Summary
本协议描述了基于光谱分析的红藻中藻胆蛋白变化的分步自发荧光成像和评估。这是一种无标记且无损的方法，用于评估细胞对极端栖息地的适应，当只有稀缺材料可用并且细胞在实验室条件下生长缓慢或根本不生长时。
Abstract
红藻（Rhodophyta）含有藻胆蛋白，并在光线昏暗的栖息地定居，但是一些（例如，一些 Chroothece 物种）也可以在充足的阳光下发育。大多数红藻是红色的，但有些可能呈现蓝色，这取决于蓝色和红色胆蛋白（藻蓝蛋白和藻红蛋白）的比例。不同的藻胆蛋白可以捕获不同波长的光并将其传输到叶绿素a，这使得在非常不同的光条件下进行光合作用成为可能。这些色素对光的栖息地变化做出反应，它们的自发荧光可以帮助研究生物过程。以 Chroothece mobilis 为模式生物，在共聚焦显微镜下使用光谱λ扫描模式，在细胞水平上研究了光合色素对不同单色光的适应性，以猜测物种的最佳生长条件。结果表明，即使将所研究的菌株从洞穴中分离出来，它也适应了昏暗和中等光强度。所提出的方法对于研究在实验室条件下生长不慢或生长非常缓慢的光合生物特别有用，这通常是生活在极端栖息地的人的情况。
Introduction
红藻，如Chroothece属，可以在极端的栖息地生长，在那里它们经常不得不应对明显的环境变化1。在可以找到该属的半干旱地区，洪水和干旱频繁发生，据报道，在小溪，悬崖，洞穴甚至温泉水中都报告了一些物种2。然而，大多数时候，生物变量，如竞争或放牧，将物种降级到非最佳生长条件。由于这些生物通常难以培养，并且在实验室条件下生长或生长非常缓慢，因此一个主要限制是可用的样本量。因此，遵循非破坏性方法或涉及最少样品操作的方法非常重要3，4。
在这些恶劣环境中生存所需的生理技能可以通过跟踪其光合作用系统的变化来监测。代谢机制、光合作用效率以及对光或培养条件的敏感性可以通过色素荧光发射曲线来揭示，因为它们的能量转移或捕获5，6，7，8的准确变化。
细胞化合物的自发荧光可用作细胞诊断的标志物，或作为细胞状态或代谢的自然指标，通过发射变化响应外部和内部信号9。它还可用于区分不同分类学的光合生物群10。根据光养微生物的系统发育位置，人们可以发现不同的 体内 荧光特征。因此，基于光养荧光的 体内 特性（包括荧光吸收和发射光谱）的分类学鉴定已被多次尝试11，12。由于浮游植物分类群中辅助色素的多样性，激发叶绿素a（Chl a）荧光的波长差异或发射光谱的差异可用于推断分类学13。这些标本的 体内 荧光激发和发射光谱不仅依赖于藻类门，还依赖于光系统适应14。能量转移到Chl a的效率，或Chl a与辅助色素的比例，以及细胞色素含量对生长条件敏感5。
红藻，特别是Chroothece，具有几种辅助荧光色素 - 藻胆蛋白和类胡萝卜素;前者集中在附着在叶绿体类囊体上的藻胆体中。藻胆蛋白（藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白）可以捕获不同波长的光并将其传输到 Chl a，这使得在非常不同的光和培养条件下进行光合作用成为可能15.例如，Chroothece物种可以在洞穴内生长，或者几乎出现在略带盐分的钙质溪流中2。
单色光影响光合生物的生长和色素组成， 并已被研究用于预防或控制光合生物在洞穴中的生长.Mulec等人表明，富含红色的照明可促进蓝藻，藻类和植物的生长16。以前的研究还报道了绿光影响蓝藻的色素组成17，而其他人则揭示了绿光阻止大多数光合生物的生长，一些蓝藻表现出类囊体减少和平均荧光强度较弱18。
为了了解 Chroothece 作为模式生物克服恶劣条件的能力，培养的细胞已经暴露在不断增加的光强度和单色光（绿色或红色）15下，以了解它如何应对洞穴（红光占主导地位）的昏暗条件。本文提出的协议使用其自身的自发荧光在细胞水平上重现了上述变量对 Chroothece藻胆蛋白的影响。
如今，荧光通常用作研究维管植物，微藻，大型藻和蓝藻的生理反应的工具13，14，16。光谱共聚焦荧光显微镜是体内研究的绝佳工具，可在单细胞水平10，17，18，19，20上评估光合标本的生理学，避免与实验室低生长率相关的问题以及难以获得足够的生物量用于相关的提取和生化方法8.一旦细胞在不同的培养条件下处理2周，就可以在体内测量λ扫描谱。尽管有几篇出版物使用了3，4，10，17共聚焦成像激发的不同波长，但大多数藻胆蛋白和Chl a可以使用561 nm波长激发线进行检测，并且检测到的发射范围为570至760nm波长。这些标准基于先前通过共聚焦成像对商业纯颜料（表1）进行的分析10以及在不同藻类物种中获得的结果20，21，22。
