Summary
Le présent protocole décrit l’imagerie par autofluorescence étape par étape et l’évaluation des changements phycobiliprotéiques dans les algues rouges sur la base d’une analyse spectrale. Il s’agit d’une méthode non marquée et non destructive pour évaluer l’adaptation cellulaire à des habitats extrêmes, lorsque seul du matériel rare est disponible et que les cellules se développent lentement, voire pas du tout, dans des conditions de laboratoire.
Abstract
Les algues rouges (Rhodophyta) contiennent des phycobiliprotéines et colonisent les habitats avec une faible lumière, mais certaines (par exemple, certaines espèces de Chroothece ) peuvent également se développer en plein soleil. La plupart des rhodophytes sont rouges, mais certains peuvent apparaître bleutés, selon la proportion de biliprotéines bleues et rouges (phycocyanine et phycoérythrine). Différentes phycobiliprotéines peuvent capturer la lumière à différentes longueurs d’onde et la transmettre à la chlorophylle a, ce qui rend possible la photosynthèse dans des conditions lumineuses très différentes. Ces pigments réagissent aux changements de l’habitat dans la lumière, et leur autofluorescence peut aider à étudier les processus biologiques. En utilisant Chroothece mobilis comme organisme modèle et le mode spectral lambda scan dans un microscope confocal, l’adaptation des pigments photosynthétiques à différentes lumières monochromatiques a été étudiée au niveau cellulaire pour deviner les conditions de croissance optimales de l’espèce. Les résultats ont montré que, même lorsque la souche étudiée était isolée d’une grotte, elle s’adaptait à des intensités lumineuses faibles et moyennes. La méthode présentée est particulièrement utile pour étudier les organismes photosynthétiques qui ne se développent pas ou se développent très lentement dans des conditions de laboratoire, ce qui est généralement le cas pour ceux qui vivent dans des habitats extrêmes.
Introduction
Les algues rouges, comme le genre Chroothece, peuvent pousser dans des habitats extrêmes, où elles doivent souvent faire face à des changements environnementaux marqués1. Les inondations et les sécheresses sont fréquentes dans les régions semi-arides où ce genre peut être trouvé, et certaines espèces ont été signalées dans les ruisseaux, les falaises, les grottes, ou même les eaux thermales2. Cependant, la plupart du temps, des variables biologiques, telles que la compétition ou le pâturage, relèguent les espèces à des conditions non optimales pour leur croissance. Comme ces organismes sont souvent difficiles à cultiver et qu’ils ne se développent pas ou se développent très lentement dans des conditions de laboratoire, une limitation majeure est la taille de l’échantillon disponible. Par conséquent, il est très important de suivre des méthodes non destructives ou des méthodes qui impliquent une manipulation minimale des échantillons 3,4.
Les compétences physiologiques nécessaires pour survivre dans ces environnements difficiles peuvent être surveillées en suivant les changements dans leurs systèmes photosynthétiques. Les mécanismes métaboliques, l’efficacité photosynthétique et la sensibilité à la lumière ou aux conditions de culture peuvent être révélés par les profils d’émission de fluorescence pigmentaire, en raison de changements précis dans leur transfert d’énergie ou piégeage 5,6,7,8.
L’autofluorescence des composés cellulaires peut être utilisée comme marqueur pour le cytodiagnostic ou comme indicateur naturel de l’état cellulaire ou du métabolisme en réponse à des signaux externes et internes par des changements dans l’émission9. Il peut également être utilisé pour discriminer taxonomiquement différents groupes d’organismes photosynthétiques10. Selon la position phylogénétique des microorganismes phototrophes, on peut trouver différentes caractéristiques de fluorescence in vivo. Par conséquent, une identification taxonomique basée sur les caractéristiques in vivo de la fluorescence phototrophique (y compris les spectres d’absorption et d’émission de fluorescence) a été tentée à plusieurs reprises11,12. En raison de la diversité des pigments accessoires parmi les taxons de phytoplancton, les différences dans les longueurs d’onde auxquelles la fluorescence de la chlorophylle a (Chl a) est stimulée, ou les différences dans les spectres d’émission, peuvent être utilisées pour déduire la taxonomie13. L’excitation de fluorescence in vivo et les spectres d’émission de ces spécimens reposent non seulement sur les phylums des algues, mais aussi sur l’adaptation du photosystème14. L’efficacité du transfert d’énergie à Chl a, ou le rapport de Chl a aux pigments accessoires, et la teneur en pigments cellulaires sont sensibles aux conditions de croissance5.
