Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Påvisning av horisontal genoverføring mediert av naturlige konjugative plasmider i E. coli

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64523
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1, 2
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

Summary

Konjugering medierer horisontal genoverføring ved å mobilisere plasmid-DNA over to forskjellige celler, noe som letter spredningen av gunstige gener. Dette arbeidet beskriver en mye brukt metode for effektiv påvisning av konjugativ plasmidoverføring, basert på bruk av differensialmarkører i konjugativ plasmid, donor og mottaker for å oppdage transkonjugering.

Abstract

Konjugering representerer en av hovedmekanismene som muliggjør horisontal genoverføring i gramnegative bakterier. Dette arbeidet beskriver metoder for studier av mobilisering av naturlig forekommende konjugative plasmider, ved hjelp av to naturlig forekommende plasmider som et eksempel. Disse protokollene er avhengige av differensiell tilstedeværelse av valgbare markører i donor, mottaker og konjugativ plasmid. Spesielt inkluderer de beskrevne metodene 1) identifisering av naturlige konjugative plasmider, 2) kvantifisering av konjugasjonshastigheter i fast kultur, og 3) diagnostisk påvisning av antibiotikaresistensgener og plasmidreplicontyper hos transkonjugante mottakere ved polymerasekjedereaksjon (PCR). Protokollene beskrevet her er utviklet i sammenheng med å studere evolusjonær økologi av horisontal genoverføring, for å skjerme for tilstedeværelse av konjugative plasmider som bærer antibiotikaresistensgener i bakterier som finnes i miljøet. Den effektive overføringen av konjugative plasmider observert i disse forsøkene i kultur fremhever den biologiske relevansen av konjugering som en mekanisme som fremmer horisontal genoverføring generelt og spredning av antibiotikaresistens spesielt.

Introduction

I 1946 beskrev Lederberg og Tatum1 en seksuell prosess i Escherichia coli K-12 som nå er kjent som konjugering. Bakteriell konjugering er prosessen der en bakteriecelle (donoren) overfører ensrettet genetisk materiale til en annen celle (mottakeren) ved direkte celle-til-celle-kontakt. Konjugering er bredt fordelt i bakterier2,3, selv om fraksjonen av donorceller som uttrykker konjugasjonsmaskineriet vanligvis er svært liten4.

Plasmider er autonomt replikerende ekstrakromosomale DNA-elementer. I tillegg til gener som er involvert i plasmidreplikasjon og vedlikehold, bærer plasmider ofte en last med gener som er involvert i tilpasning til miljøutfordringer, for eksempel tungmetaller eller eksponering for antibiotika5. Konjugative plasmider er en klasse av plasmider med et sett spesialiserte gener som tillater overføring til mottakerceller og støtter deres utholdenhet etter overføringen6. Konjugative plasmider varierer i størrelse fra 21,8 kb til 1,35 Mb i bakterier i phylum Pseudomonadota (synonymt med proteobakterier), med medianen rundt 100 kb 5,7. De har også generelt et lavt kopinummer, muligens for å holde den metabolske byrden på verten lav 8,9.

Det typiske konjugative apparatet består av fire komponenter: en overføringsopprinnelse (oriT), en relaxase, et type IV-koblingsprotein og et type IV-sekresjonssystem (en rørlignende struktur kalt pilus som gjør det mulig for givere å kontakte mottakere)6. Bare en svært liten brøkdel av cellene som bærer konjugative plasmider uttrykker konjugasjonsmaskineriet4, men hvis plasmidene gir en kondisjonsfordel, kan transkonjugantene raskt ekspandere i populasjonen. Mellom 35% og over 80% av E. coli-isolater samlet fra forskjellige habitater har konjugative plasmider med gener som gir resistens mot minst ett antibiotika10,11; Derfor er horisontal genoverføring mediert av konjugative plasmider en viktig mekanisme som driver den globale spredningen av antibiotikaresistensgener12.

Parringseksperimenter utført i laboratoriekultur har vist at konjugasjonsfrekvensen påvirkes av flere faktorer, inkludert mottakercellens natur, vekstfase, celletetthet, donor-til-mottaker-forhold, om konjugering utføres i flytende eller faste medier, karbon, oksygen, gallsalter, metallkonsentrasjoner, tilstedeværelse av pattedyrceller, temperatur, pH og parringstid13,14, 15.

Dette arbeidet beskriver protokoller for å oppdage tilstedeværelsen av konjugative plasmider i en gitt vertsstamme, for å kvantifisere konjugasjonshastighetene i fast kultur, og for å dobbeltsjekke overføringen til mottakerceller. Disse protokollene kan brukes som et første skritt for identifisering av naturlige konjugative plasmider egnet for forskning. De bruker et minimum antall forenklede trinn fordi de er utformet for å skjerme tilstedeværelsen av konjugative plasmider i bakterier oppnådd fra flere kilder (miljømessige, kommersielle og patogene) i skala (dusinvis til hundrevis av givere).

I tillegg vises tester for å oppdage om mobiliseringen av et gitt konjugativ plasmid er uavhengig av antibiotika som brukes til deteksjon (dvs. relevansen av antibiotikaresistensgenet under seleksjon) og for å sammenligne konjugasjonsratene for to konjugative plasmider funnet i forskjellige miljøisolater.

Basert på den genetiske sammensetningen av de relevante konjugative plasmidene (plasmid replicon og antibiotikaresistensgensammensetning), kan hvert trinn i protokollen modifiseres for å studere virkningen av en rekke faktorer som sannsynligvis vil påvirke konjugasjonshastigheten.

Generell eksperimentell design:
De essensielle komponentene som trengs for å sette opp et parringseksperiment er donorceller, en mottakerstamme og faste medier for å velge givere (antibiotika A), mottakere (antibiotika B) og transkonjuganter (antibiotika A og B). Transkonjuganter er mottakerceller som stabilt opprettholder donorens konjugative plasmid.

