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Cancer Research

चुंबकीय अनुनाद-निर्देशित उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड उत्पन्न हाइपरथर्मिया: एक मुराइन रैब्डोमायोसारकोमा मॉडल में एक व्यवहार्य उपचार विधि

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64544
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 3,4, 5, 5, 1,2, 6, 6, 7, 3,8, 3,9, 1,3,4,10, 1,2,10
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children, 4Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 5Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 6Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary, 7Department of Radiation Oncology, University of Toronto, 8Department of Medical Imaging, University of Toronto, 9Department of Pediatric Surgery, University of Toronto, 10Department of Surgery, University of Toronto

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां प्रस्तुत नियंत्रित हाइपरथर्मिया का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, जो चुंबकीय अनुनाद-निर्देशित उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड द्वारा उत्पन्न होता है, ताकि एक रैब्डोमायोसारकोमा माउस मॉडल में तापमान-संवेदनशील लिपोसोम से दवा रिलीज को ट्रिगर किया जा सके।

Abstract

चुंबकीय अनुनाद-निर्देशित उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एमआरजीएचआईएफयू) स्थानीयकृत हाइपरथर्मिया के उत्पादन के लिए एक स्थापित विधि है। वास्तविक समय इमेजिंग और ध्वनिक ऊर्जा मॉड्यूलेशन को देखते हुए, यह साधन एक परिभाषित क्षेत्र के भीतर सटीक तापमान नियंत्रण को सक्षम बनाता है। थर्मोसेंसिटिव लिपोसोमल वाहक से दवाओं को जारी करने के लिए हाइपरथर्मिया पीढ़ी जैसे इस गैर-आक्रामक, गैर-आयनीकरण तकनीक के साथ कई थर्मल अनुप्रयोगों का पता लगाया जा रहा है। इन दवाओं में डॉक्सोर्यूबिसिन जैसे केमोथेरेपी शामिल हो सकते हैं, जिसके लिए खुराक-सीमित प्रणालीगत दुष्प्रभावों के कारण लक्षित रिलीज वांछित है, अर्थात् कार्डियोटॉक्सिसिटी। डॉक्सोर्यूबिसिन विभिन्न प्रकार के घातक ट्यूमर के इलाज के लिए एक मुख्य आधार है और आमतौर पर रिलैप्स या आवर्तक रैब्डोमायोसारकोमा (आरएमएस) में उपयोग किया जाता है। आरएमएस बच्चों और युवा वयस्कों में सबसे आम ठोस नरम ऊतक एक्स्ट्राक्रैनियल ट्यूमर है। आक्रामक, मल्टीमॉडल थेरेपी के बावजूद, आरएमएस जीवित रहने की दर पिछले 30 वर्षों से समान बनी हुई है। इस अपूर्ण आवश्यकता को संबोधित करने के लिए एक समाधान का पता लगाने के लिए, दवा रिलीज के लिए हाइपरथर्मिया के स्रोत के रूप में एमआरजीएचआईएफयू का उपयोग करके एक इम्यूनोकॉम्पिटेंट, सिंजेनिक आरएमएस माउस मॉडल में थर्मोसेंसिटिव लिपोसोमल डॉक्सोर्यूबिसिन (टीएलडी) की रिहाई का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था।

Introduction

Rhabdomyosarcoma (RMS) एक कंकाल की मांसपेशी ट्यूमर है जो आमतौर पर बच्चों औरयुवा वयस्कों में होता है। स्थानीयकृत रोग का इलाज अक्सर मल्टीमॉडल उपचार के साथ किया जाता है, जिसमें कीमोथेरेपी, आयनकारी विकिरण और सर्जरी शामिल हैं। मल्टी-ड्रग कीमोथेरेपी रेजिमेन का उपयोग बाल रोगियों में अधिक प्रचलित है, उनके वयस्क समकक्षों की तुलना में बेहतर परिणामहैं2; हालांकि, चल रहे शोध प्रयासों के बावजूद, 5 साल की जीवित रहने की दर बीमारी के सबसे आक्रामक रूप में लगभग30% पर बनी हुई है। देखभाल का कीमोथेरेपी मानक एक मल्टीड्रग आहार है जिसमें विन्क्रिस्टिन, साइक्लोफॉस्फेमाइड और एक्टिनोमाइसिन डी शामिल हैं। रिलैप्स या आवर्तक बीमारी के मामलों में, वैकल्पिक कीमोथेरेपी का उपयोग किया जाता है, जिसमें मानक (मुक्त) डॉक्सोर्यूबिसिन (एफडी) और इफोस्फैमाइड1 शामिल हैं। जबकि इन सभी केमोथेरेपी में प्रणालीगत विषाक्तताएं हैं, डॉक्सोर्यूबिसिन की कार्डियोटॉक्सिसिटी जीवन भर की खुराक सीमा 5-7 लागू करती है। ट्यूमर को दी गई दवा की मात्रा बढ़ाने और प्रणालीगत विषाक्तता को कम करने के लिए, लिपोसोमल एनकैप्सुलेशन सहित वैकल्पिक योगों को विकसित किया गया है। ये गैर-थर्मोसेंसिटिव डॉक्सोर्यूबिसिन हो सकते हैं, जिसे स्तन कैंसर और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा, या थर्मोसेंसिटिव डॉक्सोर्यूबिसिन के उपचार के लिए अनुमोदित किया गया है, जिसके लिए नैदानिक परीक्षण चल रहे हैं 8,9,10,11,12,13। मल्टी-वेसिकुलर लिपोसोम्स और लिगैंड-लक्षित लिपोसोम्स जैसी लिपोसोमल एनकैप्सुलेटेड दवाओं को वितरित करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का मूल्यांकन किया गया है और ट्यूमरके उपचार के लिए वादा दिखाते हैं। इस अध्ययन में, गर्मी के अलावा बहुक्रियात्मक प्रभाव होते हैं, जिसमें दवा रिलीज14 शामिल है। चुंबकीय अनुनाद-निर्देशित उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एमआरजीएचआईएफयू) और थर्मोसेंसिटिव लिपोसोमल डॉक्सोर्यूबिसिन (टीएलडी) के साथ उत्पन्न हाइपरथर्मिया (एचटी) का संयोजन आरएमएस के इलाज के लिए इस जहरीले लेकिन प्रभावी दवा का उपयोग करने के लिए एक नया मल्टीमॉडल चिकित्सीय दृष्टिकोण है, जबकि खुराक-सीमित विषाक्तता को कम करता है और संभावित रूप से ट्यूमर के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाता है।

डॉक्सोर्यूबिसिन तापमान >39 डिग्री सेल्सियस पर टीएलडी से तेजी से निकलता है, जो 37 डिग्री सेल्सियस के औसत मानव शरीर के तापमान से ऊपर है, लेकिन ऊतक क्षति या पृथक्करण का कारण बनने के लिए पर्याप्त नहीं है; यह 43 डिग्री सेल्सियस पर होना शुरू होता है, लेकिन तापमान 60 डिग्री सेल्सियस15 तक पहुंचने पर अधिक तेजी से होता है। विवो में एचटी उत्पन्न करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया गया है, जिसमें लेजर, माइक्रोवेव, रेडियोफ्रीक्वेंसी एब्लेशन और केंद्रित अल्ट्रासाउंड शामिल हैं, जिनमें से कई इनवेसिव हीटिंग मेथड्स16 हैं। MRgHIFU एक नॉनइनवेसिव, नॉनआयोनाइजिंग हीटिंग विधि है जो सीटू में लक्ष्य ऊतक के भीतर सटीक तापमान सेटिंग्स की सुविधा प्रदान करती है। चुंबकीय अनुनाद (एमआर) इमेजिंग महत्वपूर्ण रूप से वास्तविक समय इमेजिंग प्रदान करता है, जहां कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है, उपचार के दौरान ऊतक के थर्मोमेट्री माप की गणना करने के लिए; बाद में, इस डेटा का उपयोग वास्तविक समय में अल्ट्रासाउंड थेरेपी को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है ताकि वांछित तापमान सेट बिंदु 17 तक पहुंचा जा सके और बनाएरखा जा सके। एमआरजीएचआईएफयू का परीक्षण विभिन्न ऊतक प्रकारों में किया गया है और इसका उपयोग तापमान उपचार की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है, हल्के एचटी से एब्लेशन तक, साथ ही साथ दर्दनाक हड्डी मेटास्टेस 18 का सफलतापूर्वक इलाज करने के लिएचिकित्सकीय रूप से। इसके अतिरिक्त, एचटी को ट्यूमर साइटोटॉक्सिसिटी का कारण दिखाया गया है, प्रोटीन अभिव्यक्ति को संशोधित करता है, और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट 19,20,21,22 में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बदल देता है। एक अध्ययन ने हल्के एचटी को टीएलडी के साथ जोड़ा, इसके बाद एक सिनर्जेटिक आर 1 चूहा मॉडल23 में एमआरजीएचआईएफयू के साथ पृथक्करण किया, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर कोर में नेक्रोसिस और परिधि में दवा वितरण हुआ। परंपरागत रूप से, रेडियोथेरेपी का उपयोग ट्यूमर कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने और स्थानीय रोग पुनरावृत्ति को कम करने के लिए एक सहायक चिकित्सा के रूप में किया गया है। हालांकि, इसका उपयोग आजीवन खुराक और ऑफ-टारगेट क्षति1 द्वारा सीमित है। इस प्रकार, एचटी अद्वितीय है कि यह समान विषाक्तता या सीमाओं के बिना कुछ समान प्रभाव पैदा कर सकता है।