Les algues rouges, en particulier Chroothece, ont plusieurs pigments fluorescents accessoires - phycobiliprotéines et caroténoïdes; Les premiers se concentrent dans des phycobilisomes attachés aux thylakoïdes des chloroplastes. Les phycobiliprotéines (phycocyanine, phycoérythrine et allophycocyanine) peuvent capter la lumière à différentes longueurs d’onde et la transmettre à Chl a, ce qui rend possible la photosynthèse dans des conditions de lumière et de culture très différentes15. Par exemple, les espèces de Chroothece peuvent pousser à l’intérieur des grottes ou presque émerger dans des cours d’eau calcaires légèrement salins2.
Les lumières monochromatiques affectent la croissance et la composition pigmentaire des organismes photosynthétiques et ont été étudiées pour prévenir ou contrôler la croissance des organismes photosynthétiques dans les grottes. Mulec et al. ont montré que l’éclairage enrichi en rouge favorise la croissance des cyanobactéries, des algues et des plantes16. Des études antérieures ont également rapporté que la lumière verte affecte la composition pigmentaire des cyanobactéries17, tandis que d’autres ont révélé que la lumière verte empêche la croissance de la plupart des organismes photosynthétiques et que certaines cyanobactéries présentent une réduction des thylakoïdes et une intensité de fluorescence moyenneplus faible 18.
Pour comprendre la capacité de Chroothece en tant qu’organisme modèle à surmonter des conditions difficiles, des cellules en culture ont été exposées à des intensités lumineuses croissantes et à une lumière monochromatique (verte ou rouge)15, pour voir comment elle fait face aux conditions sombres des grottes (où la lumière rouge prédomine). Le protocole présenté ici reproduit l’effet des variables susmentionnées sur les phycobiliprotéines de Chroothece au niveau cellulaire en utilisant sa propre autofluorescence.
De nos jours, la fluorescence est couramment utilisée comme outil pour étudier les réponses physiologiques des plantes vasculaires, des microalgues, des macroalgues et des cyanobactéries13,14,16. La microscopie confocale spectrale à fluorescence est un excellent outil pour les études in vivo visant à évaluer la physiologie des échantillons photosynthétiques au niveau de la cellule unique 10,17,18,19,20, en évitant les problèmes liés au faible taux de croissance en laboratoire et les difficultés à obtenir suffisamment de biomasse pour les méthodes d’extraction et biochimiques associées8 . Une fois que les cellules sont traitées dans différentes conditions de culture pendant 2 semaines, le profil de scintigraphie lambda peut être mesuré in vivo. Bien qu’il existe plusieurs publications dans lesquelles différentes longueurs d’onde d’excitation par imagerie confocale ont été utilisées 3,4,10,17, la plupart des phycobiliprotéines et Chl a peuvent être détectées à l’aide d’une raie d’excitation de longueur d’onde de 561 nm, et l’émission détectée varie de 570 à 760 nm de longueur d’onde. Ces critères ont été basés sur une analyse préalablement réalisée10 avec des pigments purs commerciaux (Tableau 1) par imagerie confocale et les résultats obtenus chez différentes espèces d’algues20,21,22.