Donorceller er resistente mot antibiotika (antibiotikum A) og er følsomme for markøren eller markørene som brukes til å velge mottakerceller (antibiotika B). Den genomiske plasseringen av antibiotikaresistensgenet (dvs. om det er lokalisert i kromosomet eller et plasmid av donorcellen) trenger ikke å være kjent a priori, fordi mobilisering av antibiotikaresistensmarkører til mottakeren (etter en direkte donor-mottakerkontakt) innebærer at de donorleverte markørene var i et plasmid.

En mottakerstamme (kjent for å ta konjugative plasmider) må ha en stabil valgbar markør som ikke er tilstede i donoren; Denne valgbare markøren er generelt resistent mot et antibiotika eller biocid som ligger i kromosomet. Valget av mottakeren som skal brukes i parringsforsøk er kritisk, fordi noen E. coli-stammer varierer i deres evne til å ta konjugative plasmider16.

Når disse komponentene er etablert, er enhver koloni som vokser på medier med begge antibiotika (A og B) etter en donor-mottakerparkontakt, en antatt transkonjugant (figur 1). Dette forutsetter at donorer kan vokse i medier med antibiotika A, men ikke kan vokse i medier med antibiotika B, og at mottakere er i stand til å vokse i media med antibiotika B, men ikke i stand til å vokse med antibiotika A. Transkonjugering kan bekreftes ved hjelp av to diagnostiske tester. Den første testen består av deteksjon (ved polymerasekjedereaksjon [PCR] amplifisering av gener eller andre metoder) av gener funnet i det konjugative plasmidet i transkonjugante kolonier. Den andre testen innebærer bruk av differensialkolonifargemarkører basert på laktosemetabolisme. Differensialkolonifargen avsløres ved bruk av MacConkey-agar; Laktosen i agar kan brukes som gjæringskilde av laktosefermenterende (LAC+) mikroorganismer. Disse mikroorganismene produserer organiske syrer, spesielt melkesyre, som senker pH. Nøytral rød er en pH-indikator inkludert i mediet som går fra off-white til lys rød / rosa når pH faller under 6,817. Dermed produserer E. coli laktose-positive stammer større rosa kolonier på MacConkey agar, mens laktose-negative stammer produserer blekgule og mindre kolonier på MacConkey agar.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell design brukt for å påvise tilstedeværelse av konjugative plasmider i donorstammer. I dette eksemplet bærer giveren et konjugativ plasmid med et antibiotikaresistensgen som gir resistens mot antibiotika A, men de er utsatt for antibiotika B. Omvendt har mottakeren en kromosomresistensdeterminant som gir beskyttelse mot antibiotika B, men det er mottakelig for antibiotika A. Transkonjuganter er resistente mot begge antibiotika (A og B), fordi de har det konjugative plasmidet til donoren som gir resistens mot antibiotika A og kromosomet til mottakeren som gir beskyttelse mot antibiotika B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Konjugasjonsraten for et donor-mottakerpar (under gitte eksperimentelle forhold) kan beregnes ved å dele antall transkonjuganter med antall givere eller med antall mottakere; Den første satsen indikerer brøkdelen av donorceller som viser funksjonelt uttrykk for konjugasjonsmaskineriet av donoren16,18, mens den andre satsen indikerer mottakerens evne til å ta konjugative plasmider 19,20. I denne studien, med mindre annet er oppgitt, representerer konjugasjonsraten brøkdelen av mottakerceller som blir transkonjugante (dvs. rate per mottaker).

Her rapporteres to uavhengige parringsforsøk, som involverer en E. coli-mottaker og to E. coli-donorer. I tillegg ble forskjellige antibiotika brukt til å velge transkonjuganter for en av donorene for å bekrefte at et enkelt multiresistent plasmid kan velges med noen av antibiotikaresistensgenene som finnes i det konjugative plasmidet.

Donor- og mottakerstammene som brukes i dette arbeidet har blitt fullstendig sekvensert for å forstå alle komponenter i dette eksperimentelle systemet; Imidlertid ble disse protokollene designet for å skjerme for tilstedeværelse av konjugative plasmider i verter av ukjent sekvens, og kan også brukes i denne eksperimentelle konteksten; Men i dette tilfellet sekvenseres de relevante genene først.

Donor- og mottakerstammene som brukes i protokollen er følgende:

Giver 1. E. coli SW4955 ble samlet inn i en innsjø i Baton Rouge (LA, USA). Den har et 134 797 bp konjugativ plasmid (p134797) med IncFIC (FII) og IncFIB (AP001918) svar. Dette konjugative plasmidet har gener som gir resistens mot tredjegenerasjons kefalosporiner (CTX-M-55), aminoglykosider (aac(3)-IIa og aadA1), fenikol (catA2), tetrasykliner (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) og sulfonamider (sul3). For et fullstendig kart over p134797, se figur 2A. E. coli SW4955 er laktosepositiv, og produserer rosa kolonier på MacConkey agar.

Giver 2. E. coli SW7037 ble samlet inn i Lake Erie (Ottawa County, OH, USA). Den bærer et 101 718 bp konjugativ plasmid (p101718) med et IncI1-I (Alpha) svar. Dette konjugative plasmidet har et gen som gir resistens mot betalaktamer (blaCMY-2). For et fullstendig kart over p101718, se figur 2B. E. coli SW7037 er også laktosepositiv, og produserer rosa kolonier på MacConkey-agar.

Figure 2
Figur 2: Genetisk kart over de konjugative plasmidene som er brukt i denne studien. (A) Plasmid p134797, det konjugative plasmidet funnet i E. coli-stamme SW4955. (B) Plasmid p101718, det konjugative plasmidet funnet i E. coli-stamme SW7037. Antibiotikaresistensgener er markert i blått, og gener som tilhører det konjugative apparatet er markert i rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mottaker. E. coli LMB100 brukes som mottaker. Dette er en plasmidløs stamme som er motstandsdyktig mot rifampicin (100 mg / L) og streptomycin (100 mg / L). Å ha resistens mot to antibiotika reduserer muligheten for resistensmutasjoner som oppstår i donoren som vil forstyrre tolkningen av resultatene. I tillegg er E. coli LMB100 laktosenegativ, og kan skilles fra de to donorstammene fordi den produserer blekgule og små kolonier (i motsetning til større, rosa kolonier) på MacConkey agar.