आरएमएस के लिए प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल में इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड मेजबानों में सिंजेनिक इम्यूनोसक्षमता मॉडल और रोगी व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) शामिल हैं। जबकि इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड मॉडल मानव ट्यूमर के विकास की अनुमति देते हैं, उनके पास उपयुक्त ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की कमी होती है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाका अध्ययन करने की उनकी क्षमता में सीमित होती है। एफजीएफआर 4-सक्रिय उत्परिवर्तन खराब रोग का निदान और वयस्क और बाल चिकित्सा आरएमएस 1,25 में एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के लिए एक आशाजनक मार्कर है। ग्लेडी लैब में विकसित सिंजेनिक आरएमएस मॉडल में, ट्यूमर एक इम्यूनोसक्षम मेजबान में बढ़ने में सक्षम हैं, जो ट्यूमर 26 के लिए जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षाप्रतिक्रियाओं को विकसित करता है। जैसा कि एचटी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है, मुराइन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में परिवर्तन का अवलोकन इस ट्यूमर मॉडल का एक मूल्यवान लाभ है। एफडी की तुलना में टीएलडी के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया दोनों का परीक्षण करने के लिए, साथ ही कीमोथेरेपी और एचटी दोनों के लिए ट्यूमर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में परिवर्तन, एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था और एमआरजीएचआईएफयू और टीएलडी का उपयोग करके विवो में सिंजेनिक मुराइन आरएमएस ट्यूमर के इलाज के लिए नियोजित किया गया था, जो इस अध्ययन का फोकस है।

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Protocol

अनुसंधान फेनोजेनोमिक्स केंद्र (टीसीपी) और विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क (यूएचएन) पशु संसाधन केंद्र (एआरसी) पशु अनुसंधान सुविधाओं में एक पर्यवेक्षण पशु चिकित्सक के तहत अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल के साथ पशु देखभाल समितियों के अनुपालन में किया गया था। बाहरी हवा या अतिसंवेदनशील संक्रमण के लिए जानवरों के संपर्क को कम करने के लिए जानवरों को शामिल करने वाले एमआरजीएचआईएफयू को छोड़कर सभी प्रक्रियाओं को जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में किया गया था।

1. माउस प्रजनन

नोट: कुल 65 चूहों (स्ट्रेन B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) को पायलट अध्ययन में शामिल किया गया था (पुरुष: n = 23; महिला: n = 42)। नर और मादा दोनों चूहों का उपयोग 7-9 सप्ताह की उम्र में किया गया था। उनके पिल्लों को खरपतवार और जीनोटाइप किया गया था, और प्रयोगों के लिए पी 53 विषम चूहों का उपयोग किया गया था।

  1. प्रजनन पिंजरों को बनाने के लिए प्रत्येक नर माउस के साथ दो मादा चूहों को रखें। जन्म से उनके पिल्लों की उम्र की गणना करें (जन्म = दिन 0)।
  2. 10 वें दिन, पिल्ले को कान की नोक के साथ पहचानें। सेल लाइन इंजेक्शन से पहले जीनोटाइपिंग के लिए पूंछ स्निप एकत्र करें।

2. माउस जीनोटाइपिंग

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एकत्र किए गए 2 मिमी पूंछ क्लिपिंग से डीएनए निकालें।
  2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 260-280 एनएम पर अवशोषण को मापकर डीएनए एकाग्रता और शुद्धता निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) करें।
    1. नमूनों की आवश्यक संख्या के लिए12.5: 0.25: 10.75 (μL) अनुपात में एक वाणिज्यिक पीसीआर मिश्रण (टैक पोलीमरेज़, dNTPS, और MgCl 2; सामग्री की तालिका देखें), प्राइमर, औरdH 2O युक्त एक मास्टर मिश्रण बनाएं। प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में डीएनए नमूने का 1 μL जोड़ें और पीसीआर नियंत्रण के रूप मेंdH 2O, एक शून्य नमूना (p53 उत्परिवर्तन के लिए होमोजीगोस), एक विषम नमूना (p53 उत्परिवर्तन के लिए विषमयुग्मी), और एक जंगली प्रकार (सामान्य p53 के लिए होमोजीगोस) नमूना शामिल करें।
    2. डीएनए युक्त प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में मास्टर मिश्रण का 24 μL जोड़ें। पूरे मास्टर मिश्रण में डीएनए वितरित करने के लिए प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में समाधान को ऊपर और नीचे करें।
    3. प्रतिक्रिया ट्यूबों को थर्मल चक्रक में रखें और निम्नलिखित विनिर्देशों के अनुसार चक्र करें: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 15 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और फिर जेल पर विश्लेषण करने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  4. अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें।
    1. टीएई में अगारोस को गर्म करके और घुलने तक मिलाकर 2% जेल (1x TAE का 50 मिलीलीटर और 1 ग्राम अगारोस) तैयार करें। ठंडा होने पर और अभी भी तरल, अगारोस में 2.5 μL डीएनए जेल दाग जोड़ें और मिलाएं। जेल को कंघी के साथ एक जेल बॉक्स में डालें। जेल को इलेक्ट्रोफोरेटिक उपकरण में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और 1x TAE के साथ कवर करें।
    2. जेल पर 1 केबी डीएनए लैडर के 10 μL लोड करें। प्रत्येक नमूने का लोड 12.5 μL. 135 वोल्ट पर 25 मिनट के लिए जेल चलाएं।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, जेल इमेजर पर उपयोग किए गए डीएनए जेल दाग के लिए उपयुक्त सेटिंग्स का उपयोग करके जेल की छवि बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।

3. ट्यूमर मॉडल तैयारी (चित्रा 1)