| Pigments | λFLMAX (nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11,2 ± 0,2 | 1,8 ± 0,05 | 2,0 ± 0,08 | 12,2 ± 0,7 | 6,0 ± 0,3 | 4,2 ± 0,16 | 80,7 ± 1,5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5,9 ± 0,6 | 5,9 ± 0,16 | 11,1 ± 0,04 | 42,2 ± 0,3 | 100,0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99,2 ± 0,08 | - |
| 652.1-668.6 | - | - | 1,5 ± 0,01 | 3,7 ± 0,04 | 26,7 ± 0,5 | 8,7 ± 0,16 | 11,1 ± 0,16 | 11,3 ± 0,2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2,3 ± 0,04 | 1,0 ± 0,01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2,0 ± 0,08 | 2,0 ± 0,04 | 3,3 ± 0,16 | 33,6 ± 0,9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15,1 ± 1,5 | 9,6 ± 0,98 | 1,0 ± 0,04 | 1,2 ± 0,08 | 5,9 ± 0,7 | 4,1 ± 0,5 | 23,2 ± 3,5 | 91,4 ± 2,3 |
Tableau 1 : informations sur les pigments purs utilisées pour exécuter l’analyse lambda. Ce tableau montre les pics d’émission et les maxima épaules/bande de fluorescence de différents fluorochromes/pigments par spectrophotométrie d’imagerie confocale pour toutes les longueurs d’onde d’excitation, et le pourcentage d’émission lumineuse par les pigments/fluorochromes. Les valeurs ont été calculées par la formule: = MFI*100/255. Chaque valeur est la moyenne ± SE (moyenne ± erreur-type par rapport à la moyenne). Des pigments purs ont été utilisés pour étalonner le microscope laser à balayage confocale comme suit 1,2,10. La chlorophylle a a été obtenue à partir de Spinacia oleracea, la R-phycoérythrine (R-PE) de Porphyra tenera et la C-phycocyanine (C-PE) à partir de Spirulina sp. Toutes les espèces ont été dissoutes dans de l’eau distillée filtrée. L’allophycocyanine-XL (APC-XL) a été obtenue à partir de Mastigocladus laminosus, qui a été dissous dans du sulfate d’ammonium (60%) et du phosphate de potassium (pH = 7) pour atteindre une concentration de 38 mM. Les scans ont été effectués avec 400 μL de chaque solution pigmentaire (concentration de 1 mg/mL) en utilisant une chambre de fond en verre recouverte de 8 puits.
L’étude d’une seule longueur d’onde d’excitation est une première approximation très utile. Dans ce cas, cependant, il est nécessaire d’élucider la contribution relative des différents complexes dans le signal de fluorescence, ce qui est recommandé pour effectuer un rapport de fluorescence ou une analyse du spectre à plusieurs longueurs d’onde, entre autres méthodes.
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Protocol
L’espèce d’algue Chroothece mobilis a été utilisée pour la présente étude. L’espèce a été obtenue à partir de la collection de culture Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Une vue d’ensemble du protocole est présentée à la figure 1.
Figure 1 : Aperçu de l’étude. Chroothece mobilis est incubé dans des conditions d’habitat extrêmes, telles que différentes lumières monochromatiques, pendant 2 semaines. L’effet sur la physiologie de Chroothece est évalué par autofluorescence des protéines contenues dans les phycobilisomes et les photosystèmes à l’aide d’un microscope confocale à balayage laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. Préparation de l’échantillon
- Préparer l’inoculum de Chroothece mobilis à partir de la culture de gélose de la collection en le transférant dans le milieu liquide SWES (tableau 2).
NOTE: SWES « Seewasser + Erddekokt + Salze » = milieu d’eau de mer23. - Maintenir toutes les cultures pendant 2 semaines avec une photopériode lumière/obscurité 16:8 à 20 °C dans des conditions de faible intensité de lumière blanche (LL : 80 μM/m2/s) et sans agitation, jusqu’à l’obtention de la densité cellulaire souhaitée (voir étape 1.3).
NOTE: Les conditions de lumière de croissance sont de 80 μM / m2 / s intensité lumineuse (rayonnement photosynthétique actif, PAR). Ces conditions sont utilisées comme conditions de faible luminosité (contrôle). La composition du milieu SWES est présentée dans le tableau 2. - Effectuer des inoculations pour les différentes expériences en phase de culture exponentielle avec une densité cellulaire de 5 x 103 cellules/mL dans une plaque de 24 puits, en utilisant 1 mL par puits.