Når donoren er laktosenegativ, anbefaler vi å bruke en laktosepositiv mottaker (f.eks. E. coli J53). LMB100- og J53-stammene er tilgjengelige for andre laboratorier for bruk. Send en forespørsel til Dr. Gerardo Cortés-Cortés sammen med en adresse og FedEx-nummer.

Det solide mediet som trengs for å velge og telle givere, mottakere og transkonjuganter, er MacConkey-agar i petriskåler 100 mm i diameter. Tilsetning av følgende antibiotika er nødvendig: (i) Media A: karbenicillin (100 mg / L) for å telle givere og for å sikre at mottakerne ikke kan vokse med dette antibiotika. (ii) Media B: rifampicin (100 mg / L) + streptomycin (100 mg / L) for å telle mottakere og for å sikre at givere ikke kan vokse i disse to antibiotika. (iii) Media AB: karbenicillin (100 mg/L) + rifampicin (100 mg/L) + streptomycin (100 mg/L) for å oppnå og telle transkonjuganter. (iv) Medium C: ingen antibiotika til å strippe alle isolater som er studert.

Konjugasjonsratene for konjugative plasmider fra E. coli SW4955 og E. coli SW7037 til E. coli LMB100 sammenlignes. I tillegg, når det gjelder p134797 konjugativ plasmid (SW4955-stammen), erstattes antibiotikumet karbenicillin (100 mg / L) med gentamicin (2 mg / L), kloramfenikol (25 mg / L), tetracyklin (10 mg / L), trimetoprim (20 mg / L) eller sulfametoksazol (100 mg / L) i påfølgende eksperimenter for å fastslå om antibiotikaresistensmarkøren som brukes til utvelgelse, har noen innvirkning på resultatene.

Protocol

1. Metode 1: Konjugering

  1. Dag 1: Strek giverne og mottakeren. Strek separat fra glyserollagrene på medium C (MacConkey-agar uten antibiotika), og rug over natten ved 37 °C.
    MERK: Dette trinnet er nødvendig for å sikre at eksperimentet utføres med rene isolater og for å bekrefte laktosefenotypen etter fargen på kolonier.
  2. Dag 2: Merk et dyrkningsrør på 14,0 ml for hver donor og mottaker. Velg en enkelt koloni av hver donor og mottaker, og dyrk dem over natten (18 timer) i separate 14,0 ml dyrkningsrør som inneholder 2 ml Mueller Hinton-buljong ved 37 °C og risting ved 200 o / min.
    MERK: I de anvendte stammene nås den stasjonære fasen etter nattkultur på 18 timer.
  3. Dag 3: Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) av nattens kultur for hver donor og mottaker (ingen vortexing) ved å bruke en 1:10 fortynning av 900 μL saltoppløsning og 100 μL av nattenkulturen.
  4. Juster den optiske tettheten til hver donor og mottaker til 2,0 (OD600 = 2,0) med sterilisert saltoppløsning (0,85 % NaCl i vann).
    MERK: En overnattingskultur av E. coli med en OD600 = 2,0 har 1,6 x 109 CFU / ml.
  5. Merk et 1,5 ml mikrosentrifugerør "parringsrør", som indikerer donor- og mottakerstammer. Overfør 500 μL av den justerte (OD600 = 2,0) suspensjonen av hver donor og mottaker, og legg dem i parringsrøret (dette parringsrøret vil ha 0,8 x 109 CFU / ml av hver donor og mottaker). Bland parringsrøret forsiktig ved inversjon.
  6. Sentrifuger parringsrøret i 10 minutter ved 500 x g ved romtemperatur.
  7. Uten å forstyrre pelleten, pipett ut 800 μL av konjugasjonsrøret. Det skal være 200 μL igjen i konjugasjonsrøret.
    MERK: Kast supernatanten på en 10 % blekemiddelbeholder for å inaktivere bakterier i suspensjonen.
  8. Inkuber parringsrøret i 18 timer (over natten) ved 37 °C i en inkubator. Parring skjer i inkubasjonstiden.
    MERK: Dette trinnet må gjøres uten å riste for ikke å bryte den konjugative pili.
  9. Som en negativ kontroll, strøk over natten kulturen til givere på media B og mottakere på media A. Inkuber platene over natten ved 37 °C
  10. Dag 4: Tilsett 800 mikrol saltoppløsning til parringsrøret og virvelen for å resuspendere (dette rekonstituerer parringsblandingen til 1 ml).
    MERK: Vortexing bryter parringsbakteriene fra hverandre og homogeniserer kulturen for å kvantifisere CFU / ml.
  11. Forbered 1:10 fortynninger (fra 1 x 100 til 1 x 10-7) av parringsblandingen. Plate 100 mikrol fortynning 10-5 til 10-7 på medium A og medium B, og alle fortynninger på media AB.
    MERK: Dlution 100 refererer til det ryddige røret.
  12. La platene tørke før du legger dem i inkubatoren opp ned. Inkuber platene i 18 timer (over natten) ved 37 °C.
  13. Dag 5: Inspiser de negative kontrollene for å sikre at stripene av ren overnattingskultur av givere ikke vokste på media B, og den rene overnattingskulturen til mottakere ikke vokste på media A.
  14. Registrer antall kolonier og fortynninger som kan telles:
    1. Tell koloniene i media A; Dette er giverne. Koloniene skal være rosa (figur 3A,B).
    2. Tell koloniene i media B; Dette er mottakerne og transkonjuganter. Koloniene skal være svakt gule (figur 3C).
    3. Tell koloniene i media AB; Dette er transkonjugantene. Koloniene skal være blekgule.
      MERK: Velg en tellbar plate. En tellbar plate har mellom 30 og 300 kolonier (mer enn 300 kolonier ville være vanskelig å telle, og mindre enn 30 kolonier anses for liten prøvestørrelse for å presentere en nøyaktig representasjon av den opprinnelige prøven).
  15. Beregn hyppigheten av konjugering per donor eller per mottaker
    Frekvens av konjugering per donor = (CFU/ml av transkonjugant [media AB])/ (CFU/ml donorer [media A]) x 100
    Frekvens av konjugering per mottaker = (CFU/ml av transkonjugant [media AB])/ (CFU/ml av mottakere og transkonjuganter [media B]) x 100
    MERK: Konjugasjonsfrekvensen for denne protokollen ble beregnet som transkonjuganter delt på mottakerens nummer, multiplisert med 100. Ifølge litteraturen kan den resulterende mengden av konjugering navngis som ekskonjugant frekvens, genoverføringsfrekvens, konjugasjonsfrekvens, rekombinant utbytte, plasmidoverføringseffektivitet, konjugasjonsfrekvens basert på totalt bakterieantall, andel transkonjuganter, fraksjon av transkonjuganter i mottakerpopulasjonen, transkonjugant frekvens, konjugasjonsfrekvens, logaritmen til konjugasjonshastighet, overføringshastighetskonstant, konjugasjonshastighet per parringspar, konjugasjonskoeffisient, eller konjugasjonseffektivitet20. Denne protokollen refererer til begrepet konjugasjonseffektivitet.
  16. Oppbevar transkonjugantene i glyserollagre ved -80 °C. Følg undertrinnene for å forberede glyserollagre.
    1. Velg en enkelt koloni av transkonjuganter og dyrk dem over natten (18 timer) i 5,0 ml dyrkningsrør som inneholder 2 ml Mueller Hinton-buljong tilsatt karbenicillin (100 mg / L), ved 37 ° C og risting ved 200 o / min.
    2. Merk kryogene hetteglass, som angir navnet på transkonjugant, som følger: Tc + navn på donor + antibiotika av valg i media A (da de er transkonjuganter, er det kjent at deres bakgrunn er mottakerstammen, som allerede er resistent mot streptomycin og rifampicin, men i tillegg har plasmidet som bærer et beta-laktamresistensgen); for eksempel TcU1Carb. Legg til kontinuerlige tall i tilfelle mer enn én transkonjugant fra samme donor må lagres (f.eks. TcU1Carb1, TcU1Carb2, etc.).
    3. Overfør 1 ml av nattens kultur til 1 ml 50% glyserol (v / v; den endelige glyserolkonsentrasjonen skal være 25%) og bland forsiktig ved inversjon. Sett de kryogene hetteglassene på tørris i 15 minutter og oppbevar kryovialene ved -80 °C for fremtidige eksperimenter.
  17. For DNA-ekstraksjon, strek trasnconjugants fra glyserolbestandene på Mueller Hinton-agar supplert med karbenicillin (100 mg / L), og inkuber over natten ved 37 ° C; Følg deretter anbefalingene fra trinn 2.1.

