Summary
Настоящий протокол описывает пошаговую автофлуоресцентную визуализацию и оценку изменений фикобилипротеина у красных водорослей на основе спектрального анализа. Это безымянный и неразрушающий метод оценки клеточной адаптации к экстремальным местам обитания, когда доступен только дефицитный материал, а клетки растут медленно или вообще не растут в лабораторных условиях.
Abstract
Красные водоросли (Rhodophyta) содержат фикобилипротеины и колонизируют места обитания с тусклым светом, однако некоторые (например, некоторые виды Chroothece ) также могут развиваться при полном солнечном свете. Большинство родофитов красные, однако некоторые из них могут казаться голубоватыми, в зависимости от пропорции синих и красных билипротеинов (фикоцианина и фикоэритрина). Различные фикобилипротеины могут улавливать свет на разных длинах волн и передавать его хлорофиллу а, что делает возможным фотосинтез при самых разных условиях освещения. Эти пигменты реагируют на изменения среды обитания в свете, и их автофлуоресценция может помочь в изучении биологических процессов. Используя Chroothece mobilis в качестве модельного организма и режим спектрального лямбда-сканирования в конфокальном микроскопе, адаптация фотосинтетических пигментов к различным монохроматическим источникам света была изучена на клеточном уровне, чтобы угадать оптимальные условия роста вида. Результаты показали, что даже когда исследуемый штамм был изолирован из пещеры, он адаптировался как к тусклому, так и к среднему освещению. Представленный метод особенно полезен для изучения фотосинтезирующих организмов, которые не растут или растут очень медленно в лабораторных условиях, что обычно имеет место для тех, кто живет в экстремальных средах обитания.
Introduction
Красные водоросли, такие как род Chroothece, могут расти в экстремальных местах обитания, где им часто приходится справляться с заметными изменениями окружающей среды1. Наводнения и засухи часты в полузасушливых регионах, где можно найти этот род, а некоторые виды были зарегистрированы в ручьях, скалах, пещерах или даже в термальных водах2. Однако в большинстве случаев биологические переменные, такие как конкуренция или выпас скота, низводят виды до неоптимальных условий для их роста. Поскольку эти организмы часто трудно культивировать и они либо не растут, либо растут очень медленно в лабораторных условиях, одним из основных ограничений является доступный размер выборки. Поэтому очень важно следовать неразрушающим методам или методам, которые предполагают минимальные манипуляции с образцом 3,4.
Физиологические навыки, необходимые для выживания в этих суровых условиях, можно контролировать, следя за изменениями в их фотосинтетических системах. Метаболические механизмы, эффективность фотосинтеза и чувствительность к свету или условиям культуры могут быть выявлены с помощью профилей излучения флуоресценции пигментов из-за точных изменений в их передаче энергии или улавливании 5,6,7,8.
Аутофлуоресценция клеточных соединений может быть использована в качестве маркера для цитодиагностики или в качестве естественного индикатора клеточного состояния или метаболизма в ответ на внешние и внутренние сигналы посредством изменений излучения9. Он также может быть использован для различения таксономически различных групп фотосинтезирующих организмов10. В зависимости от филогенетического положения фототрофных микроорганизмов можно обнаружить различные особенности флуоресценции in vivo. Таким образом, таксономическая идентификация, основанная на характеристиках фототрофной флуоресценции in vivo (включая спектры поглощения флуоресценции и излучения), была предпринята несколько раз11,12. Из-за разнообразия вспомогательных пигментов среди таксонов фитопланктона различия в длинах волн, на которых стимулируется флуоресценция хлорофилла a (Chl a), или различия в спектрах излучения могут быть использованы для выводатаксономии 13. Спектры возбуждения и излучения флуоресценции in vivo этих образцов зависят не только от типа водорослей, но и от адаптации фотосистемы14. Эффективность передачи энергии к Chl a, или отношение Chl a к вспомогательным пигментам, и содержание клеточного пигмента чувствительны к условиям роста5.
Красные водоросли, особенно Chroothece, имеют несколько дополнительных флуоресцентных пигментов - фикобилипротеинов и каротиноидов; Первые концентрируются в фикобилисомах, прикрепленных к тилакоидам хлоропластов. Фикобилипротеины (фикоцианин, фикоэритрин и аллофикоцианин) могут улавливать свет на разных длинах волн и передавать его Chl a, что делает возможным фотосинтез в самых разных условиях света и культуры15. Например, виды Chroothece могут расти внутри пещер или почти появляться в слегка соленых известковых ручьях2.