  1. एम 25एफवी 24 सी सेल लाइन (मार्ग 12-15) को पूर्ण विकास मीडिया में इंजेक्शन की तारीख से 1 सप्ताह पहले विकसित करें (डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम [डीएमईएम] एडिटिव्स के साथ: 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 एमएम एल-एल-एल-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड) 75 एमएल फ्लास्क में, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर। एक बार जब कोशिकाएं ~ 80% कंफ्लुएंट हो जाती हैं, तो मीडिया को उत्तेजित करें और कोशिकाओं को 1 गुना 5 एमएल डलबेक्को के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के साथ धोएं।
    नोट: M25FV24C एक मुराइन सेल लाइन है जिसे उत्परिवर्ती FGFR4V550E को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए इंजीनियर किया गया है, जो बाल चिकित्सा और वयस्क RMS 1,26 में देखा जाता है।
  2. प्लेट के किनारे 0.25% ट्रिप्सिन समाधान के 0.5 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को उठाएं और कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए बर्तन को इनक्यूबेट करें। एक बार जब कोशिकाएं अलग दिखाई देती हैं, तो ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए कमरे के तापमान पर 2.5 एमएल पूर्ण विकास मीडिया जोड़ें। हेमोसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की सेल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 10 μL नमूना एलिकोट का उपयोग करें।
  3. इंजेक्शन के लिए डीपीबीएस-निलंबित कोशिकाओं की सही मात्रा तैयार करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें: सेंट्रीफ्यूज की मात्रा = (चूहों की संख्या × प्रति माउस कोशिकाओं की संख्या)/ (कोशिकाओं की एकाग्रता), जहां चूहों की संख्या = इंजेक्शन लगाए जाने वाले चूहों + त्रुटि के लिए 10 अतिरिक्त चूहे, और प्रति माउस कोशिकाओं की संख्या = 104।
  4. 153 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। मायो-इंजेक्शन बफर (एफ 10 मीडिया + 0.5% एफबीएस) के उचित मात्रा (चूहों की संख्या × 10 μL प्रति माउस) में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और इस निलंबन की तैयारी के 1 घंटे के भीतर चूहों को इंजेक्ट करें।

4. इंट्रामस्क्युलर सेल इंजेक्शन

नोट: एम 25 एफवी 24 सी कोशिकाओं को 4 से 6 सप्ताह की उम्र के बीच चूहों के दाहिने पिछले अंग में इंजेक्ट किया जाता है। 4 सप्ताह में इंजेक्शन एक ट्यूमर के साथ एक छोटे माउस का उत्पादन करता है जिसका इलाज करना कठिन हो सकता है क्योंकि एचटी फैलाव के लिए आसपास के ऊतक कम होते हैं; 6 सप्ताह तक इंतजार करने से एक बड़ा माउस पैदा होता है, जिससे ट्यूमर का इलाज करना आसान हो जाता है।

  1. समाधान के भीतर कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने में मदद करने के लिए आकांक्षा से पहले सेल निलंबन को कई बार उलट दें। एक माइक्रोलीटर सिरिंज का उपयोग करके एस्पिरेट 10 μL (104 कोशिकाएं) ( सामग्री की तालिका देखें)। माउस को सिकोड़ो; एक बार नियंत्रित होने के बाद, पिछले पैर का विस्तार करके पुच्छल जांघ की मांसपेशियों तक पहुंच प्राप्त की जा सकती है। क्लिपर का उपयोग करके पैर को शेव करें और 70% इथेनॉल के साथ पोंछें।
  2. एम 25एफवी 24 सी सेल सस्पेंशन (10 μL, 104 कोशिकाओं) को 26 s G सुई के साथ गैस-टाइट माइक्रोलीटर सिरिंज का उपयोग करके 4-6 सप्ताह के माउस के दाहिने अंग जांघ की मांसपेशियों में इंजेक्ट करें।
    नोट: सुई को घुटने की ओर फीमर के समानांतर डाला जाना चाहिए, इस बात का ध्यान रखते हुए कि साइटिक तंत्रिका को न मारा जाए। पिछले अंग के छोटे मांसपेशी द्रव्यमान के कारण केवल सुई का बिंदु (लगभग 2 मिमी) डालें।
  3. एक स्थिर गति में समाधान का प्रबंधन करें। सुई को हटा दें और सुनिश्चित करें कि रक्तस्राव न हो। माउस को दूसरे पिंजरे में वापस करें।
  4. जानवरों का प्रतिदिन मूल्यांकन करें और धड़कन के माध्यम से ट्यूमर के विकास के लिए उनके पिछले अंगों की निगरानी करें। कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत्यु करें यदि निम्नलिखित प्रारंभिक अंत बिंदुओं में से कोई भी सामना किया जाता है: ट्यूमर का आकार व्यास में 1.5 सेमी से अधिक, ट्यूमर अल्सरेशन, या बीमारी के प्रणालीगत लक्षण (पिलोइरेक्शन, झुकी हुई मुद्रा, निष्क्रियता, या भोजन या पानी का सेवन कम हो जाता है)।

5. स्क्रीनिंग एमआरआई स्कैन

  1. माउस को एक ऐसे स्तर पर एनेस्थेटाइज करें, जहां पंजे के निचोड़ के साथ कोई आंदोलन नहीं होता है, निम्नलिखित मापदंडों के तहत आइसोफ्लुरेन के साथ: 1.5 एलपीएम पर 4% के साथ एक कक्ष में प्रेरित करें, फिर एमआरआई स्कैनर स्लेज पर नाक शंकु में स्थानांतरित करें और 0.75 एलपीएम पर 1.5% -2% के साथ नाक शंकु पर आइसोफ्लुरेन रखरखाव जारी रखें। श्वसन मॉनिटर संलग्न करें। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का उपयोग करें।
  2. एमआरआई स्कैनर का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड माउस की छवि ( सामग्री की तालिका देखें)। टी 2-भारित छवि (Ax_Screen अधिग्रहण, तालिका 1) पर, इन-प्लेन आयामों और अक्षीय स्लाइस की संख्या पर ध्यान दें जो ट्यूमर के भीतर दिखाई देते हैं। जांघ की फीमर और पार्श्व सतह के संदर्भ में ट्यूमर के स्थान पर ध्यान दें, जहां अल्ट्रासाउंड तरंग प्रवेश करेगी।
    नोट: ट्यूमर मांसपेशियों के भीतर एक हाइपरइंटेंस द्रव्यमान के रूप में दिखाई देता है जो विपरीत तरफ से असममित है। कई उपचारों के लिए एक अच्छा शुरुआती ट्यूमर आकार तीव्र या उत्तरजीविता अध्ययन के लिए 2 मिमी x 2 मिमी x 2 मिमी है। यदि यह बहुत बड़ा है, तो यह केवल तीव्र अध्ययन के लिए अच्छा होगा क्योंकि ट्यूमर तीन साप्ताहिक उपचार पूरा करने से पहले एक आकार के अंत बिंदु तक पहुंच जाएगा। HIFU उपचार के लिए बहिष्करण मानदंडों में शामिल हैं: फीमर के चारों ओर लपेटा गया, फीमर के बहुत करीब, माउस पर बहुत पीछे, फीमर के लिए औसत दर्जे का, मलाशय के बहुत करीब।
  3. स्कैनर से माउस निकालें और बेसलाइन वजन प्राप्त करें। माउस को उनके मध्य शरीर से नीचे उनके पैरों तक एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ संज्ञाहरण के तहत शेव करें।
    नोट: आदर्श रूप से, शेविंग उपचार से 1 दिन पहले की जाती है, क्योंकि यह माउस को ग्रूमिंग करने की अनुमति देता है जो डिपिलेटरी क्रीम को अधिक कुशलता से काम करने की अनुमति देता है।
  4. पिंजरे के एक छोर के नीचे हीटिंग पैड का उपयोग करके बीएससी में माउस को पुनर्प्राप्त करें। माउस को उसके पिंजरे में वापस कर दें जब वह उरोस्थि पुनरावृत्ति प्राप्त करता है।