2. Metode 2: Polymerasekjedereaksjon (PCR) for å amplifisere antibiotikaresistensgener og plasmidreplikoner i E. coli-transkonjuganter

MERK: Polymerasekjedereaksjon (PCR) ble utviklet av Dr. Kary Mullis i 1983. PCR avhenger av spesifikke primere (et kort stykke DNA komplementært til en gitt DNA-sekvens som fungerer som et punkt hvor replikasjon kan fortsette, vanligvis 20-40 nukleotider i lengde og ideelt med et guanin-cytosininnhold på 40% -60%), som er glødet til motsatte tråder av en denaturert, dobbeltstrenget DNA-mal og utvidet gjennom en termostabil DNA-polymerase, Dermed genereres en ekstra mal for neste syklus av reaksjoner, noe som fører til eksponentiell forsterkning av den opprinnelige malen21. I denne protokollen ble replicons og resistensgener tilstede i de konjugative plasmidene amplifisert for å bekrefte overføringen i transkonjugante mottakerceller.

  1. DNA-ekstraksjon
    1. For å oppdage overføring av resistensgener som bæres av konjugative plasmider, bruk transkonjugant DNA som mal. Bruk enkel koke prep ekstraksjon å lyse bakterielle cellevegger.
      MERK: Enkel kokeprep-ekstraksjon er en enkel tilnærming til å lyse bakterielle cellevegger. Denne ekstraksjonen inneholder plasmid-DNA blandet med genomisk DNA, men ettersom primere er designet i henhold til spesifikke DNA-sekvenser av interesse, er denne malen også nyttig for PCR. Plasmider kan også spesifikt renses, selv om utbyttet har en tendens til å falle med økende plasmidstørrelse22. Dette er et praktisk stoppested. DNA kan lagres i flere måneder ved -20 °C.
  2. PCR
    1. Gitt at eksperimentet har en negativ og en positiv kontroll, er det fordelaktig å sette opp et basseng for alle reaksjonene i et 1,5 ml rør. Merk et 1,5 ml rør som "basseng" og de nødvendige PCR-rørene med navnet på genet og prøven (f.eks. OXA-U1).
    2. Pipetter PCR-reagensene i følgende rekkefølge til et 1,5 ml rør: sterilt vann, 2x Master Mix, primere og polymerase (unntatt mal-DNA) (se tabell 1). Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned minst 10 ganger. Hold på is hele tiden.
      MERK: Bruk hansker for å unngå kontaminering av reaksjonsblandingen eller reagensene. Prøv å unngå å åpne og blande reagenser og håndtere prøver i samme område for å forhindre reagenskontaminering. Plasser reagensene i isbøtta for å undertrykke nukleaseaktivitet og ikke-spesifikk priming. La dem tine helt før du setter opp en reaksjon. Hold reagensene på is gjennom hele forsøket. Taq-polymerase tilsettes på slutten fordi den er følsom for pH-endringer; Det må bufres for å unngå nedbrytning eller feilfolding. Sekvensen av primerne er listet opp i tabell 2-antibiotikaresistensgener - og tabell 3-replikk 23,24,25,26,27,28.
    3. Legg mal-DNA til det tilsvarende røret. Unngå å introdusere bobler og sikre lokk på PCR-rørene.
    4. Plasser PCR-rørene i den termiske syklisten.
    5. Start programmet. Se programinnstillingene som er oppført for hvert gen i tabell 2 (resistensgener) og tabell 3 (replikoner).
      MERK: Still inn PCR-programmer til å holde prøvene ved 4 °C etter løpeturen.
      1. PCR-betingelser for replikoner: en syklus med denaturering ved 94 °C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 94 °C i 1 min, glødning ved 60 °C i 30 s, forlengelse ved 72 °C i 1 min, og en endelig forlengelse av en syklus ved 72 °C i 5 minutter.
        MERK: Dette er betingelsene standardisert av Carattoli et al.29.
    6. Når programmet er ferdig, oppbevar PCR-rørene ved 4 °C.
      MERK: Dette er et praktisk stoppested. PCR-produkter kan oppbevares i flere måneder ved -20 °C
    7. Forbered en 1% agarosegel ved å veie 0,6 g agarose i en 250 ml kolbe og tilsette 60 ml 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer (juster reagenser hvis en annen gelstørrelse er nødvendig). Smelt agarosen forsiktig og langsomt i en mikrobølgeovn for å unngå at agarose søler over kolben, og la den avkjøles til ca. 55 °C (10-15 min).
      1. Forbered alle reagensene ved hjelp av ultrarent avionisert vann og analytiske reagenser:
      2. TAE 50x buffer (Tris-base, eddiksyre og EDTA) (1 L): Bland 121,1 g Tris-base + 372,24 g EDTA, og tilsett 500 ml destillert vann. Løs opp med en magnetomrører. Tilsett 57,1 ml eddiksyre, og tilsett destillert vann til et totalt volum på 1000 ml.
      3. Autoklav ved 15 psi, 121 °C i 15 minutter, og oppbevares i romtemperatur til den er klar i opptil 6 måneder.
      4. TAE 1x buffer (1 L): Kombiner 20 ml TAE 50x buffer med 980 ml destillert vann og bland.