Монохроматические огни влияют на рост и пигментный состав фотосинтезирующих организмов и были изучены для предотвращения или контроля роста фотосинтезирующих организмов в пещерах. Mulec et al. показали, что освещение, обогащенное красным цветом, способствует росту цианобактерий, водорослей и растений16. В предыдущих исследованиях также сообщалось, что зеленый свет влияет на пигментный состав цианобактерий17, в то время как другие показали, что зеленый свет предотвращает рост большинства фотосинтезирующих организмов, а некоторые цианобактерии демонстрируют снижение тилакоидов и более слабую среднюю интенсивность флуоресценции18.
Чтобы понять способность Chroothece как модельного организма преодолевать суровые условия, культивируемые клетки подвергались воздействию увеличения интенсивности света и монохроматического света (зеленого или красного)15, чтобы увидеть, как он справляется с тусклыми условиями пещер (где преобладает красный свет). Протокол, представленный в настоящем описании, воспроизводит влияние вышеупомянутых переменных на фикобилипротеины Chroothece на клеточном уровне с использованием собственной автофлуоресценции.
В настоящее время флуоресценция широко используется в качестве инструмента для изучения физиологических реакций сосудистых растений, микроводорослей, макроводорослей и цианобактерий13,14,16. Спектральная конфокальная флуоресцентная микроскопия является превосходным инструментом для исследований in vivo для оценки физиологии фотосинтезирующих образцов на уровне отдельных клеток 10,17,18,19,20, избегая проблем, связанных с низкой скоростью роста в лаборатории и трудностями с получением достаточного количества биомассы для соответствующей экстракции и биохимических методов8 . После обработки клеток в различных условиях культивирования в течение 2 недель профиль лямбда-сканирования можно измерить in vivo. Хотя существует несколько публикаций, в которых использовались различные длины волн возбуждения с помощью конфокальной визуализации 3,4,10,17, большинство фикобилипротеинов и Chl a могут быть обнаружены с использованием линии возбуждения с длиной волны 561 нм, а обнаруженное излучение колеблется от 570 до 760 нм. Эти критерии были основаны на анализе, ранее проведенном 10 с коммерческими чистыми пигментами (таблица 1) с помощью конфокальной визуализации, и полученных результатах на различных видах водорослей20,21,22.
| Пигменты | λflmax (нм) | λ exc (нм) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80,7 ± 1,5 |
| Р-ПЭ | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11.1 ± 0.04 | 42.2 ± 0.3 | 100.0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99.2 ± 0.08 | - |
| 652.1-668.6 | - | - | 1.5 ± 0.01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11.3 ± 0.2 | |
| С-ПК | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33.6 ± 0.9 |
| БТР-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91,4 ± 2,3 |
Таблица 1: Информация о чистом пигменте, используемая для выполнения анализа лямбда-сканирования. В этой таблице показаны пики излучения и максимумы плеч / полос флуоресценции различных флуорохромов/пигментов с помощью спектрофотометрии конфокальной визуализации для всех длин волн возбуждения, а также процент светового излучения пигментов/флуорохромов. Значения рассчитывались по формуле: = MFI*100/255. Каждое значение является средним значением ± SE (среднее ± стандартной ошибки от среднего). Чистые пигменты были использованы для калибровки конфокального сканирующего лазерного микроскопа следующим образом: 1,2,10. Хлорофилл а был получен из Spinacia oleracea, R-фикоэритрин (R-PE) из Porphyra tenera и C-фикоцианин (C-PE) из Spirulina sp. Все виды растворяли в фильтрованной дистиллированной воде. Аллофикоцианин-XL (APC-XL) был получен из Mastigocladus laminosus, который растворяли в сульфате аммония (60%) и фосфате калия (pH = 7) для достижения концентрации 38 мМ. Сканирование проводили с 400 мкл каждого пигментного раствора (концентрация 1 мг / мл) с использованием 8-лунной стеклянной нижней камеры.
Изучение одной длины волны возбуждения является весьма полезным первым приближением. В этом случае, однако, необходимо выяснить относительный вклад различных комплексов в сигнал флуоресценции, что рекомендуется для выполнения коэффициента флуоресценции или спектрального анализа на нескольких длинах волн, среди других методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для настоящего исследования был использован вид водорослей Chroothece mobilis . Вид был получен из коллекции культур Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Обзор протокола показан на рисунке 1.