| 颜料 | λ最大流径 （纳米） | λ EXC （纳米） | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43.4 ± 1.8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80.7 ± 1.5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11.1 ± 0.04 | 42.2 ± 0.3 | 100.0 ± 0 | 90.0 ± 0.3 | 99.2 ± 0.08 | - |
| 652.1-668.6 | - | - | 1.5 ± 0.01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11.3 ± 0.2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0.6 ± 0.004 | 0.7 ± 0.008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33.6 ± 0.9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91.4 ± 2.3 |
表 1：用于运行 lambda 扫描分析的纯颜料信息。该表显示了通过共聚焦成像分光光度法对所有激发波长的不同荧光染料/颜料的发射峰和肩部/荧光带最大值，以及颜料/荧光染料的发光百分比。值由公式计算：= MFI*100/255。每个值都是 SE ±平均值（平均值±平均值的标准误差）。纯颜料用于校准共聚焦扫描激光显微镜，如下所示1，2，10。叶绿素a取自油菜，R-藻红蛋白（R-PE）取自卟啉，C-藻蓝蛋白（C-PE）取自螺旋藻属。 所有物种都溶解在过滤的蒸馏水中。从乳腺藻中获得同种异藻蓝蛋白-XL（APC-XL），将其溶解在硫酸铵（60%）和磷酸钾（pH = 7）中，浓度达到38mM。使用8孔盖玻底室使用400 μL每种颜料溶液（浓度为1 mg/mL）进行扫描。
对单个激发波长的研究是一个非常有用的第一近似值。然而，在这种情况下，有必要阐明荧光信号中不同复合物的相对贡献，建议在多个波长下进行荧光比或光谱分析等方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
藻类物种 Chroothece mobilis 用于本研究。该物种是从西班牙微藻Edaphic SE，MAESE 20.29培养物收集中获得的。该协议的概述如图 1 所示。
图1：研究概述。 在极端栖息地条件下（例如不同的单色光）孵育 Chroothece mobilis2 周。通过使用共聚焦激光扫描显微镜对藻胆体和光系统中含有的蛋白质进行自发荧光来评估对 Chroothece生理学的影响。 请点击此处查看此图的大图。
1. 样品制备
- 通过将Chroothece mobilis的接种物转移到SWES液体培养基中，从收集的琼脂培养物中制备 Chroothece mobilis 的接种物（表2）。
注：SWES “Seewasser + Erddekokt + Salze” = 海水介质23. - 在低白光强度（LL：80μM / m 2 / s）条件下，在20°C下以16：8的光/暗光周期将所有培养物维持2周，并且不摇动，直到获得所需的细胞密度（参见步骤1.3）。
注意：生长光条件为80μM / m2 / s光强度（主动光合辐射，PAR）。这些条件用作弱光条件（控制）。SWES培养基的组成如 表2所示。 - 在指数培养阶段以 5 x 103 个细胞/mL 的细胞密度在 24 孔板中进行不同实验的接种，每孔使用 1 mL。
注意：使用Neubauer室24进行细胞计数，并在必要时用SWES稀释培养物。
| SWES培养基组成 | |
| 元件 | 浓度 |
| 旋钮3 | 1.98 毫米 |
| K2HPO4 | 115微米 |
| 镁硫4 | 81微米 |
| 氧化锌4， 7H2O | 17 纳米 |
| 二氧化锰4， 7H2O | 45牛米 |
| H 3BO3， 4H2O | 3.1 毫米 |
| 钴（3号）2 | 17 毫米 |
| Na2MoO4， 6H2O | 21 纳米 |
| 铜4， 2H2O | 0.1毫米 |
| 二氧化铁4， 5H2O | 13 微米 |
| EDTA， 7H2O | 11微米 |
| 维生素B12 | 5微克 |
| 土壤提取物 | 30毫升 |
| 过滤河水 | 455毫升 |
表2：SWES培养基组成。
2.再现极端藻类栖息地条件：绿色和红色单色光效果
- 从以上述细胞密度（步骤1.2）制备的原液培养物中加入1 mL细胞培养物，以接种24孔板的每个孔。