    8. Under en avtrekkshette, tilsett 6 μl SYBR Green til den smeltede agarose, bland og hell ut i brettet (og kammen), som tidligere er forseglet med tape for å unngå søl. La gelen stivne i 15-25 min til turbiditet vises.
      MERK: Andre alternative fargestoffer er også tilgjengelige30,31,32,33.
    9. Fjern tapen og legg gelen inn i elektroforesekammeret, og tilsett nok 1x TAE-buffer til å dekke gelen.
    10. Bland 5 μL 6x DNA-gellastingsfargestoff med 25 μL av hver reaksjon. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned minst 10 ganger.
      MERK: Ikke alt PCR-produktet trenger å legges inn i gelen for å visualisere det forventede produktet (juster mengden fargestoff som tilsvarer). Den resterende PCR-prøven kunne lagres ved -20 °C i flere måneder.
    11. Legg blandingen i brønner (unngå å introdusere bobler) og sett kammerlokket ned.
      MERK: Legg den første prøven inn i den andre brønnen (reserver den første til stigen), og start med den negative kontrollen.
    12. Last 4 μL 1 kb DNA-stige inn i den første brønnen.
    13. Kjør elektroforesen ved 120 V, 400 mA og 60 min.
    14. Visualiser gelen under UV-lys (med UV-belysning) og ta bildet.
      MERK: Hvis et PCR-produkt er til stede, kan DNA-bånd farget detekteres ved hjelp av en standard UV-transilluminator, en synlig lystransilluminator eller en laserbasert skanner.
Reagent Lagerløsning Volum tilsatt til 50 μL reaksjon (1x) Finale Eksempel: volum Eksempel: volum Eksempel: volum lagt til hvert rør Final Vol. 50 μL Volum lagt til positiv kontroll Volum lagt til negativ kontroll
Konsentrasjon lagt til 1x lagt til 3x (basseng)
Sterilt vann - 21,5 μL (q.s. til 50 μL) - 21,5 μL 64,5 μL 49 μL/rør 49 μL/rør 49 μL/rør
Master Mix 2x 25 μL 1x 25 μL 75 μL
Forward Primer 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Omvendt primer 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Mal DNA Variabel (100–200 ng/μL) Variabel (1 μL) Variabel 0,5 μL 1,5 μL
Polymerase 5 enheter/μL 0,5 μL 2.5 Enheter - - 1 μL (transkonjugant) 1 μL (donor) 1 μL (mottaker)
MERK: q.s. er en latinsk forkortelse for quantum satis som betyr mengden som trengs.

Tabell 1: PCR-reagenser og pulje for tre reaksjoner (et eksempel). 

Primere (sekvens oppført i 5' - 3' retning) PCR-program Forventet størrelse
(VG Nett) Ref.
blaCTX-M gruppe 1 94 oC 7 min (864) 23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC 94 oC 50 s (35 sykluser)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC 50 oC 40 s
68 oC 1 min
68 oC 5 min
blaCMY-2 95 oC 3 min (1855) 24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG 95 oC 30 s (30 sykluser)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 53 oC 30 s
72 oC 30 s
72 oC 3 min
AAC(3')-II 94 oC 5 min (237) 25
AAC(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC 94 oC 30 s (32 sykluser)
AAC(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 60 oC 45 s
72 oC 2 min
72 oC 8 min
aadA 94 oC 5 min (283) 26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG 94 oC 1 min (35 sykluser)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 8 min
SUL-3 94 oC 5 min (799) 27
SUL-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94 oC 1 min (30 sykluser)
SUL-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA 51 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 5 min
tet(A) 95 oC 5 min (957) 28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95 oC 30 s (23 sykluser)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT 62 oC 30 s
72 oC 45 s
72 oC 7 min
DFR En 95 oC 5 min (302) Dette arbeidet
dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG 95 oC 1 min (30 sykluser)
55 oC 1 min
dfrA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG 72 oC 1 min
72 oC 7 min
catA2 95 oC 5 min
catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC 95 oC 1 min (25 sykluser) (225) Dette arbeidet
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 7 min

Tabell 2: Primere og PCR-programmer brukt til å amplifisere diagnostiske resistensgener. 

Replikon Primer (sekvens oppført i 5' - 3' retning) Mål PCR-program Forventet størrelse (bp)
IncFIB F: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCAC repA 94 oC 5 min 683
R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT 94 oC 1 min (30 sykluser)
60 oC 30 s
IncFIC F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG repA2 72 oC 1 min 262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT 72 oC 5 min
IncI1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA RNAI 139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

Tabell 3: Primere og PCR-program brukt til å klassifisere plasmider p134797 og p101718 ved PCR-basert replikon typing29. 

