유지합니다.amp실행 후 4°C에서.- 리플리콘에 대한 PCR 조건: 94°C에서 5분 동안 변성의 1 사이클, 이어서 94°C에서 1분 동안 변성의 30 사이클, 60°C에서 30초 동안 어닐링, 72°C에서 1분 동안 신장, 및 72°C에서 5분 동안 1 사이클의 최종 연장.
참고: 이것은 Carattoli et al.29에 의해 표준화된 조건입니다.
- 리플리콘에 대한 PCR 조건: 94°C에서 5분 동안 변성의 1 사이클, 이어서 94°C에서 1분 동안 변성의 30 사이클, 60°C에서 30초 동안 어닐링, 72°C에서 1분 동안 신장, 및 72°C에서 5분 동안 1 사이클의 최종 연장.
- 프로그램이 끝나면 PCR 튜브를 4°C에서 보관합니다.
알림: 이것은 편리한 정지 지점입니다. PCR 산물은 -20°C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. - 250 mL 플라스크에 0.6 g의 아가로스를 칭량하고 60 mL의 1x 트리스-아세테이트-EDTA (TAE) 완충액을 첨가하여 1% 아가로스 겔을 제조한다 (상이한 겔 크기가 필요한 경우 시약 조정). 아가로오스가 플라스크 위로 쏟아지는 것을 방지하기 위해 전자레인지에서 아가로스를 조심스럽게 천천히 녹이고 약 55°C(10-15분)로 식힙니다.
- 초순수 탈이온수와 분석 등급 시약을 사용하여 모든 시약을 준비합니다.
- TAE 50x 완충액(트리스 염기, 아세트산 및 EDTA)(1L): 트리스 염기 121.1g + EDTA 372.24g을 혼합하고 증류수 500mL를 첨가합니다. 마그네틱 교반기로 녹입니다. 아세트산 57.1mL를 넣고 증류수를 총 부피 1,000mL에 넣는다.
- 15psi, 121°C에서 15분 동안 오토클레이브하고 최대 6개월 동안 준비될 때까지 실온에서 보관합니다.
- TAE 1x 완충액(1L): TAE 50x 완충액 20mL와 증류수 980mL를 혼합하여 혼합합니다.
- 흄 후드 아래에서 녹은 아가로스에 6μL의 SYBR Green을 넣고 혼합한 다음 유출을 방지하기 위해 접착 테이프로 미리 밀봉된 트레이(및 빗)에 붓습니다. 탁도가 나타날 때까지 젤을 15-25분 동안 그대로 두십시오.
참고: 다른 대체 염료도 사용할 수 있습니다30,31,32,33. - 접착 테이프를 제거하고 젤을 전기 영동 챔버에 넣고 젤을 덮을 수 있도록 충분한 1x TAE 버퍼를 추가합니다.
- 6x DNA 겔 로딩 염료 5μL를 각 반응 25μL와 혼합합니다. 피펫팅으로 위아래로 10회 이상 부드럽게 섞습니다.
참고: 예상 산물을 시각화하기 위해 모든 PCR 산물을 겔에 로드할 필요는 없습니다(해당하는 염료의 양을 조정). 나머지 PCR 샘플은 몇 달 동안 -20°C에서 저장 및 보관할 수 있습니다. - 혼합물을 웰에 넣고(기포가 생기지 않도록 함) 챔버 뚜껑을 내려놓습니다.
알림: 첫 번째 샘플을 두 번째 웰에 넣습니다(첫 번째 웰은 사다리에 예약), 음성 대조군부터 시작합니다. - 1kb DNA 사다리 4μL를 첫 번째 웰에 로드합니다.
- 120V, 400mA 및 60분에서 전기영동을 실행합니다.
- UV 광선 아래에서 젤을 시각화하고(UV 조명기 사용) 이미지를 기록합니다.