- 将细胞培养物盖住2周，以重现单色光效果。
- 使用绿色滤光片，使绿光从470到570nm通过，峰值在506nm波长处（根据制造商的规格;见 材料表），并将其暴露在培养物25中。
- 使用允许红光在 590 和 720 nm 之间并在 678 nm 处达到峰值的红色滤光片（根据制造商的规格;见 材料表）将其暴露在培养物25 中。
注意：低白光强度（LL：80μM/m2/s;见材料表）条件用作光强度控制，以比较获得的效果。采用的光强度单位是微摩尔每秒和平方米（μmol m-2 s-1）或光合光子通量密度（PPFD）。
3. 自发荧光成像
注：成像软件的设置（参见 材料表）如图 2所示。
- 打开倒置共聚焦激光扫描显微镜（CLSM;见 材料表）的所有组件，包括激光器。
- 将来自SWES生长培养基中24孔板的每个实验孔的细胞安装到35mm玻璃底培养皿（参见 材料表）中进行成像。
- 选择63x/1.30 NA甘油浸没物镜，将甘油放在镜头上（参见 材料表）。
- 将孔板放在显微镜载物台上，并确保标本在图像采集过程中不会移动。
- 通过选择荧光强度最高的平面，将标本置于光路的中心，并聚焦在细胞的中心。
- 打开图像采集软件，在采集模式26的下拉列表中选择xyλ。
- 选择激光器的激发线为 561 nm DPSS、8 位动态范围和 1024 x 1024 像素。
注意：确保共聚焦显微镜具有561 nm DPSS激光器或白光激光器（WLL）。 - 在 10 nm 带宽内收集荧光发射光谱和 570-760 nm 范围内 4 nm 的λ步长。
- 将针孔设置为 1 Airy 单位并运行 lambda 扫描采集。
- 在不同的视野中尽可能多地重复此过程，以收集可接受的数据量进行统计分析（通常标准偏差低于10%22）。
- 在不同的条件下（在红灯和绿灯下）重复最后一步并保存数据。
注意：对不同的样品和条件使用相同的采集设置来比较和执行统计分析。
图 2：软件设置。 用于设置 lambda 扫描参数的映像软件用户界面。（A）从左到右，从下拉列表中选择对应于协议中步骤3.6的采集模式xyλ，并选择对应于协议中步骤3.3的右浸没透镜类型。确保在步骤 3.9 中从光路中删除任何滤镜。（B） 用于设置 lambda 扫描参数的面板对应于协议中的步骤 3.8。（C） 在步骤 3.10 中运行 lambda 扫描。 请点击此处查看此图的大图。
4. 评估 克鲁特赫斯生理机能的参数
- 获取λ扫描后，单击软件顶部的 量化 窗口（ 如图3所示）以评估收集的荧光发射光谱。转到“ 打开项目 ”窗口，然后选择一个 xyλ 文件（图 3）。
- 在成像软件中选择 堆栈轮廓分析 。
- 在细胞中心定义4μm2 的感兴趣区域（ROI）以分析平均荧光强度（MFI）。以 CSV 格式导出数据。
注意：请务必避免出现黑色像素（以确保所选像素包含正值），并始终保持相同大小的ROI。 - 在不同条件下对不同的单元格重复此过程，以产生足够的数据来执行统计分析。
- 打开CSV文件，从所有测量ROI的藻胆蛋白和叶绿素中选择不同的荧光发射峰。
- 在csv文件中分别选择藻红蛋白-藻蓝蛋白（PE-PCB;620 nm）、C-藻蓝蛋白（CPC;648 nm）、别藻蓝蛋白（APC;660 nm）和叶绿素a（Chl a;680 nm）的荧光数据。
- 创建一个新表，其中包含从每个藻胆蛋白和叶绿素峰获得的所有最大荧光值，并将数据绘制在图表上。
- 执行统计分析。
- 分析获得的数据是否符合正态性和同方差性27。
- 如果第一个条件为真，则继续进行 t 检验分析27，28 。如果没有，请运行曼-惠特尼 U 测试29。
- 考虑 p 值 <0.05 处的显著差异。
图 3：评估 Chroothece 的自发荧光。 要进行自发荧光分析，请确保在打开的项目窗口中选择量化窗口和一个xyλ文件（步骤4.1）;选择堆栈配置文件可视化（步骤 4.2）;在单元格中心选择 4 μm2 ROI，然后单击报告按钮以 CSV 格式导出 Lambda 扫描数据（步骤 4.3）。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
叶绿素a通常吸收蓝色和红色波长的可见光，而藻胆蛋白使用绿色，黄色和橙色波长7。这些色素的自发荧光使得在实验和现场条件下研究藻胆蛋白和叶绿素行为的第一种方法成为可能。
通过比较获得的数据并绘制在不同的图表上，可以区分平均荧光强度（MFI）的显着变化（图4）。对λ扫描轮廓（620、648、660和680 nm）中获得的不同发射峰进行的一项不可告人的统计研究表明，差异显著（统计学意义：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。