Representative Results

Gitt at donorene SW4955 og SW7037 har blitt sekvensert, forventes disse to donorstammene å ha resistensfenotypene som tilsvarer resistensgenprofilen identifisert i deres genomiske sekvens. Plasmid p134797 (fra SW4955) har gener som gir resistens mot tredjegenerasjons cefalosporiner (CTX-M-55), og resistens mot aminoglykosider (aac(3)-IIa og aadA1), fenikol (catA2), tetrasykliner (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) og sulfonamider (sul3); ingen antibiotikaresistensgener ble funnet i SW4955-kromosomet. Plasmid p101718 (fra SW7037) bærer bare ett antibiotikaresistensgen (blaCMY-2), som forventes å gi resistens mot tredjegenerasjons cefalosporiner (bla CTX-M-55). Igjen ble det ikke funnet antibiotikaresistensgener i SW7037-kromosomet.

Etter parring ble det forventet påvisning av overføring av de to konjugative plasmidene som bærer alle resistensgenene nevnt ovenfor. Positiv konjugasjonsdeteksjon innebærer at mottakerne identifisert som transkonjuganter skal ha fått de konjugative plasmidene. Tilstedeværelse av de diagnostiske resistensgenene for de konjugative plasmidene i transkonjugantene (påvist ved PCR) var også forventet.

For å illustrere metodene beskrevet her, ble evnen til to E. coli-miljøisolater til å overføre plasmid-DNA ved konjugering testet . En skjematisk fremstilling av den eksperimentelle settingen er vist i figur 1. To donorer (E. coli SW4955 og SW7037) og en mottaker (E. coli LMB100) ble parret uavhengig av hverandre. Genkartet over konjugative plasmider funnet i E. coli SW4955 (p134797) og SW7037 (p101718) er vist i figur 2.

Konjugative plasmider ble selektert med karbenicillin og motselektert ved bruk av rifampicin og streptomycin, hvis resistensdeterminanter er i mottakerens kromosom. MacConkey-agar ble brukt for å skille laktosepositive donorer (som produserer store, rosa kolonier) fra mottaker og transkonjuganter (som er laktosenegative og produserer mindre, blekgule kolonier) (figur 3).

Figure 3
Figur 3: Illustrasjon av differensialfargemarkørene for donor- og mottakerkolonier på MacConkey-agar. Koloniene som tilsvarer donorer er rosa på MacConkey agar fordi de er laktosepositive. Dette skiller donor fra mottakerkolonier, som er blekgule og mindre (laktosenegative). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mobiliseringen av det konjugative plasmidet p134797 ble påvist, med hver av de fem antibiotika som tilsvarer de fem forskjellige klassene av resistensgener som finnes i plasmidet.

Et eksempel på hvordan man beregner konjugasjonseffektiviteten (CE) for stamme SW4955 presenteres. Fra analysen med stamme SW4955 ble 172 CFU av transkonjuganter talt i platen fra fortynning 10-2; mottakerens antall fra tilsvarende fortynning (10-2) var 10 300 000 CFU/ml (tabell 4).

CE beregnes som følger:

CE = (174 CFU / ml) / (10 300 000 CFU / ml)

CE = 1,67 x 10-5 transkonjuganter/mottaker

LMB100 Transkonjuganter fra stamme SW4955 valgt med karbelicillin Bøyningseffektivitet
Fortynning CFU (tellbar plate) Ca. CFU/ml CFU (tellbar plate)
100 Sammenflytende 1,03E+09
10-1 Sammenflytende 1,03E+08
10-2 Sammenflytende 10300000 172 1,67 x 10-5 transkonjuganter/mottaker
10-3 Sammenflytende 1030000
10-4 Sammenflytende 103000
10-5 Sammenflytende 10300
10-6 Sammenflytende 1030
10-7 103 103
Verdier som brukes til å beregne CE er uthevet med fet skrift.

Tabell 4: Et eksempel på hvordan man beregner konjugasjonseffektiviteten (CE) for stamme SW4955.

Resultatene er vist i tabell 5, uttrykt som bøyningseffektivitet per mottaker. De fem konjugasjonseffektivitetene oppnådd ved bruk av stamme SW4955 som donor var alle innenfor samme størrelsesorden. Disse resultatene indikerer at mobiliseringen av det konjugative plasmidet kan detekteres uavhengig av seleksjonen som brukes til transkonjugant identifikasjon.

Ved bruk av stammen SW7037 som donor var den oppnådde konjugasjonseffektiviteten tre størrelsesordener lavere; Disse resultatene gjør det mulig å sammenligne konjugasjonseffektiviteten til forskjellige donorer og plasmidtyper med de samme mottakerne.

Effektiv bøying
Belastning Karbenicillin (100 mg/L) Gentamicin (2 mg/l) Kloramfenikol (25 mg/l) Tetracyklin (10 mg/l) Trimetoprim (20 mg/L)
SW4955 1,67 x 10-5 5,67 x 10-5 2,17 x 10-5 7,62 x 10-5 1,36 x 10-5
SW7037 2,14 x 10-6

Tabell 5: Konjugasjonseffektivitet av E. coli-donorstammer SW4955 og SW7037, avhengig av antibiotika som brukes til valg.

I transkonjuganter ble tilstedeværelsen av replicons og alle resistensgenene kodet i to konjugative plasmider testet, og deres tilsvarende replicons, kontrollert med PCR. Tilstandene som brukes for disse diagnostiske PCR-reaksjonene er vist i tabell 3.

