利用自发荧光成像评估红藻生理状态

摘要

本实验方案详细描述了基于光谱分析的红藻藻胆蛋白变化的自发荧光成像与评估步骤。该方法无需标记且对样品无损伤，适用于仅能获取少量材料、细胞在实验室条件下生长缓慢或完全无法生长时，对细胞适应极端生境能力的评估。

摘要

红藻（Rhodophyta）含有藻胆蛋白，通常定植于弱光环境中，但某些种类（例如某些 Chroothece 物种）也能在全日照条件下生长。大多数红藻呈红色，但有些会呈现蓝色，这取决于蓝色和红色胆色素蛋白（藻蓝蛋白和藻红蛋白）的比例。不同的藻胆蛋白能够捕获不同波长的光，并将能量传递给叶绿素a，从而使光合作用在差异显著的光照条件下仍可进行。这些色素可响应光照环境的变化，其自发荧光特性有助于研究生物学过程。本研究以 Chroothece mobilis 为模式生物，利用共聚焦显微镜的光谱λ扫描模式，在细胞水平上研究了光合色素对不同单色光的适应性，以推断该物种的最佳生长条件。结果表明，即使所研究的菌株分离自洞穴环境，它仍能适应弱光和中等强度的光照。该方法特别适用于研究在实验室条件下无法生长或生长极为缓慢的光合生物，而这类生物通常生活在极端生境中。

引言

红藻，例如Chroothece属，能够在极端环境中生长，常常需要应对显著的环境变化¹。在该属藻类分布的半干旱地区，洪水和干旱频繁发生，一些物种已被报道存在于溪流、悬崖、洞穴甚至温泉中²。然而，大多数情况下，生物因素如种间竞争或摄食作用会使这些物种局限于不适合其生长的次优环境中。由于这些生物通常难以培养，在实验室条件下往往无法生长或生长极为缓慢，因此样本量有限成为主要制约因素。因此，遵循非破坏性方法或仅需最小程度样本操作的方法显得尤为重要^3,4。

通过监测光合系统的变化，可以了解生物在这些严酷环境中生存所需的生理能力。由于能量传递或捕获效率的精确变化，色素荧光发射谱能够揭示其代谢机制、光合效率以及对光照或培养条件的敏感性^5,6,7,8。

细胞化合物的自发荧光可作为细胞诊断的标志物，或作为细胞状态或代谢的天然指示剂，以响应内外信号并通过发射光的....

方案

本研究使用了藻类物种 Chroothece mobilis，该物种来源于西班牙东南部土壤微藻培养物保藏中心（Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29）。实验方案的总体流程见图1。

图 1：研究概述。 Chroothece mobilis 在不同单色光等极端生境条件下培养 2 周。通过共聚焦激光扫描显微镜检测藻胆体和光系统中蛋白质的自发荧光，评估这些条件对 Chroothece 生理特性的影响。请点击此处查看该图....

结果

叶绿素a通常吸收可见光中的蓝光和红光波长，而藻胆蛋白则利用绿光、黄光和橙光波长⁷。这些色素的自发荧光使得研究藻胆蛋白和叶绿素在实验和野外条件下的行为成为可能。

通过比较所获得的数据并在不同图表上进行绘制，可以区分平均荧光强度（MFI）的显著变化（图4）。对λ扫描谱图中获得的不同发射峰（620、648、660 和 680 nm）进行进一步的统计学分析，结果显示存在显著差异（统计学显著性：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。

当细胞暴露于绿色单色光（GL）时，PE-PCB 的平均荧光强度（MFI）显著降低，而在红光（RL）下与对照组相比无显著差异（图4A）。然而，GL 对 APC 和叶绿素 a（Chl a）产生了相反的影响（

讨论

一些单细胞或群体红藻，例如 Chroothece, 生长缓慢 体外 但含有多种自发荧光化合物，可通过共聚焦显微镜下的光谱分析进行检测，其中可识别色素发射峰的差异。光谱共聚焦荧光显微技术使我们能够开展 体内 评估光合生物适应或驯化的研究^{8,10,17,18,19,20}. 大多数其他技术，例如蛋白质分析，需要大量样品，具有破坏性，或成本高得多。

选择561 nm波长是因为它对藻胆蛋白更具选择性（基于先前的报道²³）；该结果也验证了之前一项利用三种不同激发波长（351、488 和 543.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ-Dish 35 mm，高底玻璃培养皿	Ibidi	81158	-
24孔黑色培养板	Ibidi	82406	平底透明，适用于高通量显微镜观察
藻类培养箱	Panasonic	MLR-352-PE
共聚焦激光扫描显微镜	Leica Microsystems	SP8 TCS	-
烧瓶	Fisher Scientific	15380591	可在本地便利店或在线商店购买。
绿色滤光片	PNTA，LEE filters	-	可在本地便利店或在线商店购买。
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	甘油浸没物镜
图像采集软件 LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS	-
光源	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
量子光辐射计	DeltaOhm	DO 9721	-
R 软件	R Core Team, 2020	4.0.2.	-
红色滤光片	PNTA，LEE filters	-	可在本地便利店或在线商店购买。
SWES 培养基	穆尔西亚大学	-	-
Type G 浸油液体	Leica Microsystems	11513910	甘油