Рисунок 1: Обзор исследования. Chroothece mobilis инкубируется в экстремальных условиях обитания, таких как различные монохроматические огни, в течение 2 недель. Влияние на физиологию Chroothece оценивается путем автофлуоресценции белков, содержащихся в фикобилисомах и фотосистемах, с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
1. Пробоподготовка
- Приготовьте инокулят Chroothece mobilis из агаровой культуры коллекции, перенеся его в жидкую среду SWES (табл. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = среда морской воды23. - Выдерживают все культуры в течение 2 недель с фотопериодом светлый/темный 16:8 при 20 °C в условиях низкой интенсивности белого света (LL: 80 мкМ/м2/с) и без встряхивания до тех пор, пока не будет получена желаемая плотность клеток (см. этап 1.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия освещения для роста составляют 80 мкМ / м2 / с интенсивность света (активное фотосинтетическое излучение, PAR). Эти условия используются в качестве условий низкой освещенности (контроль). Состав среды SWES приведен в таблице 2. - Проводите посевы для различных экспериментов в экспоненциальной фазе культивирования с плотностью клеток 5 x 103 клеток/мл в 24-луночном планшете, используя 1 мл на лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите подсчет клеток с помощью камерыНойбауэра 24 и при необходимости разбавьте культуру SWES.
| Средний состав SWES | |
| Компонент | Концентрация |
| КНО3 | 1,98 мМ |
| К2ГПО4 | 115 мкМ |
| МгСО4 | 81 мкМ |
| ZnSO4, 7H2O | 17 нМ |
| MnSO4, 7H2O | 45 Нм |
| H 3BO3, 4H2O | 3,1 мМ |
| Co(NO3)2 | 17 мМ |
| Na 2 MoO4, 6H2O | 21 нМ |
| CuSO4, 2H2O | 0,1 нМ |
| FeSO4, 5H2O | 13 мкМ |
| ЭДТА, 7Ч2О | 11 мкМ |
| Вит Б12 | 5 мкг |
| Экстракт почвы | 30 мл |
| Фильтрованная речная вода | 455 мл |
Таблица 2: Состав среды SWES.
2. Воспроизведение экстремальных условий обитания водорослей: зеленый и красный монохроматический световой эффект
- Добавьте 1 мл клеточной культуры из исходной культуры, приготовленной при вышеупомянутой плотности клеток (этап 1.2), чтобы инокулировать каждую лунку 24-луночной пластины.
- Держите клеточную культуру закрытой в течение 2 недель, чтобы воспроизвести монохроматический световой эффект.
- Используйте зеленый фильтр, который пропускает зеленый свет в диапазоне от 470 до 570 нм с пиком на длине волны 506 нм (в соответствии со спецификациями производителя; см. Таблицу материалов), и подвергните его воздействию культуры25.
- Используйте красный фильтр, который пропускает красный свет в диапазоне от 590 до 720 нм и пики при 678 нм (в соответствии со спецификациями производителя; см. Таблицу материалов), чтобы подвергнуть его воздействию культуры25.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условие низкой интенсивности белого света (LL: 80 мкМ/м2/с; см. Таблицу материалов) используется в качестве регулятора интенсивности света для сравнения полученных эффектов. Используемыми единицами интенсивности света являются микромоль в секунду и квадратный метр (мкмоль, м-2 , с-1) или плотность потока фотосинтетических фотонов (PPFD).
3. Автофлуоресцентная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов) показана на рисунке 2.
- Включите все компоненты инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM; см. Таблицу материалов), включая лазер.
- Смонтируйте ячейки из каждой экспериментальной лунки 24-луночной пластины в питательной среде SWES в стеклянную нижнюю чашку диаметром 35 мм (см. Таблицу материалов) для визуализации.
- Выберите иммерсионный объектив с глицерином 63x/1.30 NA и поместите глицерин поверх объектива (см. Таблицу материалов).
- Поместите луночную пластину на столик микроскопа и убедитесь, что образец не перемещается во время получения изображения.
- Отцентрируйте образец по световому пути и сфокусируйтесь на центре клетки, выбрав плоскость с наибольшей интенсивностью флуоресценции.
- Откройте программное обеспечение для получения изображений и выберите xyλ из выпадающего списка в режиме съемки26.
- Выберите линию возбуждения лазера на 561 нм DPSS, 8 бит динамического диапазона и 1024 x 1024 пикселей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что конфокальный микроскоп оснащен DPSS-лазером с длиной волны 561 нм или лазером белого света (WLL). - Соберите спектры флуоресцентного излучения в полосе пропускания 10 нм и размер шага лямбда 4 нм в диапазоне 570-760 нм.
- Установите точечное отверстие на 1 единицу Эйри и запустите сбор лямбда-сканирования.
- Повторите этот процесс как можно больше раз в разных полях зрения, чтобы собрать приемлемый объем данных для статистического анализа (обычно стандартное отклонение ниже 10%22).
- Повторите последний шаг в разных условиях (при красном и зеленом свете) и сохраните данные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одни и те же настройки сбора данных для разных образцов и условий для сравнения и проведения статистического анализа.
Рисунок 2: Настройка программного обеспечения. Пользовательский интерфейс программного обеспечения для обработки изображений для настройки параметров лямбда-сканирования. (A) Слева направо, чтобы выбрать режим сбора данных xyλ из выпадающего списка, который соответствует шагу 3.6 в протоколе, и выбрать правый тип погружной линзы, соответствующий шагу 3.3 в протоколе. Убедитесь, что все фильтры удалены из светового тракта на шаге 3.9. (B) Панель настройки параметров лямбда-сканирования соответствует шагу 3.8 протокола. (C) Запустите лямбда-сканирование на шаге 3.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Параметры для оценки физиологии Chroothece
- После получения лямбда-сканирования щелкните окно количественной оценки в верхней части программного обеспечения (как показано на рисунке 3), чтобы оценить собранные спектры флуоресцентного излучения. Перейдите в окно Open project и выберите один файл xyλ (рисунок 3).
- Выберите Анализ профиля стека в программном обеспечении для обработки изображений.
- Определите область интереса (ROI) 4мкм2 в центре ячейки, чтобы проанализировать среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Экспортируйте данные в формате CSV.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать присутствия черных пикселей (чтобы выбранные пиксели содержали положительные значения) и всегда поддерживать рентабельность инвестиций одинакового размера. - Повторите этот процесс с разными ячейками в разных условиях, чтобы получить достаточно данных для выполнения статистического анализа.
- Откройте файлы CSV, чтобы выбрать различные пики излучения флуоресценции из фикобилипротеинов и хлорофиллов всех измеренных ROI.
- Выберите данные флуоресценции фикоэритрина-фикоцианобилина (PE-PCB; 620 нм), C-фикоцианина (CPC; 648 нм), аллофикоцианина (APC; 660 нм) и хлорофилла a (Chl a; 680 нм) соответственно в файле csv.
- Создайте новую таблицу со всеми максимальными значениями флуоресценции, полученными от каждого пика фикобилипротеина и хлорофилла, и нанесите данные на график.
- Проведите статистический анализ.
- Проанализируйте, соответствуют ли полученные данные нормальности и гомоскедастичности27.
- Переходим к анализу t-критерия27,28, если выполняется первое условие. Если нет, запустите тест Mann-Whitney U29.
- Рассмотрим различия, значимые при значениях p <0,05.
Рисунок 3: Оценка автофлуоресценции Chroothece. Чтобы выполнить автофлуоресцентный анализ, убедитесь, что в окне открытых проектов выбрано окно количественного определения и один файл xyλ (этап 4.1); выберите визуализацию профиля стека (шаг 4.2); выберите ROI 4мкм2 в центре ячейки и нажмите кнопку отчета, чтобы экспортировать данные лямбда-сканирования в формате CSV (шаг 4.3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хлорофилл a обычно поглощает синие и красные длины волн видимого света, тогда как фикобилипротеины используют зеленые, желтые и оранжевые длины волн7. Автофлуоресценция этих пигментов делает возможным первый подход к изучению фикобилипротеинов и поведения хлорофилла в экспериментальных и полевых условиях.
Сравнивая полученные данные и нанося на разные графики, можно выделить значимые изменения средней интенсивности флуоресценции (MFI) (рис. 4). Дальнейшее статистическое исследование различных пиков излучения, полученных в профилях лямбда-сканирования (620, 648, 660 и 680 нм), показало значительные различия (статистическая значимость: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
MFI PE-PCB значительно снижался, когда клетки подвергались воздействию зеленого монохроматического света (GL), но никакой разницы по сравнению с контролем не наблюдалось в красном свете (RL) (рис. 4A). Однако GL оказал противоположное влияние на APC и Chl a (рис. 4B, C), в которых MFI значительно увеличился из-за адаптации антенных комплексов, в том числе из-за увеличения количества или улучшения связности антенных комплексов. RL вызвал незначительное увеличение как APC, так и Chl флуоресценции 17,24,25,26.
Рисунок 4: Влияние на флуоресценцию фикобилипротеинов Chroothece и хлорофилла а при монохроматической световой обработке. (А-С) Интенсивность флуоресцентного излучения, полученная на длине волны возбуждения 561 нм в лямбда-сканировании и проанализировавшая данные, относящиеся к различным фикобилипротеинам (A: PE-PCB; B: APC) и хлорофилл (C: Chl a). Прямоугольники содержат построенные на графике медианные, минимальные и максимальные значения интенсивности флуоресцентного излучения. Зеленые прямоугольники: зеленый монохроматический режим освещения (GL); красные прямоугольники: красный монохроматический свет (RL); и синие прямоугольники: условия низкой освещенности (LL, контроль). Статистическая значимость: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Некоторые одноклеточные или колониальные красные водоросли, такие как Chroothece, медленно растут in vitro, но содержат несколько автофлуоресцентных соединений, которые могут быть проанализированы с помощью спектрального анализа под конфокальным микроскопом, где могут быть обнаружены различия в пиках излучения пигмента. Спектральная конфокальная флуоресцентная микроскопия позволила провести исследования in vivo для оценки адаптации или акклиматизации фотосинтезирующих организмов 8,10,17,18,19,20. Большинство других методов, таких как анализ белка, требуют большого количества образцов, являются разрушительными или намного дороже.
Здесь была выбрана длина волны 561 нм, поскольку она более селективна для фикобилипротеинов (на основе предыдущего отчета23); он подтвердил результаты предыдущего исследования влияния GL на цианобактерии с использованием трех различных длин волн возбуждения (351, 488 и 543 нм). Для получения достоверных данных критически важно получить все данные в одних и тех же условиях микроскопа.
Этот протокол представляет собой простой первый подход к изучению поведения клеток Chroothece при различных условиях освещения, в то время как он также дает возможность получить значительные различия в составе фикобилипротеина или хлорофиллов, которые были обработаны в различных монохроматических условиях освещения, благодаря последующему анализу. Это помогает оценить, как клетки красных водорослей реагируют на изменения условий среды обитания, и узнать их способность адаптироваться к экстремальным местам обитания.
Клетки водорослей очень богаты автофлуоресцентными пигментами (хлорофиллом, фикобилипротеинами, каротиноидами), флуоресценция которых охватывает широкий диапазон длин волн. Этот факт может затруднить анализ CLSM-изображений; однако флуоресцентная визуализация времени жизни (FLIM), спектральное смешивание и возбуждение белым лазером могут помочь разделить сигналы30,31. Обычно обнаруживается хорошая корреляция между физиологическим состоянием и эффективностью фотосинтетического пигмента у микроводорослей3.
Тем не менее, деструктивные методы являются обязательными для оценки изменений относительного вклада различных флуоресцентных комплексов в сигнал флуоресценции или для проведения коэффициента флуоресценции и/или спектрального анализа на нескольких длинах волн возбуждения.
Использование этого метода особенно важно, когда доступен дефицитный материал и/или клетки либо не растут, либо растут очень медленно в лабораторных условиях. Спектральные технологии могут предложить такие достижения, как лазеры белого света (для получения спектров возбуждения) и высокочувствительные гибридные детекторы, которые в сочетании с методами сверхвысокого разрешения позволяют получать спектральную информацию и местоположение белков с нанометровым разрешением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Это исследование было проведено в рамках проектов TIN2015-68454-R и 20961/PI/18, финансируемых Министерством экономики и конкурентоспособности Испании и Фондом Сенека региона Мурсия. Ирен Эрнандес Мартинес и Франсиско Хавьер Ибаньес Лопес из Секции статистической поддержки научно-исследовательской области Университета Мурсии (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (рис. 1 ) были нарисованы с использованием рисунков из Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier лицензируется лицензией Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | - |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | - |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | - |
| red filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | - | - |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
References
- Vis, M. L., Necchi, O. Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , Springer Nature. (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , Dresden. (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August.
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2011).