De diagnostiske gelene er vist i figur 4. Disse gelene bekrefter tilstedeværelsen av de forventede replicons i transkonjuganter (IncFIC og IncFIB i p1347975 og IncI1 i p101718). De bekrefter også tilstedeværelsen av de forventede antibiotikaresistensgenene, nemlig bla CTX-M-55-gruppen (beta-laktam), aac(3)-II og aadA (aminoglykosid), catA2 (fenikol), tet(A) (tetracyklin), dfrA14 (trimetoprim) og sul3 (sulfonamid) for p1347975, og blaCMY-2 for p101718 (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Diagnostiske elektroforesegeler. Gelelektroforese av PCR-produkter av antibiotikaresistensgener og plasmidreplikoner funnet i konjugative plasmider p134797 og p101718 i donorcellene (henholdsvis stammer SW4955 og SW7037) og i de tilsvarende LMB100 transkonjuganter. Karbenicillin ble brukt til plasmidseleksjon. Forkortelser. -: negativ kontroll (DNA av stamme LMB100 ble brukt som negativ kontroll); D: donor; T: transkonjugant. Forventede amplikonstørrelser: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 bp; aadA1: 283 bp; catA2: 225 bp; tet(A): 957 bp; dfrA14: 302 bp; SUL3: 799 BP; IncFIC (FII): 262 bp; IncFIB: 683 bp; CMY-2: 1,855 bp; IncI1-I: 139 bp. Gelen har 1% agarose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Konjugative plasmider gir tilgang til en felles pool av gener innenfor en bestemt miljøsetting gjennom rekombinasjon og horisontal genoverføring34. Dermed er konjugative plasmider evolusjonære enheter som er i stand til å anskaffe og tildele funksjoner som tillater bakterier å tilpasse seg flere forhold (inkludert resistens mot antibiotika, resistens mot metaller, oppkjøp av metaller, biofilmdannelse og patogene gener, blant andre) innen en tidsmessig skala av timer.

Dette arbeidet presenterer en protokoll for identifisering av konjugative plasmider i bakterier. For at protokollen skal fungere, må markørene som brukes skille mellom donor- og mottakerstammer, som vist av kontrollene i media A og B. De må også effektivt velge celler som bærer plasmidet. Parringsreaksjonen er kritisk. I denne reaksjonen må givere og mottakere ta langvarig kontakt (gjennom pili) for at konjugering skal skje. Alt som kan forstyrre celle-til-celle-kontakt, for eksempel utilstrekkelig inkubasjonstid eller risting eller omrøring av kulturen, reduserer dermed effektiviteten av konjugering. Valg av mottaker er også kritisk, da noen mottakerstammer er motstandsdyktige mot bøyning35,36. LMB100 er foreslått som mottaker av valg, da det er i stand til å ta plasmider av flere inkompatibilitetstyper.

Konjugasjonshastigheten er spesifikk for hvert plasmiddonorkromosompar, mottaker og miljøtilstand. Konjugeringen av spesifikke plasmider har vist seg å være følsom for et stort antall variabler, inkludert vekstfase, celletetthet, donor-til-mottaker-forhold, om konjugering utføres i flytende eller faste medier, karbon, oksygen, gallesalter, metallkonsentrasjoner, tilstedeværelse av pattedyrceller, temperatur, pH og parringstid13,14,15 . Studien av disse interaksjonene avhenger av den første påvisningen av et konjugativ plasmid som skal studeres i dybden. Dermed kan protokollen beskrevet her også modifiseres for å utforske virkningen av forskjellige eksperimentelle variabler, selv om dette kommer på bekostning av å begrense antall screenede givere. Det kan også identifisere mobiliserbare plasmider i verter som har hjelperplasmider (dvs. plasmider som muliggjør konjugering ved å gi funksjoner som mangler fra de mobiliserbare plasmidene i trans6).

Å vite sekvensen av det konjugative plasmidet anbefales (men ikke nødvendig for å oppdage konjugering, som diskutert ovenfor). Når donorene er laktosenegative (produserer gule kolonier på MacConkey agar), kan en laktosepositiv mottaker (som produserer rosa kolonier på MacConkey agar) brukes til å skille ekte transkonjuganter fra donorceller som er i stand til å vokse på media for å velge transkonjuganter. Protokollen beskrevet her er designet for å oppdage konjugative plasmider fra miljømessige, kommersielle og patogene medlemmer av familien Enterobacteriaceae; Den kan imidlertid brukes med alle bakteriearter med egnet donor, mottaker, antibiotika (er) og fargemarkører. Identifiseringen av disse kritiske komponentene i andre bakterier krever systematiske studier ved bruk av flere givere, mottakere og markører (antibiotika og farger). Denne protokollen er ikke testet i grampositive bakterier.

Flere varianter av metoden presentert her er rapportert i litteraturen, nylig gjennomgått20. Det kvalitative utfallet kan også refereres til på forskjellige måter (f.eks. ekskonjugant frekvens og genoverføringsfrekvens), og dimensjonsløse enheter kan brukes til å rapportere konjugasjonseffektivitet (ml/CFU x h)20.

Protokollen beskrevet her løser flere begrensninger som tidligere ikke var adressert av eksisterende metoder:16,18,19,20. Først er det identifisert en egnet mottaker. For det andre minimerer bruken av to antibiotika (rifampicin og streptomycin) for å velge ekte transkonjuganter muligheten for at donorer utvikler resistens mot en av antibiotika som brukes til å velge transkonjuganter gjennom spontan mutagenese. Falske transkonjuganter kan også skyldes tilskuerbeskyttelse ved hydrolyse av antibiotika som brukes til å velge transkonjuganter av enzymer (f.eks. beta-laktamaser) produsert i store mengder av giveren. For det tredje er flere eksperimentelle kontroller inkludert for å sikre at parringsproduktet er en ekte transkonjugant (dvs. en mottakercelle som stabilt har innlemmet donorens konjugative plasmid). Her presenterte vi to uavhengige metoder for å teste autentisiteten til transkonjugantene, nemlig en kolorimetrisk markør i MacConkey agar, og PCR-påvisning av replikonene og antibiotikaresistensgenene til det konjugative plasmidet hos mottakeren. Protokollen beskrevet her er også designet for å isolere og karakterisere konjugative plasmider fra miljømessige, kommersielle og patogene medlemmer av familien Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella og andre arter).