참고: PCR 산물이 있는 경우 표준 UV 투과발광체, 가시광선 투과발광기 또는 레이저 기반 스캐너를 사용하여 염색된 DNA 밴드를 검출할 수 있습니다.
| 시약 | 스톡 솔루션 | 50 μL 반응에 부피 추가(1x) | 결승전 | 예: 볼륨 | 예: 볼륨 | 예: 각 튜브에 부피 추가 최종 Vol. 50 μL | 양성 대조군에 추가된 볼륨 | 음성 대조군에 추가된 볼륨 |
| 농도 | 1x에 추가됨 | 3x에 추가됨(풀) | ||||||
| 멸균수 | - | 21.5 μL (q.s. - 50 μL) | - | 21.5 마이크로리터 | 64.5 마이크로리터 | 49 μL/튜브 | 49 μL/튜브 | 49 μL/튜브 |
| 마스터 믹스 | 2배 | 25 μL | 1배 | 25 μL | 75 μL | |||
| 포워드 프라이머 | 25 마이크로미터 | 1 μL | 0.5 마이크로미터 | 1 μL | 3 μL | |||
| 리버스 프라이머 | 25 마이크로미터 | 1 μL | 0.5 마이크로미터 | 1 μL | 3 μL | |||
| 템플릿 DNA | 가변(100–200 ng/μL) | 가변(1μL) | 변수 | 0.5 μL | 1.5 μL | |||
| 중합 효소 | 5단위/μL | 0.5 μL | 2.5 단위 | - | - | 1 μL (트랜스콘쥬간제) | 1 μL (기증자) | 1 μL (수용자) |
| 참고 : q.s.는 필요한 양을 의미하는 quantum satis의 라틴어 약어입니다. | ||||||||
표 1: 3가지 반응에 대한 PCR 시약 및 풀(예).
| 프라이머(5' - 3' 방향으로 나열된 순서) | PCR 프로그램 | 예상 크기 |
| (비피) 참조. | ||
| ᄏ�� | 94 oC 7 분 | (864) 23 |
| CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC | 94 oC 50 s (35 사이클) | |
| CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC | 50 oC 40 초 | |
| 68 oC 1 분 | ||
| 68 oC 5 분 | ||
| ᄏ�� | 95 oC 3 분 | (1855) 24 |
| CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG | 95 oC 30 s (30 사이클) | |
| CMY-2-R: 타아아아아 | 53 oC 30 초 | |
| 72 oC 30 초 | ||
| 72 oC 3 분 | ||
| aac(3')-II | 94 oC 5 분 | (237) 25 |
| AAC(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC | 94 oC 30 s (32 사이클) | |
| aac(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA | 60 °C 45 초 | |
| 72 oC 2 분 | ||
| 72 oC 8 분 | ||
| 아드A | 94 oC 5 분 | (283) 26 |
| aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG | 94 oC 1 분 (35 사이클) | |
| aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG | 60 oC 1 분 | |
| 72 oC 1 분 | ||
| 72 oC 8 분 | ||
| 술-3 | 94 oC 5 분 | (799) 27 |
| sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG | 94 oC 1 분 (30 사이클) | |
| sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA | 51 oC 1 분 | |
| 72 oC 1 분 | ||
| 72 oC 5 분 | ||
| 테트(A) | 95 oC 5 분 | (957) 28 |
| TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC | 95 oC 30 s (23 사이클) | |
| TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT | 62 oC 30 초 | |
| 72 oC 45 초 | ||
| 72 oC 7 분 | ||
| 증권 시세 표시기 A | 95 oC 5 분 | (302) 이 작품 |
| dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG | 95 oC 1 분 (30 사이클) | |
| 55 oC 1 분 | ||
| dfrA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG | 72 oC 1 분 | |
| 72 oC 7 분 | ||
| 고양이 A2 | 95 oC 5 분 | |
| catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC | 95 oC 1 분 (25 사이클) | (225) 이 작품 |
| catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT | 60 oC 1 분 | |
| 72 oC 1 분 | ||
| 72 oC 7 분 |
표 2: 진단 내성 유전자를 증폭하는 데 사용되는 프라이머 및 PCR 프로그램.
| 레플리콘 | 프라이머(5' - 3' 방향으로 나열된 순서) | 과녁 | PCR 프로그램 | 예상 크기(bp) | |||
| 인피브 | F: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCAC | repA | 94 oC 5 분 | 683 | |||
| R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT | 94 oC 1 분 (30 사이클) | ||||||
| 60 °C 30 초 | |||||||
| 인피씨 | F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG | repA2 | 72 oC 1 분 | 262 | |||
| R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT | 72 oC 5 분 | ||||||
| IncI1 | F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA | 증권 시세 표시기 | 139 | ||||
| R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT | |||||||
표 3: PCR 기반 복제 유형29에 의해 플라스미드 p134797 및 p101718을 분류하는 데 사용되는 프라이머 및 PCR 프로그램.