NOTE: Effectuer le comptage des cellules avec une chambre de Neubauer24 et diluer la culture avec SWES chaque fois que nécessaire.
| Composition du milieu SWES | |
| Composant | Concentration |
| KNO3 | 1,98 mM |
| K2HPO4 | 115 μM |
| MgSO4 | 81 μM |
| ZnSO4, 7H2O | 17 nM |
| MnSO4, 7H2O | 45 nm |
| H3 BO3, 4H2O | 3,1 mM |
| Co(NO3)2 | 17 mM |
| Na 2 MoO4, 6H2O | 21 nM |
| CuSO4, 2H2O | 0,1 nM |
| FeSO4, 5H2O | 13 μM |
| EDTA, 7H2O | 11 μM |
| Vit B12 | 5 μg |
| Extrait de sol | 30 mL |
| Eau de rivière filtrée | 455 mL |
Tableau 2 : Composition moyenne du SWES.
2. Reproduire des conditions extrêmes d’habitat des algues : effet de lumière monochromatique verte et rouge
- Ajouter 1 mL de la culture cellulaire provenant de la culture mère préparée à la densité cellulaire susmentionnée (étape 1.2) pour inoculer chaque puits d’une plaque de 24 puits.
- Gardez la culture cellulaire couverte pendant 2 semaines pour reproduire l’effet de lumière monochromatique.
- Utilisez le filtre vert qui laisse passer la lumière verte de 470 à 570 nm avec un pic à la longueur d’onde de 506 nm (selon les spécifications du fabricant; voir Tableau des matériaux) et exposez-le à la culture25.
- Utilisez le filtre rouge qui laisse passer la lumière rouge entre 590 et 720 nm et culmine à 678 nm (selon les spécifications du fabricant; voir Tableau des matériaux) pour l’exposer à la culture25.
NOTE: La condition de faible intensité de lumière blanche (LL: 80 μM/ m 2 / s; voir le tableau des matériaux) est utilisée comme contrôle de l’intensité lumineuse pour comparer les effets obtenus. Les unités d’intensité lumineuse utilisées sont le micromole par seconde et le mètre carré (μmol m-2 s-1) ou la densité de flux de photons photosynthétiques (PPFD).
3. Imagerie par autofluorescence
REMARQUE : La configuration du logiciel d’imagerie (voir le tableau des matériaux) est illustrée à la figure 2.
- Allumez tous les composants du microscope confocale inversé à balayage laser (CLSM; voir Tableau des matériaux), y compris le laser.
- Monter les cellules de chaque puits expérimental de la plaque de 24 puits dans le milieu de croissance SWES sur une antenne à fond en verre de 35 mm (voir le tableau des matériaux) pour l’imagerie.
- Choisissez l’objectif d’immersion glycérol 63x/1,30 NA et placez le glycérol sur la lentille (voir le tableau des matériaux).
- Placez la plaque de puits sur l’étage du microscope et assurez-vous que l’échantillon ne bouge pas pendant l’acquisition de l’image.
- Centrez l’échantillon dans le trajet lumineux et concentrez-vous sur le centre de la cellule en sélectionnant le plan avec l’intensité de fluorescence la plus élevée.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et choisissez xyλ dans la liste déroulante du moded’acquisition 26.
- Sélectionnez la ligne d’excitation du laser à 561 nm DPSS, 8 bits de plage dynamique et 1024 x 1024 pixels.
REMARQUE: Assurez-vous que le microscope confocal dispose d’un laser DPSS de 561 nm ou d’un laser à lumière blanche (WLL). - Collectez les spectres d’émission de fluorescence dans la bande passante de 10 nm et la taille de pas lambda de 4 nm dans la plage de 570 à 760 nm.
- Définissez le trou d’épingle sur 1 unité Airy et exécutez l’acquisition par balayage lambda.
- Répétez ce processus autant de fois que possible dans différents champs de vision pour recueillir une quantité acceptable de données pour l’analyse statistique (généralement un écart-type inférieur à 10 %22).
- Répétez la dernière étape dans les différentes conditions (sous les voyants rouge et vert) et enregistrez les données.
REMARQUE : Utilisez les mêmes paramètres d’acquisition pour les différents échantillons et conditions afin de comparer et d’effectuer l’analyse statistique.