6. प्रयोग: HIFU उपचार दिवस पशु तैयारी

  1. छोटे बोर HIFU ( सामग्री की तालिका देखें) प्रणाली तैयार करने के लिए, जनरेटर को चालू करें और ट्रांसड्यूसर को पर्याप्त विआयनीकृत पानी से भरें जब तक कि ट्रांसड्यूसर के नीचे झिल्ली का विस्तार नहीं किया जाता है, लेकिन इतना दृढ़ नहीं है कि यह माउस को संपीड़ित कर दे। माध्यम से घुलित ऑक्सीजन को हटाने के लिए ट्रांसड्यूसर सर्किट में 30 मिनट के लिए पानी को कम करें।
  2. संबंधित कंप्यूटर सिस्टम तैयार करें।
    1. नियंत्रण कंप्यूटर चालू करें और सुनिश्चित करें कि यह ईथरनेट के माध्यम से HIFU जनरेटर से और यूएसबी के माध्यम से थर्मल जांच डिस्प्ले से जुड़ा हुआ है। सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और माउस डालने से पहले ट्रांसड्यूसर को घर पर क्लिक करें ।
    2. फाइबरऑप्टिक थर्मल जांच को कैलिब्रेट करें: बेसलाइन कमरे के तापमान प्राप्त करें और एमआरआई कमरे में तापमान परिवर्तन को नोट करें। चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के कारण प्रत्येक जांच के लिए तापमान बहाव के परिमाण पर ध्यान दें। स्कैनिंग के दौरान तापमान अंशांकन के लिए गैडोलीनियम से भरे ग्लास ट्यूब में बहाव ट्यूब तापमान जांच डालें और टेप के साथ बहाव ट्यूब को सुरक्षित करें।
      नोट: बेसलाइन कमरे का तापमान (बहाव ट्यूब) सॉफ्टवेयर में जीयूआई में थर्मोमेट्री पैरामीटर के रूप में मैन्युअल रूप से जोड़ा जाता है। किसी भी तापमान बहाव का पता लगाने के लिए एमआर छवि में बहाव ट्यूब के भीतर रुचि का एक क्षेत्र (आरओआई) सेट किया गया है और स्वचालित रूप से थर्मोमेट्री छवियों को सही करेगा।
    3. दवा को 1 एमएल सिरिंज में इंजेक्ट करने के लिए खींचें और इसे स्वचालित वितरण पंप में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। उस लाइन को प्राइम करें जो माउस की पूंछ की नस कैथेटर से कनेक्ट होगी जब तक कि दवा स्वचालित डिलीवरी पंप पर मैन्युअल डिलीवरी बटन दबाकर लाइन को पूरी तरह से भर नहीं देती है।
    4. एनेस्थेटिक कक्ष में स्थानांतरित करने से पहले ~ 20 मिनट के लिए पिंजरों में चूहों को गर्म करने के लिए एक गर्मी लैंप का उपयोग करें।
      नोट: प्रीहीटिंग वासोडिलेशन को बढ़ावा देता है, जिसका सामना माउस के एनेस्थेटाइज्ड होते ही किया जाएगा और कैथेटर प्लेसमेंट में सहायता मिलेगी।
  3. आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें (प्रेरण: 1.5 एलपीएम पर 4%; रखरखाव: 0.75 एलपीएम पर 1.5% -2%) और नाक शंकु में स्थानांतरित करें। एनेस्थीसिया के तहत ब्लिंक रिफ्लेक्स की कमी के कारण होने वाले नुकसान को रोकने के लिए आंखों पर कॉर्नियल स्नेहक लागू करें।
  4. पूरे दाहिने पिछले अंग सहित मुंडा क्षेत्र पर डिपिलेटरी क्रीम लागू करें, और बालों को हटाने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    नोट: एनेस्थीसिया के तहत बालों को हटाने के दौरान थर्मोरेग्यूलेशन में मदद करने के लिए बीएससी में रहते हुए माउस को हीट लैंप के नीचे रखें।
  5. गर्म पानी के साथ डिपिलेटरी क्रीम को धोने के बाद, माउस को डिजिटल पैमाने पर तौलें और दवा की खुराक के लिए रिकॉर्ड करें।
  6. माउस को एमआरआई स्लेज पर एमआरआई-संगत नाक शंकु में ले जाएं। एमआरआई की तैयारी करते समय इसे गर्म रखने के लिए माउस पर एक हीट लैंप रखें। माउस को पार्श्व डेक्युबिटस स्थिति में रखें जिसमें गैर-ट्यूमर असर वाली तरफ नीचे हो और ट्यूमर स्लेज पर 3 डी-मुद्रित माउस धारक के अंदर बेहतर हो (पूरक चित्र 1 और चित्रा 2)। ट्यूमर की उचित स्थिति सुनिश्चित करें (यानी, कॉइल के केंद्र में क्षैतिज और लंबवत रूप से, अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर द्वारा संपीड़न के लिए माउस धारक के किनारों के ठीक ऊपर ऊंचाई के साथ)।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो माउस के नीचे रखने के लिए एक संपीड़ित अल्ट्रासाउंड जेल पैड सेगमेंट काटें, धारक के निचले हिस्से को अस्तर करें, जिसमें ट्यूमर को धारक के शीर्ष पर समतल करने के लिए मोटाई हो।
  7. ट्यूमर पैर से असंबद्ध पैर को दूर रखें, या तो माउस के नीचे या ट्यूमर पैर फ्लेक्स के साथ विस्तारित। सुनिश्चित करें कि पैर ट्यूमर और अल्ट्रासाउंड बीम पथ के निकट क्षेत्र या दूर के क्षेत्र में नहीं हैं। पूंछ की नस में कैथेटर सम्मिलन के लिए गर्म लैंप को पूंछ से 15 सेमी गर्म करने के लिए रखें।
  8. एसोफैगल तापमान जांच डालें।
    1. नाक शंकु के माध्यम से एसोफैगल जांच को पिरोएं और माउस की गर्दन को रगड़ें। सिर का विस्तार करके अपने मुंह से सीधे अपने पेट तक एक रेखा बनाने के लिए माउस नाक को ऊपर झुकाएं। माउस अन्नप्रणाली में लगभग 0.5 सेमी जीभ के ऊपर थर्मल जांच को स्लाइड करें और माउस की नाक के चारों ओर नाक शंकु को बदलें। स्लेज के शीर्ष पर एसोफेजेल जांच और नाक शंकु को सुरक्षित करें।
      नोट: सम्मिलन के तुरंत बाद श्वसन संकट के संकेतों के लिए निगरानी करें क्योंकि इसे श्वासनली में अनुचित रूप से डाला जा सकता है।
  9. रेक्टल तापमान जांच डालें।
    नोट: रेक्टल और एसोफेजेल तापमान जांच एक दूसरे के 3 डिग्री सेल्सियस के भीतर होनी चाहिए।
  10. माउस के सिर की ओर कनेक्टिंग केबल के साथ श्वसन मॉनिटर रखें ताकि यह अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के प्लेसमेंट में हस्तक्षेप न करे। टेप के साथ सुरक्षित।
  11. माइक्रोटबिंग से जुड़ी पार्श्व पूंछ की नस में 27 ग्राम तितली सुई पूंछ की नस कैथेटर डालें, जिसमें 20 μL मृत स्थान और टेप सुरक्षित रूप से होते हैं। टैप करने के बाद, सुनिश्चित करें कि कैथेटर अभी भी अच्छी तरह से फ्लश हो रहा है।
  12. तैयार माउस, माउस स्लेज, एनेस्थीसिया लाइन, श्वसन रेखा, पूंछ नस कैथेटर और थर्मल जांच डोरियों को एमआरआई स्कैनर में ले जाने के लिए दो लोगों का उपयोग करें, और एमआरआई स्लेज धारक में रखें।
  13. HIFU सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) ऑपरेटर प्रारंभिक संरेखण 27 के लिए दृश्य निरीक्षण द्वारा सीधे ट्यूमर पर ट्रांसड्यूसर के मेनिस्कस कोस्थानांतरित करता है। ट्यूमर के ऊपर बाल रहित त्वचा पर आंख स्नेहक या डिगैस्ड अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें और ट्यूमर क्षेत्र में एचआईएफयू ट्रांसड्यूसर को जोड़ें।
  14. स्वचालित पंप से दवा वितरण लाइन को पूंछ नस कैथेटर से कनेक्ट करें। पूंछ नस रेखा और कनेक्टिंग लाइन में मृत स्थान की मात्रा की गणना करें। एमआरआई रेल पर माउस HIFU स्लेज को एमआरआई के केंद्र में स्लाइड करें।
  15. दवा के प्रकार और एकाग्रता और जानवर के वजन के आधार पर पंप पर दवा जलसेक की मात्रा निर्धारित करें, और मृत स्थान की मात्रा जोड़ें। पंप को 200 μL/min की जलसेक की दर पर सेट करें।
    नोट: इस अध्ययन में, एफडी और टीएलडी का उपयोग 2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता और 5 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की खुराक पर किया गया था।
  16. बेसलाइन थर्मल जांच तापमान रिकॉर्ड करें।
  17. सबसे गर्म सेटिंग पर एयर कन्वेक्शन वार्मिंग डिवाइस ( सामग्री की तालिका देखें) रखें। एमआरआई बोर के केंद्र में माउस की ओर हवा उड़ाने वाली ट्यूब को इंगित करें और टेप के साथ सुरक्षित करें। सोनिकेशन के दौरान माउस के अतिताप को रोकने के लिए वार्मिंग डिवाइस को बाद में इसकी सबसे कम सेटिंग (32 डिग्री सेल्सियस) में बदल दिया जाएगा।
  18. सर्वेक्षण एमआर छवियों को प्राप्त करें (Ax_Loc, Sag_Loc; तालिका 1) गहराई सहित सोनिकेशन लक्ष्यीकरण के लिए ट्यूमर स्थान निर्धारित करने के लिए। छवि पर मापी गई वांछित आंदोलन दूरी डालकर और फिर स्थानांतरित करने के लिए तीर की दिशा पर क्लिक करके एचआईएफयू सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तदनुसार ट्रांसड्यूसर स्थिति को समायोजित करें (चित्रा 3 ए)। बहाव ट्यूब के स्थान पर भी ध्यान दें। आवश्यकतानुसार दोहराएं।
  19. Test_Shot थर्मोमेट्री अधिग्रहण के दौरान एक संक्षिप्त 5 एस एक्स 50 एमवी आयाम निरंतर 'टेस्ट शॉट' सोनिकेशन करके कोरोनल प्लेन में ट्रांसड्यूसर के फोकल स्पॉट का स्थान निर्धारित करें (तालिका 1)।
  20. एचआईएफयू सॉफ्टवेयर के भीतर फोकल स्पॉट के कोरोनल दृश्य के साथ एमआर सर्वेक्षण छवियों को संरेखित करें। बोनी संरचना और मलाशय के सापेक्ष ट्यूमर स्थान के लिए छवियों की समीक्षा करें, और ट्रांसड्यूसर स्थिति को आवश्यक रूप से संशोधित करें।
  21. नौ-पुनरावृत्ति थर्म इमेजिंग (तालिका 1) के दौरान परीक्षण शॉट सोनिकेशन को दोहराएं ताकि यह पुष्टि की जा सके कि न्यूनतम ऑफ-टारगेट हीटिंग के साथ ट्यूमर की मात्रा में समान और सटीक हीटिंग है या नहीं। स्लाइस स्थान, ट्रांसड्यूसर स्थान और स्टीयरिंग की गहराई को समायोजित करें, और आवश्यक रूप से दोहराए गए "परीक्षण शॉट्स" के साथ हीटिंग प्रदर्शन की पुष्टि करें।
  22. HIFU उपचार निगरानी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, स्थानांतरित करने के लिए दूरी को मापकर और फिर कार्यक्रम में ग्रिड निर्देशांक को बदलकर अंतिम हीटिंग प्रोफ़ाइल के भीतर थर्मोमेट्री निगरानी के लिए ROI को परिभाषित करें। बहाव सुधार के लिए बहाव ट्यूब के चारों ओर एक आरओआई सेट करें। थर्मोमेट्री माप के लिए रेक्टल जांच तापमान के आधार पर बेसलाइन तापमान दर्ज करें। HIFU प्रणाली का उपयोग HIFU उपचार सोनिकेशन शुरू करने और थर्मोमेट्री निगरानी के लिए किया जाता है।
  23. सॉफ्टवेयर में 20 मिनट हाइपरथर्मिया उपचार विनिर्देशों को खोलें और संदर्भ एमआर छवियों को एकत्र करने और थर्मोमेट्री शुरू होने के बाद सोनिकेशन शुरू करें।
  24. अंतर्निहित आनुपातिक-एकीकृत-व्युत्पन्न (पीआईडी) नियंत्रक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके थर्म इमेजिंग (तालिका 1) के दौरान 20 मिनट का उपचार (चित्रा 3 बी) करें। आरओआई में तापमान वांछित तापमान (40 डिग्री सेल्सियस) तक गर्म होने के बाद, चयनित दवा को 1.5 मिनट पर इंजेक्ट करें।
  25. पूरे उपचार के दौरान कोर तापमान की निगरानी करें। यदि उपचार के दौरान मलाशय का तापमान तेजी से बढ़ रहा है, तो 10 या 20 मिनट की उपचार अवधि में रेक्टल वार्मिंग से बचने के लिए माउस रीपोजिशनिंग की आवश्यकता हो सकती है। यदि मलाशय का तापमान >40 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ जाता है तो उपचार बंद कर दें।

7. प्रयोग: तीव्र अध्ययन के लिए माउस मॉडल इमेजिंग और सोनिकेशन प्रक्रिया

  1. उपचार के पूरा होने के बाद, एमआरआई बोर से माउस को हटा दें, पूंछ की नस कैथेटर सम्मिलन स्थल पर हेमोस्टेसिस सुनिश्चित करें। माउस को बीएससी में स्थानांतरित करें और निरंतर संज्ञाहरण के लिए नाक शंकु पर रखें।
  2. माउस को नीले रंग के शोषक पैड पर अपनी पीठ पर रखें, जिसके अंगों को नियंत्रित किया जाए और दिल को उजागर किया जाए।
  3. हृदय को हटाने के बाद कार्डियक पंचर के माध्यम से एक्ससेंग्यूनेशन के माध्यम से चूहों को इच्छामृत्यु करें। रक्त को तुरंत लें और 10 मिनट के लिए 10,621 x g पर प्लाज्मा पृथक्करण के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. नेक्रोपसी करें और विश्लेषण के लिए आवश्यक अंगों को संग्रहीत करें। तरल नाइट्रोजन में अंगों को फ्रीज करें और तरल नाइट्रोजन टैंक में कई महीनों या लंबे समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. यांत्रिक रूप से विआयनीकृत पानी के नौ गुना अतिरिक्त (डब्ल्यू / डब्ल्यू) जोड़कर और एक मोती-बीटिंग होमोजेनाइज़र का उपयोग करके ऊतक को तोड़कर ट्यूमर ऊतक को समरूप करें। 600 μL समरूप ऊतक से डॉक्सोर्यूबिसिन निकालें, क्रमिक रूप से 300 mg/mL सिल्वर नाइट्रेट के 75 μL, 10 mM सल्फ्यूरिक एसिड के 75 μL और 1: 1 आइसोप्रोपेनॉल: क्लोरोफॉर्म के 2.5 mL जोड़कर। 20 मिनट के लिए भंवर और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) के लिए नमूने तैयार करने के लिए, चरण 7.5 से 4,500 x g पर समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें, कार्बनिक विलायक परत को हटा दें, और नाइट्रोजन गैस की धारा के नीचे आइसोप्रोपेनॉल: क्लोरोफॉर्म को सुखाएं। 2: 1 MeOH: H 2 O के 100 μL में पुन: निलंबन एचपीएलसी-एमएस / एमएस28का उपयोग करके डॉक्सोर्यूबिसिन एकाग्रता को मापें।

8. प्रयोग: जीवित रहने के अध्ययन के लिए माउस मॉडल इमेजिंग और सोनिकेशन प्रक्रिया

नोट: उत्तरजीविता अध्ययन के लिए, HIFU उपचार दिवस पशु तैयारी प्रक्रिया (चरण 6.1 से 6.25) का पालन करें।

  1. उपचार के पूरा होने के बाद, माउस को ठीक होने की अनुमति देने के लिए एक हीट लैंप के नीचे रखें, और इसकी श्वास और आंदोलन की निगरानी करें जब तक कि यह उरोस्थि पुनरावृत्ति प्राप्त न कर ले। फिर, जानवर को उसके पिंजरे में वापस कर दें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पिंजरे का आधा हिस्सा गर्मी लैंप के अनुरूप है, क्योंकि जानवरों का थर्मल विनियमन संज्ञाहरण और एचटी उपचार से प्रभावित होता है।
  2. संकट के किसी भी संकेत के लिए व्यवहार, भोजन पैटर्न और श्वसन दर के लिए रोजाना चूहों की निगरानी करें।
  3. लगातार 3 सप्ताह के लिए चरण 6.1 से 6.25 का पालन करते हुए साप्ताहिक रूप से एक बार उपचार करें।
  4. सप्ताह में दो बार, ट्यूमर माप के लिए चूहों की एमआरआई इमेजिंग करें। उपचार के दौरान हफ्तों के लिए, हर हफ्ते एक एमआरआई स्कैन और एक अल्ट्रासाउंड करें। उपचार पूरा होने के बाद, द्विसाप्ताहिक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग करें।
  5. उपचार की श्रृंखला को पूरा करने के 60 दिन बाद माउस को यूथेनाइज़ करें, या जब एक मानवीय समापन बिंदु तक पहुंच गया है (ट्यूमर का आकार >1.5 सेमी3 या ट्यूमर से रुग्णता), इसके बाद ट्यूमर के साथ नेक्रोपसी और विश्लेषण के लिए अंग हटाने।

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Representative Results

MRgHIFU-जनित हाइपरथर्मिया प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, पिछले अंग में ट्यूमर को उपचार की अवधि के लिए वांछित निर्धारित तापमान पर लगातार गर्म किया जा सकता था (चित्रा 4 एक प्रतिनिधि उपचार दिखाता है, 10 या 20 मिनट, एन = 65)। एक उपचार को सफल मानने के लिए, आरओआई को उपचार की संपूर्णता के लिए 39 डिग्री सेल्सियस से ऊपर बनाए रखा जाना था, जिसमें पूरे उपचार के दौरान <6 डिग्री सेल्सियस भिन्नता थी और ऑफ-टारगेट ऊतक को गर्म किए बिना। इसके अतिरिक्त, रेक्टल जांच या शुरुआती रेक्टल तापमान के साथ-साथ एसोफेजेल जांच तापमान (पूरक चित्रा 2) में परिवर्तन के आधार पर कोर तापमान को 39 डिग्री सेल्सियस से नीचे रहना पड़ा। एक बार जब एमआरजीएचआईएफयू का सोनिकेशन बंद हो गया, तो ट्यूमर तेजी से बेसलाइन तापमान पर लौट आया।

ट्यूमर को 43 डिग्री सेल्सियस से ऊपर संचयी तापमान प्रभाव से बचते हुए तेजी से दवा रिलीज के लिए तापमान तक पहुंचने के लिए 40.5 डिग्री सेल्सियस तक लक्षित किया गया था। सभी उपचारित ट्यूमर में आरओआई का औसत तापमान 40.6 डिग्री सेल्सियस (एन = 65) था, जिसमें 4.3 डिग्री सेल्सियस के 10वें प्रतिशत और 90वें प्रतिशत वोक्सल्स के बीच औसत अंतर था। औसत तापमान का मानक विचलन 10 और 20 मिनट दोनों उपचारों के लिए उपचार की अवधि के लिए 1.3 डिग्री सेल्सियस था (चित्रा 5)। समावेश मानदंडों को पूरा करने के लिए उपचार की सफलता दर अध्ययन की अवधि में 11% से 100% तक काफी सुधार हुआ (चित्रा 6)।

उपचार प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के बाद, नॉर्मोथर्मिक (एनटी) चूहों की तुलना में दवा रिलीज प्रभावकारिता के लिए हाइपरथर्मिया की अवधि का आकलन किया गया था। आगे के अध्ययन के लिए इष्टतम हाइपरथर्मिया उपचार समय निर्धारित करने के लिए, उपचार की दो अवधियों का परीक्षण किया गया था: 10 मिनट और 20 मिनट। इन अवधियों को कोर नॉर्मोथर्मिया और ट्यूमर हाइपरथर्मिया को लगातार बनाए रखने की व्यवहार्यता के लिए चुना गया था। उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचपीएलसी-एमएस) का उपयोग ट्यूमर में डॉक्सोर्यूबिसिन की मात्रा का आकलन करने और परीक्षण की गई अवधि के बीच डॉक्सोर्यूबिसिन संचय के अंतर को निर्धारित करने के लिए किया गया था। टीएलडी 20 मिनट एनटी चूहों (चित्रा 7, क्यू = 0.000108) की तुलना में 20 मिनट एचटी + टीएलडी उपचारित चूहों में ट्यूमर में डॉक्सोर्यूबिसिन की प्रारंभिक खुराक (% आईडी) का काफी अधिक प्रतिशत था। 10 मिनट और 20 मिनट एचटी + टीएलडी समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था; हालांकि, 20 मिनट समूह (ट्यूमर के 3.698 बनाम 2.065% आईडी / जी) की तुलना में 10 मिनट के उपचार समूह में एक बड़ा मानक विचलन था। विशेष रूप से, 10 मिनट एचटी + टीएलडी उपचार समूह के भीतर चार लगभग शून्य मान थे, जो सभी टीएलडी के एक बैच के साथ इलाज किए गए थे। टीएलडी को विवो प्रयोगों में उपयोग से पहले विशेषता दी गई थी, जैसा कि पहले ड्यून एट अल .28 द्वारा वर्णित किया गया था। संक्षेप में, टीएलडी को इसके आकार, ज़ेटा क्षमता, पिघलने चरण संक्रमण तापमान और दवा एकाग्रता के संदर्भ में विशेषता थी, और लिपोसोम का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के 72 घंटे के भीतर किया गया था। यद्यपि टीएलडी के सभी बैचों का उपयोग करने से पहले परीक्षण किया गया था, यह संभव है कि लिपोसोम ने उपयोग से पहले प्रयोगात्मक सेटअप के दौरान डॉक्सोर्यूबिसिन जारी किया था। इसके अलावा, स्कैन के दौरान गति के परिणामस्वरूप सॉफ्टवेयर में गलत तरीके से ऊंचा तापमान गणना हो सकती है, इस प्रकार ट्यूमर को कम गर्म किया जा सकता है और इसके परिणामस्वरूप दवा रिलीज कम हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, गलत रूप से कम मूल्य भी हो सकते हैं यदि दवा को कभी इंजेक्शन नहीं दिया गया था, उदाहरण के लिए, यदि पूंछ की नस कैथेटर को हटा दिया गया था या अनुचित रूप से रखा गया था। जैसा कि ऊपर देखा गया है, एमआरआई स्लेज के सेटअप में तापमान जांच सम्मिलन (रेक्टल और एसोफेजेल), टेल वेन कैथेटर सम्मिलन और श्वसन मॉनिटर प्लेसमेंट शामिल थे, इसके बाद स्लेज, माउस, टेल वेन कैथेटर, तीन फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच, श्वसन मॉनिटर और एनेस्थीसिया लाइनों को एमआरआई बोर में स्थानांतरित करना शामिल था। इस प्रक्रिया के दौरान कई समय बिंदु होते हैं कि पूंछ की नस कैथेटर को हटाया जा सकता है। यह लाइन में रक्त के वापस प्रवाह की जांच करके नियंत्रित किया गया था, कैथेटर सम्मिलन स्थल से रक्तस्राव, और उपचार के बाद टेप के नीचे दवा पूलिंग, लेकिन त्रुटि एक संभावना बनी हुई है।

Figure 1
चित्रा 1: एचटी अवधि के अध्ययन के लिए पशु उपचार और संबंधित उपचार समूहों के लिए प्रायोगिक प्रोटोकॉल। चूहों को उनके दाहिने पिछले अंग में एम 25 एफवी 24 सी कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया गया था, और 2-3 सप्ताह के बाद एमआरआई का उपयोग करके ट्यूमर गठन के लिए जांच की गई थी। फिर उन्हें नॉर्मोथर्मिक (गैर-एचटी) या हाइपरथर्मिक (एचटी) समूहों में विभाजित किया गया, जिसमें या तो टीएलडी या एफडी 10 या 20 मिनट की अवधि में था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: HIFU उपचार के दौरान माउस सेटअप. (A) आंतरिक रबर अस्तर (लाल) के साथ एक 3D मुद्रित धारक (सफेद) और माउस पोजिशनिंग के लिए अल्ट्रासाउंड बीम मार्ग की अनुमति देने के लिए एक कटआउट. (बी) रेक्टल टेम्प्रेचर होल्ड (हरे केबल), टेल वेन कैथेटर (सफेद), और श्वसन मॉनिटर (नीले) के साथ 3 डी मुद्रित माउस धारक के अंदर माउस सेटअप। (सी) प्रक्रिया के दौरान एमआरआई एचआईएफयू बिस्तर पर माउस की स्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एमआरआईजीएचआईएफयू उपचार के दौरान एमआरआई में माउस। (ए) ट्यूमर (नारंगी में घिरा हुआ) और परिवेश के तापमान को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली बहाव ट्यूब (हल्के नीले रंग में वृत्त) दिखाई देती है। (बी) उपचार के दौरान, थर्मोमेट्री तापमान माप एमआरआई छवि पर लगाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: उपचार के दौरान तापमान (डिग्री सेल्सियस) की निगरानी की जाती है। आरओआई में सभी वोक्सेल के औसत (हरा), शीर्ष 10 वां प्रतिशत (लाल), और शीर्ष 90वां प्रतिशत (सियान) तापमान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: उपचार के दौरान मानक विचलन के साथ अनुकूलन चरण के दौरान परीक्षण किए गए प्रत्येक माउस के लिए आरओआई के भीतर उपचार के दौरान औसत तापमान। उपचार के दौरान समग्र औसत तापमान और मानक विचलन भी दिखाया गया है (नारंगी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: हाइपरथर्मिया उपचार की सफलता दर में समय के साथ सुधार हुआ। उपचार की सफलता समावेश मानदंड (प्रणालीगत तापमान, ट्यूमर तापमान और आरओआई के साथ भिन्नता, और कोई डिस्टल हीटिंग नहीं) पर निर्भर थी। ब्लू लाइन = चूहों का % जिसके लिए उपचार सफल रहा। नारंगी सलाखों = एचटी के साथ इलाज किए गए चूहों की संख्या। प्रत्येक उपचार (उपचार 1-6) एक अलग तारीख को संदर्भित करता है जिस पर प्रयोग आयोजित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: दवा उपचार के बाद ट्यूमर में डॉक्सोर्यूबिसिन की मात्रा। (ए) एचपीएलसी-एमएस परिणामों की कई तुलनाओं के लिए एफडीआर सुधार के साथ कई मैन-व्हिटनी परीक्षण एनटी नियंत्रण की तुलना में 20 मिनट टीएलडी + एचटी समूह में ट्यूमर में डॉक्सोर्यूबिसिन की मात्रा के बीच महत्व (क्यू < 0.05) प्रदर्शित करते हैं। (बी) एफडी समूहों में ट्यूमर में कोई अंतर नहीं देखा गया था। %ID = प्रारंभिक खुराक का प्रतिशत. = q < 0.0001. संक्षेप: एचटी = हाइपरथर्मिया, एनटी = नॉर्मोथर्मिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुक्रम का नाम Ax_Screen Ax_Loc Sag_Loc Cor_TestShot थर्म
अनुक्रम प्रकार T2W दुर्लभ T2W दुर्लभ T2W दुर्लभ चमक चमक
उन्मुखीकरण अक्षीय अक्षीय Sagittal पुष्पहार अक्षीय/धनु
इको समय (एमएस) 40 72 72 6 6
पुनरावृत्ति समय (एमएस) 3200 4500 4500 39.06 39.06
फ्लिप कोण (डिग्री) 90/180 90/180 90/180 10 10
फ़ील्ड-ऑफ-व्यू (मिमी) 28.8 x 28.8 36 x 36 35 x 35 35 x 35
मैट्रिक्स आकार 128 x 128 128 x 128 128 x 128 128 x 128 128 x 128
संकल्प (mm) 0.225 x 0.225 0.281 x 0.281 0.281 x 0.281 0.273 x 0.273 0.273 x 0.273
स्लाइस संख्या 20 20 20 3 2
स्लाइस मोटाई (मिमी) 1 1 1 1.5 1.25
# औसत 3 1 1 1 1
# दोहराव 1 1 1 9 9 या 300
स्कैन का समय 4 मिनट 0 सेकंड 1 मिनट 12 सेकंड 1 मिनट 12 सेकंड 45 s 25 मिनट

तालिका 1: संबंधित अनुक्रम नामों के साथ एमआरआई कैप्चर के लिए पैरामीटर।

पूरक चित्रा 1: आंतरिक रबर अस्तर (लाल) के साथ एक 3 डी मॉडल माउस धारक (सफेद)। आयाम: लंबाई = 43 मिमी, बाहरी त्रिज्या = 15 मिमी, आंतरिक चौड़ाई = 20.7 मिमी । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2: उपचार के दौरान तापमान (डिग्री सेल्सियस) की निगरानी की जाती है। कोर तापमान रेक्टल (नीला) और एसोफेजेल (नारंगी) जांच द्वारा मापा जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: माउस धारक के लिए 3 डी प्रिंटिंग फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां विकसित प्रोटोकॉल का उपयोग हल्के एचटी उपचार के लिए एमआरजीएचआईएफयू का उपयोग करके हिंद अंग ट्यूमर को लक्षित करने और विवो में लिपोसोम से एनकैप्सुलेटेड दवाओं को जारी करने के लिए किया गया था। पायलट अध्ययन के दौरान इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदमों का सामना करना पड़ा, और इन महत्वपूर्ण चरणों को अनुकूलित करने से पायलट अध्ययन पर बेहतर उपचार सफलता मिली। सबसे पहले सोनिकेटेड किए जाने वाले क्षेत्र पर बालों को पूरी तरह से हटाना है। फर के भीतर कोई भी गैस फंसना अल्ट्रासाउंड बीम को गुजरने से रोकता है और लक्ष्य ऊतक1 में अल्ट्रासाउंड मार्ग को अवरुद्ध करता है। दूसरे, माउस पोजिशनिंग एक सफल उपचार के लिए महत्वपूर्ण है; अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के निकट संपर्क में रहने के लिए ट्यूमर को माउस धारक में बेहतर तरीके से रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, माउस को घायल किए बिना बोनी संरचनाओं को अल्ट्रासाउंड बीम पथ से बाहर रखा जाना चाहिए। हड्डी को अल्ट्रासाउंड तरंगों को कुशलता से अवशोषित करने के लिए दिखाया गया है, बाद में एक सीटू हीटिंग स्रोत के रूप में कार्य करता है। यह रुचि के क्षेत्र में अल्ट्रासाउंड पारगमन को अवरुद्ध करते हुए हीटिंग प्रोफाइल को प्रभावित कर सकताहै। विपरीत अंग को अल्ट्रासाउंड पथ के रास्ते से बाहर रखा जाना चाहिए, या तो पैर को शरीर के बाकी हिस्सों के नीचे दबाकर या इसे बढ़ाकर और अल्ट्रासाउंड जेल या जेल पैड के साथ पैरों के बीच हवा भरकर। तापमान जांच से ऑफ-टारगेट हीटिंग और प्रतिबिंब से बचने के लिए मलाशय को अल्ट्रासाउंड के रास्ते से भी बाहर होना चाहिए। सावधानीपूर्वक ट्यूमर की स्थिति एक सफल उपचार को पूरा करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है।

सही स्थिति के बाद, श्वासनली रोड़ा से बचने के लिए एसोफेजेल तापमान जांच का प्लेसमेंट सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। एमआरआई बोर में माउस डालते समय, पूंछ में कैथेटर और इंजेक्शन पंप कैथेटर के बीच धातु कनेक्शन हब को आर्टिफैक्ट निर्माण से बचने के लिए इमेजिंग के क्षेत्र में टेप डिस्टल के साथ सुरक्षित किया जाना चाहिए। अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर को रखा जाना चाहिए ताकि यह पैर के फर-रहित क्षेत्र के संपर्क में हो और श्वसन मॉनिटर को विस्थापित न करे। उपचार के दौरान माउस के मुख्य शरीर के तापमान की सावधानीपूर्वक निगरानी और बाद में माउस के अस्तित्व के लिए संवहन हीटिंग सिस्टम के समायोजन की आवश्यकता होती है। कुछ चूहों में मलाशय और ट्यूमर की निकटता के कारण, कोर तापमान परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए एसोफेजेल जांच के अलावा महत्वपूर्ण था, क्योंकि मलाशय का तापमान केवल कोर बॉडी हीटिंग के विपरीत स्थानीय हीटिंग को प्रतिबिंबित कर सकता था।

इस प्रोटोकॉल को डिजाइन करने और कार्यान्वित करने में, एक बहु-विषयक टीम द्वारा व्यापक समस्या निवारण सफलतापूर्वक निष्पादित किया गया था। माउस पोजिशनिंग के लिए, एक माउस धारक को डिज़ाइन किया गया था और 3 डी मुद्रित किया गया था ताकि इंट्रा-प्रक्रियात्मक शरीर के तापमान समायोजन के लिए माउस के चारों ओर गर्म हवा के प्रवाह की अनुमति मिल सके। अल्ट्रासाउंड ट्रांसडक्शन की अनुमति देते हुए माउस को सुरक्षित रूप से पकड़ने की उनकी क्षमता के आधार पर इस धारक के लिए सामग्री चुनी गई थी। मुद्रित धारक के अंदर एक रबर डालने से व्यक्तिगत माउस समायोजन की अनुमति मिलती है, जबकि नीचे कट आउट अल्ट्रासाउंड तरंग प्रतिबिंब और अनपेक्षित हीटिंग को रोकता है।

मॉडल से जुड़ी सीमाएं हैं, जैसे कि ट्यूमर की निकटता आस-पास की संरचनाओं-हड्डी (फीमर) और मलाशय से- जो क्रमशः अल्ट्रासाउंड तरंगों को अवशोषित या प्रतिबिंबित कर सकती हैं। फीमर के अनजाने हीटिंग के परिणामस्वरूप अस्थि मज्जा विनाश और दर्द हो सकता है, जबकि मलाशय में हवा से अल्ट्रासाउंड प्रतिबिंब स्थानीय हीटिंग और ऊतक क्षति का कारण बन सकता है। इसके अतिरिक्त, जीवित चूहों में उपचार के बाद त्वचा के पुन: विकास के कारण अल्ट्रासाउंड लहर के फंसने के उदाहरण थे, जिससे त्वचा का स्थानीयकरण हुआ। यह संदेह है कि यह बाल कूप के चारों ओर हवा फंसने के कारण है जो ट्रांसड्यूसर और त्वचा के बीच अल्ट्रासाउंड जेल के साथ विस्थापित नहीं होता है। प्रत्येक मामले में, त्वचा आसपास की बाल रहित त्वचा की तुलना में गहरी दिखाई देती है। इन माउस अंगों के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री वर्गों पर, एपिडर्मिस के भीतर बाल देखे गए थे, लेकिन कोई ट्यूमर फाइब्रोसिस या अन्य स्पष्टीकरण नहीं मिला कि अल्ट्रासाउंड त्वचा और चमड़े के नीचे के ऊतकों से गुजरने में असमर्थ क्यों होगा।

इस प्रोटोकॉल के विकास के साथ, एचटी और टीएलडी के साथ उपचार के लिए ओस्टियोसारकोमा और मायक्सोफिब्रोसारकोमा जैसे अन्य बाल चिकित्सा ठोस ट्यूमर का परीक्षण करने के लिए मॉडल सिस्टम का विस्तार करने के लिए आगे के अध्ययन की योजना बनाई गई है। यह आशाजनक है क्योंकि इन रोगियों को इस नैदानिक संदर्भ में सीमित उपचार विकल्पों के साथ दुर्बल दर्द का सामना करना पड़ सकता है। इस प्रोटोकॉल को छोरों में स्थित अन्य ठोस ट्यूमर प्रकारों तक बढ़ाया जा सकता है जो एमआरजीएचआईएफयू29,30 के साथ लक्षित हैं। निष्कर्ष में, डेटा इस बात का समर्थन करता है कि थर्मोसेंसिटिव लिपोसोम के संयोजन को कीमोथेरेपी या दवाओं के अन्य रूपों को समाहित करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है जहां लक्षित दवा वितरण फायदेमंद होगा और हीटिंग का एक गैर-आक्रामक रूप, जैसे कि एमआरजीएचआईएफयू, आदर्श होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई वित्तीय हित या हितों का टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इस परियोजना के लिए धन के हमारे स्रोतों और इसमें शामिल कर्मियों को स्वीकार करना चाहते हैं: सी 17 रिसर्च ग्रांट, कनाडा ग्रेजुएट स्कॉलरशिप, ओंटारियो स्टूडेंट ऑपर्च्युनिटी ट्रस्ट फंड, और जेम्स जे हैमंड फंड।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5mL Eppendorf tubes Eppendorf 22363204
1kb plus DNA Ladder Froggabio DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix) Wisent 801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec Bruker T184931 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler Biorad 1851148
Clippers Whal Peanut 8655
Compressed ultrasound gel Aquaflex HF54-004
Convection heating device 3M Bair Hugger 70200791401
Depiliatory cream Nair 61700222611 Shopper's Drug Mart
DMEM Wisent 219-065-LK
DNeasy extraction kit Qiagen  69504
DPBS Wisent 311-420-CL
Drug injection system Harvard Apparatus PY2 70-2131 PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant Optixcare 50-218-8442
F10 Media Wisent 318-050-CL
FBS Wisent 081-105
Froggarose FroggaBio A87
Gel Molecular Imager BioRad GelDocXR
Glutamax Wisent 609-065-EL
Heat Lamp Morganville Scientific HL0100  Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) SAI infusion PE-20-100
Isoflurane Sigma 792632
M25FV24C Cell line Gladdy Lab N/A
Microliter Syringe Hamilton 01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR Biorad 170-8170
Mouse holder The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine  N/A Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. 
MyRun Machine Cosmo Bio Co Ltd CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-8000-GL
p53 primers Eurofins N/A Custom Primers
PCR tubes Diamed SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin Wisent 450-200-EL
Proteus software  Pichardo lab N/A
Respiratory monitoring system SAII Model 1030 MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS Image Guided Therapy N/A LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8
frequency 2.5 MHz
diameter  25 mm
radius of curvature 20 mm
Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm

Motor: axes 2

Generator:
Number of channels 8
Maximum electrical power/channel Wel 4
Maximum electrical power Wel 32
Bandwidth 0.5 - 5 MHz
Control per channel: Freq., Phase and. amplitude
Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta)
Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min.

Transducer:
Number of elements 8
frequency  2.5 MHz
diameter 25 mm
radius of curvature 20 mm
Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe ThermoFisher Scientific S33102
TAE Wisent 811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" ) Terumo Medical Corp 15253
Thermal probes Rugged Monitoring L201-08
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin Wisent 325-052-EL
Ultrasound Gel Aquasonic PLI 01-08

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 191

Erratum

Formal Correction: Erratum: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model
Posted by JoVE Editors on 02/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model . The Authors section was updated from:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

to:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
James M. Drake1,3,4,10
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

चुंबकीय अनुनाद-निर्देशित उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड उत्पन्न हाइपरथर्मिया: एक मुराइन रैब्डोमायोसारकोमा मॉडल में एक व्यवहार्य उपचार विधि
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Wunker, C., Piorkowska, K., Keunen,… More

Wunker, C., Piorkowska, K., Keunen, B., Babichev, Y., Wong, S. M., Regenold, M., Dunne, M., Nomikos, J., Siddiqui, M., Pichardo, S., Foltz, W., Waspe, A. C., Gerstle, J. T., Drake, J. M., Gladdy, R. A. Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model. J. Vis. Exp. (191), e64544, doi:10.3791/64544 (2023).

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