Representative Results
공여체 SW4955 및 SW7037이 시퀀싱되었다는 점을 감안할 때, 이 두 공여체 균주는 게놈 서열에서 확인된 내성 유전자 프로파일에 해당하는 내성 표현형을 가질 것으로 예상됩니다. 플라스미드 p134797(SW4955)은 3세대 세팔로스포린(blaCTX-M-55)에 대한 내성과 아미노글리코사이드(aac(3)-IIa 및 aadA1), 페니콜(catA2), 테트라사이클린(tet(A)), 트리메토프림(dfrA14) 및 설폰아미드(sul3); SW4955 염색체에서 항생제 내성 유전자는 발견되지 않았습니다. 플라스미드 p101718(SW7037)은 3세대 세팔로스포린(blaCTX-M-55)에 대한 내성을 부여할 것으로 예상되는 하나의 항생제 내성 유전자(blaCMY-2)만 가지고 있습니다. 다시 말하지만, SW7037 염색체에서 항생제 내성 유전자가 발견되지 않았습니다.
짝짓기 후, 상기 언급된 모든 내성 유전자를 보유하는 2개의 접합 플라스미드의 전달의 검출이 예상되었다. 양성 접합 검출은 transconjugants로 확인된 수용자가 접합 플라스미드를 획득했어야 함을 의미합니다. 트랜스접합체에서 접합 플라스미드에 대한 진단 내성 유전자의 존재(PCR에 의해 검출됨)도 예상되었습니다.
여기에 기술된 방법을 설명하기 위해, 접합에 의해 플라스미드 DNA를 전달하는 2개의 대장균 환경 단리주의 능력을 시험하였다. 실험 설정의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 2명의 기증자(E. coli SW4955 및 SW7037)와 1명의 수혜자(E. coli LMB100)를 독립적으로 교미했습니다. 대장균 SW4955 (p134797) 및 SW7037 (p101718)에서 발견되는 접합 플라스미드의 유전자 맵은 그림 2에 나와 있습니다.
접합 플라스미드는 카르베니실린으로 선택되었고 내성 결정인자는 수용자의 염색체에 있는 리팜핀과 스트렙토마이신을 사용하여 반대 선택되었습니다. MacConkey 한천은 유당 양성 기증자(큰 분홍색 콜로니를 생성함)를 수혜자 및 트랜스콘쥬간체(유당 음성이고 더 작고 옅은 노란색 콜로니를 생성함)와 구별하는 데 사용되었습니다(그림 3).
그림 3: MacConkey 한천의 기증자 및 수용자 콜로니에 대한 차등 색상 마커 그림. 기증자에 해당하는 식민지는 유당 양성이기 때문에 MacConkey 한천에서 분홍색입니다. 이것은 기증자를 옅은 노란색과 더 작은 수혜자 콜로니와 구별합니다(유당 음성). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
접합 플라스미드 p134797의 동원이 검출되었으며, 플라스미드에서 발견된 5가지 다른 종류의 내성 유전자에 해당하는 5가지 항생제 각각이 검출되었습니다.
변형 SW4955에 대한 접합 효율(CE)을 계산하는 방법의 예가 제시되어 있습니다. 균주 SW4955를 사용한 분석으로부터, 172 CFU의 트랜스콘쥬간체를 희석 10-2로부터 플레이트에서 계수하였다; 해당 희석(10-2)의 수용자 수는 10,300,000 CFU/mL였습니다(표 4).
CE는 다음과 같이 계산됩니다.
CE = (174 CFU/mL)/(10,300,000 CFU/mL)
CE= 1.67 x 10-5 transconjugants/recipient
| LMB100 시리즈 | Carbelicillin으로 선택된 균주 SW4955의 Transconjugants | 활용 효율 | ||
| 희석 | CFU(계산 가능한 플레이트) | 약 CFU/mL | CFU(계산 가능한 플레이트) | |
| 100 | 합류하는 | 1.03E+09 | ||
| 10-1 | 합류하는 | 1.03E+08 | ||
| 10-2 | 합류하는 | 10300000 | 172 | 1.67 x 10-5 transconjugants/recipient |
| 10-3 | 합류하는 | 1030000 | ||
| 10-4 | 합류하는 | 103000 | ||
| 10-5 | 합류하는 | 10300 | ||
| 10-6 | 합류하는 | 1030 | ||
| 10-7 | 103 | 103 | ||
| CE를 계산하는 데 사용되는 값은 굵게 강조 표시됩니다. | ||||
표 4: 균주 SW4955에 대한 접합 효율(CE)을 계산하는 방법의 예.
그 결과를 수용자당 접합 효율로 나타내어 표 5에 나타내었다. 기증자로서 균주 SW4955를 사용하여 얻은 5가지 접합 효율은 모두 동일한 크기 내에 있었습니다. 이러한 결과는 접합성 플라스미드의 동원이 형질접합체 식별에 사용되는 선택에 관계없이 검출될 수 있음을 나타낸다.
균주 SW7037을 공여체로 사용하여 얻은 접합 효율은 3배 더 낮았습니다. 이러한 결과를 통해 동일한 수용자와 서로 다른 기증자 및 플라스미드 유형의 접합 효율을 비교할 수 있습니다.
| 활용 효율 | |||||
| 거르다 | 카르베니실린(100mg/L) | 겐타마이신(2mg/L) | 클로람페니콜 (25 mg/L) | 테트라사이클린(10mg/L) | 트리메토프림(20mg/L) |
| SW4955 시리즈 | 1.67 x 10-5 | 5.67 엑스 10-5 | 2.17 엑스 10-5 | 7.62 엑스 10-5 | 1.36 엑스 10-5 |
| SW7037 시리즈 | 2.14 x 10-6 | ||||
표 5: 선택에 사용된 항생제에 따른 대장균 기증자 균주 SW4955 및 SW7037의 접합 효율.
트랜스컨쥬간체에서, 시험된 2개의 컨쥬게이션 플라스미드에 코딩된 레플리콘 및 모든 내성 유전자의 존재 및 이들의 상응하는 리플리콘을 PCR에 의해 확인하였다. 이들 진단용 PCR 반응에 사용된 조건은 표 3에 제시되어 있다.
진단 젤은 그림 4에 나와 있습니다. 이 겔은 transconjugants (p1347975의 IncFIC 및 IncFIB 및 p101718의 IncI1)에서 예상되는 replicon의 존재를 확인합니다. 또한 예상되는 항생제 내성 유전자, 즉 p1347975에 대한 bla CTX-M-55 그룹 (베타-락탐), aac (3) -II 및 aadA (아미노 글리코 시드), catA2 (페니 콜), tet (A) (테트라 사이클린), dfrA14 (트리 메토 프림) 및 sul3 (sulphonamide) 및 p1347975에 대한 blaCMY-2 (그림 4).
그림 4: 진단용 전기영동 젤. 공여 세포(각각 SW4955 및 SW7037 균주) 및 상응하는 LMB100 형질접합체에서 접합 플라스미드 p134797 및 p101718에서 발견되는 항생제 내성 유전자 및 플라스미드 레플리콘의 PCR 산물의 겔 전기영동. 카르베니실린은 플라스미드 선별에 사용되었다. 약어. - 음성 대조군 (LMB100 균주의 DNA는 음성 대조군으로 사용되었다); D: 기증자; T: transconjugant. 예상 앰플리콘 크기: blaCTX-M-55: 864 pb; AAC(3)-IIa: 237bp; aadA1: 283 bp; catA2: 225bp; 테트(A): 957bp; dfrA14: 302 bp; 술3: 799 bp; IncFIC (FII) : 262 bp; IncFIB: 683 bp; ᄏᄏ�� IncI1-I: 139bp. 겔은 1% 아가로스를 함유한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
접합 플라스미드는 재조합 및 수평적 유전자 전달을 통해 특정 환경 환경 내에서 유전자의 공동 풀에 대한 접근을 제공한다34. 따라서 접합 플라스미드는 박테리아가 여러 조건(항생제에 대한 내성, 금속에 대한 내성, 금속 획득, 생물막 형성 및 병원성 유전자 등)에 적응할 수 있도록 하는 기능을 획득하고 부여할 수 있는 진화적 실체입니다.
이 연구는 박테리아에서 접합 플라스미드를 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜이 작동하려면 사용된 마커가 배지 A와 B의 대조군에서 볼 수 있듯이 기증자와 수혜자 균주를 구별해야 합니다. 또한 플라스미드를 운반하는 세포를 효과적으로 선택해야 합니다. 짝짓기 반응이 중요합니다. 이 반응에서 기증자와 수혜자는 접합이 일어나기 위해 장기간의 접촉(필리를 통해)을 해야 합니다. 불충분한 배양 시간이나 배양을 흔들거나 교반하는 것과 같이 세포 간 접촉을 방해할 수 있는 모든 것은 접합 효율을 감소시킵니다. 수용자의 선택은 또한 중요한데, 일부 수용자 균주는 접합에 불응하기 때문이다35,36. LMB100은 여러 비호환성 유형의 플라스미드를 취할 수 있기 때문에 선택의 수혜자로 제안됩니다.
접합 속도는 각 플라스미드-공여자 염색체 쌍, 수용자 및 환경 조건에 따라 다릅니다. 특정 플라스미드의 접합은 성장기, 세포 밀도, 공여체 대 수용자 비율, 접합이 액체 또는 고체 매질에서 수행되는지 여부, 탄소, 산소, 담즙염, 금속 농도, 포유동물 세포의 존재, 온도, pH 및 짝짓기 시간을 포함하는 많은 변수에 민감한 것으로 밝혀졌습니다13,14,15 . 이러한 상호 작용에 대한 연구는 심층적으로 연구할 접합 플라스미드의 초기 검출에 달려 있습니다. 따라서 여기에 설명된 프로토콜은 다양한 실험 변수의 영향을 탐색하기 위해 수정할 수도 있지만 선별된 기증자의 수를 제한하는 대가를 치르게 됩니다. 또한, 헬퍼 플라스미드(즉, 트랜스6의 동원 가능한 플라스미드로부터 결여된 기능을 제공함으로써 접합을 가능하게 하는 플라스미드)를 갖는 숙주에서 동원 가능한 플라스미드를 확인할 수 있다.
접합 플라스미드의 서열을 아는 것이 좋습니다(그러나 위에서 논의한 바와 같이 접합을 검출할 필요는 없음). 공여자가 유당 음성인 경우(MacConkey 한천에서 노란색 콜로니 생성), 유당 양성 수용자(MacConkey 한천에서 분홍색 콜로니 생성)를 사용하여 배지에서 성장할 수 있는 기증자 세포와 진정한 형질전환 접합체를 구별하여 형질전환 접합체를 선택할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 장내세균과(Enterobacteriaceae)의 환경적, 공생적 및 병원성 구성원으로부터 접합 플라스미드를 검출하도록 설계되었습니다. 그러나 적절한 기증자, 수혜자, 항생제 및 색상 마커가 있는 모든 박테리아 종과 함께 사용할 수 있습니다. 다른 박테리아에서 이러한 중요한 구성 요소를 식별하려면 여러 기증자, 수혜자 및 마커(항생제 및 색상)를 사용한 체계적인 연구가 필요합니다. 이 프로토콜은 그람 양성균에서 테스트되지 않았습니다.
여기에 제시된 방법의 여러 변형이 문헌에 보고되었으며, 최근20개가 검토되었다. 정성적 결과는 또한 다양한 방식으로(예: 접합 빈도 및 유전자 전달 빈도) 참조할 수 있으며 무차원 단위를 사용하여 접합 효율(mL/CFU x h)을 보고할 수 있습니다20.
여기에 설명된 프로토콜은 기존의 방법(16,18,19,20)에 의해 이전에 다루어지지 않았던 몇 가지 제한사항을 해결한다. 먼저, 적합한 수신자가 확인되었습니다. 둘째, 진정한 형질전환체를 선택하기 위해 두 가지 항생제(리팜핀 및 스트렙토마이신)를 사용하면 기증자가 자발적인 돌연변이 유발을 통해 형질전환체를 선택하는 데 사용되는 항생제 중 하나에 대한 내성을 진화시킬 가능성을 최소화합니다. 거짓 형질전환체는 또한 공여자에 의해 대량으로 생산된 효소(예: 베타-락타마제)에 의해 형질전환체를 선택하는 데 사용되는 항생제의 가수분해에 의한 방관자 보호로부터 발생할 수 있습니다. 셋째, 짝짓기 산물이 진정한 형질전환체(즉, 공여자의 접합 플라스미드를 안정적으로 통합한 수용자 세포)인지 확인하기 위해 몇 가지 실험 대조군이 포함된다. 여기에서 우리는 transconjugants의 진위를 테스트하기 위한 두 가지 독립적인 방법, 즉 MacConkey 한천의 비색 마커와 수용자에서 접합 플라스미드의 레플리콘 및 항생제 내성 유전자의 PCR 검출을 제시했습니다. 또한, 여기에 기술된 프로토콜은 장내세균과(Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella 및 기타 종)의 환경적, 공생적 및 병원성 구성원으로부터 접합 플라스미드를 분리하고 특성화하도록 설계되었습니다.
접합 역학을 이해하기 위해 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 실험적 관찰을 모델링했습니다. 이러한 예측 모델은 기증자, 수용자 및 형질전환체의 주어진 성장 밀도에 대한 플라스미드 전달의 빈도를 추정합니다. 종말점 모델(endpoint model)로 알려진 모델은 액체 배양에서 플라스미드 전달 속도보다 높은 임계값을 발견했으며, 전달 속도는 세포 밀도, 기증자:수용자 비율 및 짝짓기 시간에 영향을 받지 않는다고 결론지었습니다19. 형광 in situ 하이브리드화(FISH)는 트랜스콘쥬간트 플라스미드 검출의 대안적인 방법으로 사용되어 왔다. FISH는 DNA 프로브와 표적 DNA의 혼성화를 통해 형광 현미경을 사용하여 플라스미드를 시각화할 수 있습니다. 따라서, FISH는 상이한 세포 집단(37)에 걸친 플라스미드 흐름의 시각적 검출을 허용하지만, 트랜스접합체가 선택과 반대되는 시각적 스크리닝에 의해 검출되는 경우 여기에 제시된 방법과 동일한 수준의 민감도를 갖지는 않는다.
생태계의 다양한 구성 요소(클리닉, 농업, 하수, 야생 동물, 가축, 토양, 강 및 호수)를 통해 항생제 내성 유전자를 분산시키는 접합 플라스미드의 생물학을 이해하는 데 엄청난 필요성이 있습니다. 요컨대, 여기에 설명된 프로토콜에 제시된 단순화된 실험 조건은 대규모로 기증자의 스크리닝을 용이하게 하며, 따라서 다양한 출처의 접합 플라스미드에서 유래하는 수평 유전자 전달 연구를 위한 핵심 도구를 나타냅니다. 여러 출처 및 박테리아의 접합 플라스미드에서 항생제 내성 유전자 또는 기타 임상적으로 관련된 유전자의 유병률을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그들은 또한 생체 내 (예: 척추동물의 장에서) 접합 연구 및 접합 효율을 조절하는 조건을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 이 모든 연구는 다제내성 접합 플라스미드의 동원이 다제내성의 확산에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
LM-B, IMG, AT 및 IS는 LM-B에 수여된 NIH 보조금 GM055246의 지원을 받았습니다. GC-C는 AY 2017-18 및 2018-19에 2 년 연속 UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship을 수상했습니다. 실험에 대한 기술 지원을 위해 Genentech-Foundation이 후원하는 GAIN(Academic Inspiration Network) 멘토링 프로그램의 Sage Chavez와 Pepper St. Clair 학생에게 큰 감사를 드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
| 2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
| 14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
| 14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
| 250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
| Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
| Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
| Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
| DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
| EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
| Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
| Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
| Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
| Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
| Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
| Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
| Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
| MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
| Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
| Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
| Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
| Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
| PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
| PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
| Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
| Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
| Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
| Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
| Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
| Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |
References
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