Figure 2 : Configuration du logiciel. Interface utilisateur du logiciel d’imagerie pour configurer les paramètres de balayage lambda. (A) De gauche à droite, sélectionner le mode d’acquisition xyλ dans la liste déroulante, qui correspond à l’étape 3.6 du protocole, et sélectionner le type de lentille d’immersion droite, correspondant à l’étape 3.3 du protocole. Assurez-vous de retirer tout filtre du trajet lumineux à l’étape 3.9. (B) Le panneau de configuration des paramètres de balayage lambda correspond à l’étape 3.8 du protocole. (C) Exécutez l’analyse lambda à l’étape 3.10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Paramètres pour évaluer la physiologie de Chroothece
- Une fois le lambda scan acquis, cliquez sur la fenêtre de quantification en haut du logiciel (comme illustré à la figure 3) pour évaluer les spectres d’émission de fluorescence collectés. Accédez à la fenêtre Ouvrir le projet et sélectionnez un fichier xyλ (Figure 3).
- Sélectionnez Analyse du profil de la pile dans le logiciel d’imagerie.
- Définir une région d’intérêt (ROI) de 4μm2 au centre d’une cellule pour analyser l’intensité moyenne de fluorescence (IMF). Exportez les données au format CSV.
REMARQUE: Il est important d’éviter la présence de pixels noirs (pour s’assurer que les pixels sélectionnés contiennent des valeurs positives) et de toujours maintenir un retour sur investissement de même taille. - Répétez ce processus avec différentes cellules dans différentes conditions pour produire suffisamment de données pour effectuer une analyse statistique.
- Ouvrez les fichiers CSV pour sélectionner les différents pics d’émission de fluorescence des phycobiliprotéines et des chlorophylles de tous les ROI mesurés.
- Sélectionnez les données de fluorescence de la phycoérythrine-phycocyanobiline (PE-PCB; 620 nm), de la C-phycocyanine (CPC; 648 nm), de l’allophycocyanine (APC; 660 nm) et de la chlorophylle a (Chl a; 680 nm), respectivement, dans le fichier csv.
- Créez un nouveau tableau avec toutes les valeurs de fluorescence maximales obtenues à partir de chaque pic de phycobiliprotéine et de chlorophylle et tracez les données sur un graphique.
- Effectuer des analyses statistiques.
- Analyser si les données obtenues répondent à la normalité et à l’homoscédasticité27.
- Passez à l’analyse du test t27,28 si la première condition est vraie. Si ce n’est pas le cas, exécutez un test Mann-Whitney U29.
- Considérez les différences significatives aux valeurs p <0,05.
Figure 3 : Évaluation de l’autofluorescence de Chroothece. Pour effectuer l’analyse d’autofluorescence, assurez-vous de sélectionner la fenêtre de quantification et un fichier xyλ dans la fenêtre des projets ouverts (étape 4.1); Sélectionnez Visualisation du profil de la pile (étape 4.2) ; sélectionnez un ROI de 4 μm2 au centre d’une cellule et cliquez sur le bouton Rapport pour exporter les données de numérisation lambda au format CSV (étape 4.3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
La chlorophylle a absorbe généralement les longueurs d’onde bleues et rouges de la lumière visible, tandis que les phycobiliprotéines utilisent les longueurs d’onde verte, jaune et orange7. L’autofluorescence de ces pigments rend possible la première approche pour étudier les phycobiliprotéines et le comportement de la chlorophylle dans des conditions expérimentales et sur le terrain.
En comparant les données obtenues et en traçant sur différents graphiques, les changements significatifs de l’intensité moyenne de fluorescence (ICM) peuvent être distingués (Figure 4). Une étude statistique ultérieure des différents pics d’émission obtenus dans les profils lambda scan (620, 648, 660 et 680 nm) a montré des différences significatives (signification statistique: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
L’IMF du PE-PCB diminuait significativement lorsque les cellules étaient exposées à la lumière monochromatique verte (GL), mais aucune différence par rapport au témoin n’a été observée en lumière rouge (RL) (Figure 4A). Cependant, le GL a eu l’effet inverse sur APC et Chl a (Figure 4B,C), dans lesquels l’IMF a considérablement augmenté en raison de l’adaptation des complexes d’antennes, en raison soit d’une quantité accrue, soit d’une connectivité améliorée des complexes d’antennes, entre autres. Le RL a produit une augmentation non significative de l’APC et du Chl une fluorescencede 17,24,25,26.
Figure 4 : Effets sur la fluorescence des phycobiliprotéines de Chroothèce et de la chlorophylle a sous traitement à la lumière monochromatique. (A-C) L’intensité d’émission de fluorescence obtenue à la longueur d’onde d’excitation de 561 nm dans le lambda scan et après avoir analysé les données relatives à différentes phycobiliprotéines (A: PE-PCB; B: APC) et chlorophylle (C: Chl a). Les boîtes contiennent les valeurs médianes, minimales et maximales de l’intensité d’émission de fluorescence tracées. Boîtes vertes : conditions de lumière monochromatique verte (GL); boîtes rouges: lumière monochromatique rouge (RL); et boîtes bleues : conditions de faible luminosité (LL, contrôle). Signification statistique: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Certaines algues rouges unicellulaires ou coloniales, telles que Chroothece, poussent lentement in vitro, mais contiennent plusieurs composés autofluorescents qui peuvent être analysés par analyse spectrale au microscope confocal, où les différences dans les pics d’émission pigmentaire peuvent être détectées. La microscopie confocale spectrale à fluorescence nous a permis de mener des études in vivo pour évaluer l’adaptation ou l’acclimatation des organismes photosynthétiques 8,10,17,18,19,20. La plupart des autres techniques, telles que l’analyse des protéines, nécessitent de grandes quantités d’échantillons, sont destructrices ou sont beaucoup plus coûteuses.
La longueur d’onde de 561 nm a été choisie ici car elle est plus sélective pour les phycobiliprotéines (sur la base d’un rapport précédent23); il a confirmé les résultats d’une étude précédente sur les effets du GL sur les cyanobactéries en utilisant trois longueurs d’onde d’excitation différentes (351, 488 et 543 nm). Pour obtenir des données fiables, il est essentiel d’acquérir toutes les données dans les mêmes conditions de microscope.
Ce protocole est une première approche facile pour étudier le comportement des cellules de Chroothèce dans différentes conditions de lumière, tout en offrant la possibilité d’obtenir des différences significatives dans la composition des phycobiliprotéines ou des chlorophylles qui ont été traitées dans des conditions lumineuses monochromatiques distinctes, grâce à l’analyse post-effectuée. Cela permet d’évaluer comment les algues rouges réagissent aux changements dans les conditions de l’habitat et d’apprendre leur capacité d’adaptation aux habitats extrêmes.
Les cellules d’algues sont très riches en pigments autofluorescents (chlorophylle, phycobiliprotéines, caroténoïdes), avec une fluorescence couvrant une large gamme de longueurs d’onde. Ce fait peut compliquer l’analyse d’images CLSM; cependant, l’imagerie à durée de vie de fluorescence (FLIM), le démélange spectral et l’excitation par le laser blanc peuvent aider à séparer les signaux30,31. Une bonne corrélation est généralement trouvée entre l’état physiologique et la performance pigmentaire photosynthétique chez les microalgues3.
Néanmoins, des techniques destructives sont obligatoires pour évaluer les changements dans la contribution relative de différents complexes de fluorescence dans le signal de fluorescence, ou pour effectuer un rapport de fluorescence et/ou une analyse du spectre à plusieurs longueurs d’onde d’excitation.
L’utilisation de cette méthode est particulièrement importante lorsque du matériel rare est disponible et / ou que les cellules ne se développent pas ou se développent très lentement dans des conditions de laboratoire. Les technologies spectrales pourraient offrir des avancées telles que les lasers à lumière blanche (pour obtenir des spectres d’excitation) et les détecteurs hybrides à haute sensibilité, qui, combinés à des techniques de super-résolution, permettent d’obtenir des informations spectrales et la localisation de protéines avec une résolution nanométrique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Cette recherche a été réalisée dans le cadre des projets TIN2015-68454-R et 20961/PI/18, financés par le ministère espagnol de l’Économie et de la Compétitivité et la Fondation Séneca de la région de Murcie. Irene Hernández Martínez et Francisco Javier Ibáñez López de la Section de soutien statistique du domaine scientifique et de la recherche de l’Université de Murcie (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Figure 1 ont été dessinés à l’aide d’images de Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier est sous licence Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | - |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | - |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | - |
| red filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | - | - |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
References
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