当细胞暴露于绿色单色光（GL）时，PE-PCB的MFI显着降低，但在红光（RL）下与对照相比没有差异（图4A）。然而，GL对APC和Chl a具有相反的影响（图4B，C），其中由于天线复合体的适应性，由于天线复合体的数量增加或连接性改善等，MFI显着增加。RL在APC和Chl a荧光17，24，25，26中均没有显着增加。
图4：单色光处理下对Chroothece藻胆蛋白和叶绿素a荧光的影响。 （A-C）在λ扫描中获得的561 nm激发波长处获得的荧光发射强度，并分析了与不同藻胆蛋白（A：PE-PCB;B：APC）和叶绿素（C：Chl a）。框包含绘制的荧光发射强度的中值、最小值和最大值。绿色框：绿色单色光条件（GL）;红色框：红色单色光（RL）;和蓝色框：弱光条件（LL，控制）。统计学意义：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
一些单细胞或殖民红藻，如Chroothece，在体外生长缓慢，但含有多种自发荧光化合物，可以通过共聚焦显微镜下的光谱分析进行分析，其中可以检测到色素发射峰的差异。光谱共聚焦荧光显微镜使我们能够进行体内研究，以评估光合生物的适应或适应8，10，17，18，19，20。大多数其他技术，如蛋白质分析，需要大量的样品，具有破坏性，或者更昂贵。
这里选择了 561 nm 波长，因为它对藻胆蛋白更具选择性（基于之前的报告23）;它证实了先前使用三种不同激发波长（351、488 和 543 nm）对蓝藻影响的研究结果。为了获得可靠的数据，在相同的显微镜条件下获取所有数据至关重要。
该协议是研究 Chroothece 细胞在不同光照条件下行为的简单第一种方法，同时还提供了在不同单色光条件下处理的藻胆蛋白或叶绿素组成的显着差异的可能性，这要归功于后期执行的分析。这有助于评估红藻细胞如何响应栖息地条件的变化，并了解它们对极端栖息地的适应能力。
藻类细胞富含自发荧光色素（叶绿素、藻胆蛋白、类胡萝卜素），荧光范围很广。这一事实可能会使CLSM图像分析复杂化;然而，荧光寿命成像（FLIM），光谱解混和白色激光激发可能有助于分离信号30，31。微藻的生理状态与光合色素性能之间通常具有良好的相关性3。
然而，为了评估不同荧光复合物在荧光信号中的相对贡献的变化，或在几个激发波长下进行荧光比和/或光谱分析，必须使用破坏性技术。
当稀缺材料和/或细胞在实验室条件下生长或生长非常缓慢时，采用这种方法尤其重要。光谱技术可能会提供诸如白光激光器（以获得激发光谱）和高灵敏度混合检测器之类的进步，当与超分辨率技术结合使用时，可以获得光谱信息和具有纳米分辨率的蛋白质的位置。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项研究是作为TIN2015-68454-R和20961/PI/18项目的一部分进行的，该项目由西班牙经济和竞争力部以及穆尔西亚地区的塞内卡基金会资助。穆尔西亚大学科学与研究区统计支持科的艾琳·埃尔南德斯·马丁内斯和弗朗西斯科·哈维尔·伊瓦涅斯·洛佩斯（Irene Hernández Martínez）是使用施维雅医学艺术的图片绘制的。施维雅医疗艺术获得知识共享署名 3.0 未移植许可 （https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | - |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | - |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | - |
| red filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | - | - |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
References
- Vis, M. L., Necchi, O. Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , Springer Nature. (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , Dresden. (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August.
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2011).