For å forstå konjugasjonsmekanikken har eksperimentelle observasjoner blitt modellert ved hjelp av datasimuleringer. Disse prediktive modellene estimerer frekvensen av plasmidoverføring for gitte veksttettheter av donorer, mottakere og transkonjuganter. En modell kjent som endepunktsmodellen fant terskler over hvilken hastigheten av plasmidoverføring i væskekultur, og konkluderte med at overføringshastigheten er upåvirket av celletetthet, donor: mottakerforhold og parringstid19. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) har blitt brukt som en alternativ metode for transkonjugant plasmiddeteksjon. FISH tillater plasmidvisualisering ved hjelp av fluorescensmikroskopi gjennom hybridisering av en DNA-sonde og et mål-DNA. Dermed tillater FISH visuell deteksjon av plasmidstrømmer over forskjellige cellepopulasjoner37, selv om den ikke har samme følsomhetsnivå som metoden som presenteres her hvis transkonjuganter oppdages ved visuell screening i motsetning til seleksjon.

Det er et enormt behov for å forstå biologien til konjugative plasmider som sprer antibiotikaresistensgener gjennom forskjellige komponenter i økosystemet (klinikk, landbruk, kloakk, dyreliv, husdyr, jord, elver og innsjøer). I sum letter de forenklede eksperimentelle betingelsene som presenteres i protokollene beskrevet her, screening av donorer i stor skala, og representerer dermed et sentralt verktøy for studiet av horisontal genoverføring med opprinnelse i konjugative plasmider fra en rekke kilder. De kan brukes til å undersøke forekomsten av antibiotikaresistensgener eller andre klinisk relevante gener i konjugative plasmider fra flere kilder og bakterier. De kan også tilpasses for studier av konjugering in vivo (f.eks. i tarmen til virveldyr) og for å studere forholdene som modulerer effektiviteten av konjugering. Alle disse studiene vil i stor grad bidra til å forstå hvordan mobilisering av multiresistente konjugative plasmider bidrar til spredning av multiresistens.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

LM-B, IMG, AT og IS ble støttet av NIH grant GM055246 tildelt LM-B. GC-C ble tildelt UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship to år på rad: AY 2017-18 og 2018-19. Vi takker studentene Sage Chavez og Pepper St. Clair fra Genentech-Foundation sponset Academic Inspiration Network (GAIN) mentorprogram for deres tekniske støtte i eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 22-313630 It can be replaced for another brand
2.0 mL Cryogenic vials Corning 430659 It can be replaced for another brand
14 mL conical tubes FALCON 149597 It can be replaced for another brand
14 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 8850 It can be replaced for another brand
1 kb DNA ladder New England Biolabs N0552G 
250 mL sterile flasks  PYREX 5320 It can be replaced for another permanent marker brand
Acetic acid Fisher Scientific A38SI-212 It can be replaced for another brand
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) Fisher Scientific BP160-500 It can be replaced for another brand
Carbenicillin GOLD BIOTECHNOLOGY C-103-50 It can be replaced for another brand
Disposable inoculating loops: 1 µL Fisherbrand 22-363-595 It can be replaced for another brand
DNA gel loading dye 6x  New England Biolabs B7024S It can be replaced for another brand
EDTA Fisher Scientific BP119-500 It can be replaced for another brand
Electronic digital scale Denver Instrument APX-2001 It can be replaced for another brand
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL Eppendorf 14-282-302 It can be replaced for another brand
Equipment for agarose gel electrophoresis Fisher Scientific FP300 It can be replaced for another brand
Ethanol-resistant markers Sharpie 37001; 37002; 37003 It can be replaced for another brand
Gel documentation systems (UVP GelSolo) Analytakjena SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 It can be replaced for another brand
Gloves X-GEN 44-100M Any nitrile gloves brand works
Ice bucket Thermo Fisher Scientific 432128 It can be replaced for another brand
MacConkey agar  BD DIFCO 212123
Master Mix  BioLabs M0496S  It can be replaced for another brand
Methanol Fisher Scientific A452-4 It can be replaced for another brand
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL Fisherbrand 05-408-138 It can be replaced for another brand
Mueller Hinton agar BD DIFCO DF0479-17-3
Mueller Hinton broth BD DIFCO 275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL 740588. 250
PCR tube racks AXYGEN   R96PCRFSP It can be replaced for another brand
PCR tubes (0.2 mL) AXYGEN  PCR-02-C It can be replaced for another brand
Rifampicin Fisher Scientific 50-164-7517
Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) RAININ 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand
Sodium chloride Fisher Scientific S671-3 It can be replaced for another brand
Spectrophotometer Thermo Scientific 335905P It can be replaced for another brand
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL  Eclipse 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 It can be replaced for another brand
Streptomycin Fisher Scientific BP910-50
SYBR Safe DNA gel stain  Thermo Fisher Scientific S33102
Taq DNA Polymerase BioLabs M0273S
Thermal cycler C1000 Touch  Bio-Rad 1851196 It can be replaced for another brand
Tris  Fisher Scientific BP153-500 It can be replaced for another brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lederberg, J., Tatum, E. Gene recombination in Escherichia coli. Nature. 158 (4016), 558 (1946).
  2. de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
  3. Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
  4. Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).
  5. Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).
  6. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
  7. Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650 (2022).
  8. San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
  9. Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
  10. Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
  11. Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).
  12. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  13. Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
  14. Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).
  15. Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).
  16. Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).
  17. Suchman, E. Polymerase chain reaction protocol. American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).
  18. Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
  19. Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
  20. Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627 (2022).
  21. Jung, B., Hoilat, G. J. MacConkey medium. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2022).
  22. NucleoSpin Plasmid DNA purification. , Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022).
  23. Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
  24. Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
  25. Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).
  26. Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
  27. Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
  28. Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
  29. Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).
  31. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
  32. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
  33. Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
  34. Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
  35. Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
  36. Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
  37. Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes' interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).

Tags

Genetikk utgave 193 Eksperimentell evolusjon horisontal genoverføring konjugative plasmider antibiotikaresistens Escherichia coli
Påvisning av horisontal genoverføring mediert av naturlige konjugative plasmider i <em>E. coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mota-Bravo, L., Camps, M.,… More

Mota-Bravo, L., Camps, M., Muñoz-Gutiérrez, I., Tatarenkov, A., Warner, C., Suarez, I., Cortés-Cortés, G. Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli. J. Vis. Exp. (193), e64523, doi:10.3791/64523 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter