Summary
Partiell ischiasnervligering inducerar långvarig kronisk neuropatisk smärta, kännetecknad av överdrivna svar på termiska och mekaniska stimuli. Denna musmodell av neuropatisk smärta används ofta för att studera innovativa terapier för smärtlindring. Denna artikel beskriver i detalj det kirurgiska ingreppet för att förbättra standardisering och reproducerbarhet.
Abstract
Hantering av kronisk smärta är fortfarande utmanande till denna dag, och nuvarande behandlingar är förknippade med negativa effekter, inklusive tolerans och missbruk. Kronisk neuropatisk smärta är resultatet av lesioner eller sjukdomar i det somatosensoriska systemet. För att undersöka potentiella terapier med reducerade biverkningar är djursmärtmodeller guldstandarden i prekliniska studier. Därför är välkarakteriserade och väl beskrivna modeller avgörande för utveckling och validering av innovativa terapier.
Partiell ligering av ischiasnerven (pSNL) är ett förfarande som inducerar kronisk neuropatisk smärta hos möss, kännetecknad av mekanisk och termisk överkänslighet, pågående smärta och förändringar i lemtemperatur, vilket gör denna modell till en utmärkt passform för att studera neuropatisk smärta prekliniskt. pSNL är en fördelaktig modell för att studera neuropatisk smärta eftersom den reproducerar många symtom som observerats hos människor med neuropatisk smärta. Dessutom är det kirurgiska ingreppet relativt snabbt och enkelt att utföra. Ensidig pSNL i en lem möjliggör jämförelse mellan ipsilaterala och kontralaterala tassar, samt utvärdering av central sensibilisering.
För att inducera kronisk neuropatisk överkänslighet används en 9-0 icke-absorberbar nylontråd för att ligera den dorsala tredjedelen av ischiasnerven. Denna artikel beskriver det kirurgiska ingreppet och karakteriserar utvecklingen av kronisk neuropatisk smärta genom flera vanliga beteendetester. Eftersom en uppsjö av innovativa terapier nu undersöks för att behandla kronisk smärta, ger denna artikel viktiga begrepp för standardisering och en korrekt beskrivning av operationer som krävs för att inducera neuropatisk smärta.
Introduction
Kronisk smärta är ett betydande sjukvårdsproblem över hela världen och är ett av de dyraste hälsoproblemen i USA. Kronisk smärta hanteras bättre när både farmakologiska och icke-farmakologiska modaliteter används på ett tvärvetenskapligt sätt1. Hantering av kronisk smärta är utmanande och behandlar i vissa fall inte smärtan tillräckligt2. Därför behövs nya och kompletterande metoder för att förbättra kronisk smärtbehandling, och djurmodeller är avgörande för att undersöka innovativa terapier.
Kronisk neuropatisk smärta är resultatet av lesioner eller sjukdomar i det somatosensoriska systemet, inklusive diabetes, infektioner, nervkompressioner eller autoimmuna sjukdomar3. Neuropatisk smärta bygger både på perifera och centrala sensibiliseringsmekanismer och härrör från en nervskada. Denna smärta kan kännetecknas av både berörings- och termiskt framkallad hyperalgesi och allodyni, pågående smärta och förändringar i temperaturen hos den drabbade extremiteten4. För att bättre förstå mekanismerna och främja nya behandlingar har flera modeller utvecklats hos gnagare för att efterlikna symtomen och orsakerna till neuropatisk smärta5. Till exempel kan neuropatisk smärta induceras med kemoterapeutiska medelinjektioner, spinalnervligering (SNL), kronisk förträngningsskada (CCI) i ischiasnerven, pSNL, sparad nervskada, ischiasnervtranssektion och ischiasnervtrisektion6. I synnerhet reproducerar ligering av ischiasnerven flera egenskaper hos neuropatisk smärta som observerats hos människor, såsom mekanisk och termisk överkänslighet eller temperaturförändringar hos den drabbade extremiteten, som är karakteristiska för komplext regionalt smärtsyndrom (CRPS)7. Således är denna modell väl lämpad för studier av CRPS eller andra nervskador som inducerar kronisk neuropatisk smärta. Modellen utvecklades först av Seltzer 19908 och används ofta i smärtstudier för att undersöka nya smärtstillande föreningar eller utvärdera de kognitiva effekterna av kronisk smärta 9,10,11,12,13. Modellen presenterar hög reproducerbarhet, och partiell ligering bevarar beteendemässiga svar på perifera stimuli6.
Många av de modeller som för närvarande används har brister som inte observerats i pSNL. CCI-modellen har en mycket högre variation av skador mellan varje djur beroende på sammandragarens täthet, och autotomi förändrar bakpotens siffror vilket gör modellen olämplig för beteendeanalys6. SNL-modellen är en mycket mer komplicerad och längre operation som inte bara kräver avancerade tekniska färdigheter utan också medför en hög risk för allvarliga motoriska underskott3. Dessa brister ses inte i pSNL-modellen. Den enkla reproducerbarheten, operationens korta varaktighet och den minskade risken för motoriska underskott som ses postoperativt gör denna modell värdefull för att studera perifer neuropatisk smärta 8,14. Ändå kan själva partiella ligeringsförfarandet ha variation mellan experimenter, vilket resulterar i mindre konsistens i antalet ligerade nervfibrer. Att presentera detaljerna i operationen är därför avgörande för att öka reproducerbarheten bland studierna.
För att inducera kronisk neuropati används en 9-0 icke-absorberbar nylonsutur för att ligera en tredjedel av ischiasnervens bredd. Efter operationen är svaren på termiska och mekaniska stimuli överdrivna, börjar postoperativt dag 1 och varar mer än 50 dagar8. Här utvärderades både termisk och mekanisk känslighet under 28 dagar med hjälp av Hargreaves, värmeplatta och von Frey-filamenttester. Alla beteendeanalyser visade konsistensen av den långvariga överkänsligheten. Denna modell har visat sig ha dosberoende effekter av både morfin och ibuprofen, vilket bekräftar att den är väl lämpad för prekliniska smärtstudier. I synnerhet beskriver den här artikeln instruktionerna för ett unikt handgjort glasverktyg, kallat "nervglaskrok". Detta verktyg används i stället för pincett för att manipulera nerven och förhindra oavsiktlig ytterligare nervskada under operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Arizona och överensstämmer med riktlinjerna för användning av laboratoriedjur från National Institutes of Health (NIH-publikation nr 80-23, 1966). Patogenfria, vuxna C57Bl6 / J-möss (vikt vid testning: 22-28 g) hölls i vanliga vivariummusburar (fem möss per bur) i klimatkontrollerade rum på en 12 timmars ljus / mörk cykel och fick tillgång till mat och vatten ad libitum. Alla beteendeexperiment utfördes av experimenter blinda för behandlingsförhållandena.
1. Referensscenario: mått på mekanisk känslighet
- Vid ankomsten av mössen, låt dem vänja sig vid djuranläggningen i 1 vecka. Vänja sedan djuren vid experimenthantering i ≥7 dagar därefter.
- Vänja mössen vid von Frey-testapparaten i 1 timme före testningen genom att placera dem i genomskinliga plexiglaslådor, på ett trådnät, i samma rum som testrummet - helst med experimentet närvarande i rummet under tillvänjning.
- Fastställa utgångströskeln för tassuttag med hjälp av "upp-och-ned"-metoden med hjälp av von Frey-filament som beskrivs i kompletterande tabell S1, med början från 3,61-filamentet (3,9 mN).
- Mät uttagningsresponsen vid sondering av baktassen i mitten av plantar med en serie kalibrerade fina (von Frey) monofilament. Applicera varje filament vinkelrätt en gång på plantarytan på pSNL ipsilateral baktass på djuren som hålls i upphängda trådnätburar. Utvärdera mekanisk känslighet med hjälp av "upp-och-ner" -metoden15: bestäm uttagströskeln genom att sekventiellt öka eller minska stimulansstyrkan, motsvarande filamentets storlek. Applicera varje filament i följd en gång.
OBS: Försöksledaren måste undvika att stimulera någon av trampdynorna för att uppnå konsekventa resultat mellan djuren. - Till exempel, om djuret inte svarar på 3,61-filamentet, använd det tjockare 4,08-filamentet (9,8 mN) (ett svar noteras visuellt som uttag, skaka eller slicka av den drabbade tassen); Om djuret svarade första gången, använd den tunnare 3,22 (1,6 mN) glödtråden. Fortsätt att använda antingen minskande eller allt tjockare trådar beroende på om djuret hade positiva respektive negativa efterföljande svar. Rapportera negativa och positiva svar i det datablad som presenteras i kompletterande tabell S1. Testa samma tass 4x med olika filament efter det första positiva svaret.
- Mät uttagningsresponsen vid sondering av baktassen i mitten av plantar med en serie kalibrerade fina (von Frey) monofilament. Applicera varje filament vinkelrätt en gång på plantarytan på pSNL ipsilateral baktass på djuren som hålls i upphängda trådnätburar. Utvärdera mekanisk känslighet med hjälp av "upp-och-ner" -metoden15: bestäm uttagströskeln genom att sekventiellt öka eller minska stimulansstyrkan, motsvarande filamentets storlek. Applicera varje filament i följd en gång.
2. Baslinje: mått på värmekänslighet med hjälp av Hargreaves-testet
- Vid ankomsten av mössen, låt dem vänja sig vid djuranläggningen i 1 vecka. Vänja sedan djuren vid experimenthantering i ≥7 dagar därefter.
- Vänja mössen vid Hargreaves testapparat i 1 h före testningen genom att placera dem i klara plexiglaslådor, i samma rum som testrummet - helst med experimentet närvarande i rummet under tillvänjning.
OBS: Hargreaves-testet kräver att djuret står stilla i några sekunder. Med möss är tillvänjning nyckeln till ett framgångsrikt experiment. Således, om mössen förblir mycket aktiva efter 1 timmes tillvänjning, låt dem acklimatisera längre efter behov.- Bestäm latenser för tassuttag enligt beskrivningen av Hargreaves et al.16. Acklimatisera mössen i plexiglashöljen på en klar plexiglasplatta.
- Fokusera en strålningsvärmekälla (högintensiv projektorlampa) på baktassens plantaryta ipsilateral till pSNL. Justera värmekällans intensitet för att få en baslinje för tassuttagets latens på cirka 10 s. Håll sedan intensiteten konstant under resten av experimentet.
- Vänta tills en rörelsedetektor automatiskt stoppar stimulansen och timern när tassen dras tillbaka. Använd en maximal cutoff på 33,5 s för att förhindra vävnadsskada.
OBS: Cut-off bestäms baserat på tidigare experiment och artiklar för att undvika ytterligare hudskador11,17,18. Med den intensitet som används i denna studie är 33,5 cut-off, vilket motsvarar en stimulansintensitet på 30 (50 W) med användning av Hargreaves-apparaten. Det observerade beteendet är ett reflexbeteende, inte ett frivilligt. - Fastställ baslinjens svarstider för tassuttag med hjälp av Hargreaves-apparaten och med sikte på plantarytan på pSNL ipsilateral baktass. Starta termisk stimulering och registrera abstinensfördröjning. För att undvika att påverka temperaturen på värmestimulansen, städa upp urin under försöken.
3. Baslinje: mått på värmekänslighet med hjälp av värmeplattetestet
- Vänja djuren vid provlokalen i 1 h före testningen.
OBS: Eftersom rumstemperatur är viktigt och kan påverka svaren på värmeplatttestet, se till att temperaturen i rummet är konsekvent runt 22 ° C under tillvänjningsperioden och under testperioden. - Ställ in värmeplattan på 52 °C, eftersom denna temperatur har visat sig framkalla ett aversivt termiskt svar19.
- Placera djuret i testkammaren och starta en kronometer.
- Observera för nocifensiva beteenden (dvs tassuttag, slickning, skakning). Eftersom pSNL-operationen påverkar bakbenet, bortse från alla beteenden som observeras i frambenen (särskilt slickning av frambenen).
- Stoppa kronometern så snart nocifensivt beteende observeras.
- Ta bort djuret från kammaren och registrera latensen till detta beteende.
OBS: Ta ut djuren ur kammaren efter högst 30 s för att förhindra vävnadsskada. Dessutom är det viktigt att notera att det observerade beteendet är ett reflexbeteende, inte ett frivilligt. - Rengör testkammaren med 70% etanol mellan djur för att minska beteendepåverkan av lukt. För att undvika att påverka temperaturen på värmestimulansen, rengör apparaten från urin mellan varje testat djur.
- För att bekräfta resultaten, spela in videor av djuren i värmeplattans kammare under testning för granskning efter att djuren har testats.
OBS: Genom att använda videogranskning för att kvantifiera latenser kan experimenten upprepade gånger observera testet och noggrant analysera nocifensiva beteenden som kan ha missats under realtidsobservation.
4. Preoperativ förberedelse
OBS: Se till att rena burar finns tillgängliga för att återställa mössen efter operationen. Rengör det kirurgiska området med 70% etanol, desinficera händerna med 70% etanol, använd sterila handskar, använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) (labbrock, hårnät, skoöverdrag) och öva sterila tekniker under hela operationen.
- Förbered verktygen (kompletterande figur S1) och ytterligare resurser (gasväv) som ska användas vid kirurgi genom att autoklavera dem i förväg.
- Inducera anestesi med flyktigt isofluran och justera efter behov för att upprätthålla ett kirurgiskt plan. Se till att syret har en lämplig flödeshastighet.
- För att säkerställa att djuret bedövas, kläm tårna på en bakpote med pincett för att säkerställa frånvaron av tassreflex och kontrollera hornhinnans blinkreflex innan du applicerar smörjande oftalmisk salva.
OBS: Analgetika kan inte erbjudas i denna studie eftersom de kan förändra smärtvägen avsedd att analyseras eller till och med neutralisera och ogiltigförklara beteendet som mäts i enlighet med smärtforskningsmål20,21,22. - När du väljer vilken sida du ska utföra operationen på (vänster visas här), raka djurets bakben runt lårregionen, sämre mot patella, överlägset mot höften och ovanför lårbenet. Torka 3x med klorhexidin i en riktning med tre separata gasbindor, alternerat med varm steril saltlösning.
OBS: Framöver, se till att varje djur har operationen utförd på samma sida för att upprätthålla konsistens. - För benet genom en slits gjord i ett 10 cm x 10 cm sterilt draperi för att skapa ett sterilt fält runt det valda benet.
5. Kirurgiskt ingrepp
- Använd en fin kirurgisk sax (kompletterande figur S1F) och gör ett litet 2 mm snitt av huden i mitten av lårets laterala del. Skjut saxen under huden i en cirkulär rörelse för att bryta igenom fascian och skapa ett spelrum, förstora snittutrymmet.
- Använd bindningspincett (kompletterande figur S1H) och skapa ett skarpt snitt vertikalt i 90 ° vinkel i lårmusklerna, 1 cm djupt.
- Sätt in den fina lilla saxen (kompletterande figur S1G) i samma snitt, också i 90 ° vinkel, och sprid dem försiktigt för att separera musklerna. Fortsätt att göra detta tills ischiasnerven visualiseras.
- Leta reda på ischiasnerven, som kan verka blank och tunn, som löper parallellt med det vertikala låret, i riktning mot höften till knäet. Ta bort saxen och bindningstången från kroppen innan du fortsätter.
- Använd de extra fina pincetterna (kompletterande figur S1D) och nervglaskroken (kompletterande figur S1E) för att isolera nerven underifrån. Frigör försiktigt nerven från omgivande bindväv på en plats nära lårbenets trochanter, som ligger närmast höften och längst bort från knäet.
- Låt nerven vila på glasstaven och se till att stavens ände hindrar nerven från att rulla av.
- Placera en kirurgisk knut för att binda 1/3 av ischiasnervens bredd med en 9-0 nylonsutur, innan den delas upp i de gemensamma peroneala, tibiala och sura nervgrenarna3.
OBS: Förgreningen sker när ischiasnerven går ner i knäet, bort från höften. Eftersom dessa tre grenar av nerven har tre olika innervationer är det absolut nödvändigt att placera den kirurgiska knuten före förgreningen för att säkerställa samma nervunderskott över alla djuroperationer. - Var noga med att hålla trådarna nära knuten när du drar trådarna tätt, för att inte dra i nerven med överdriven kraft för att undvika att glida nerven från glasstången och undvika ytterligare sträckskador.
- Släpp försiktigt nerven från glasstaven när knuten är klar och stoppa tillbaka den på den ursprungliga platsen på nivån under de separerade musklerna.
- Suturera muskelsnittet med en absorberbar polyglykolisk 5-0 sutur. Separat, sutur huden med en icke-absorberbar polypropen 6-0 sutur.
- Registrera stopptiden för operation och anestesi. Låt musen vakna, ensam i en återhämtningsbur, innan den återförs till en ny ren bur.
OBS: Under hela operationen, nypa djurets tår för att bekräfta adekvat underhåll av anestesi och övervaka andning och kroppslig perfusion (röd, rosa, blek). Om andningen är signifikant reducerad eller djuret verkar blekt, överväga att minska anestesiflödet eller öka syreflödet och ha en spruta fylld med saltlösning redo att injicera subkutant för att rehydrera djuret. Djuret bör alltid ha en värmekälla placerad under den för att bibehålla kroppsvärmen.
6. Skenkirurgi för kontrolldjur
- Följ steg 5.1-5.11 i det kirurgiska ingreppet; Exkludera steg 5.4–5.9.
7. Postkirurgiska beteendetester
OBS: Se till att experimentet är blind för någon behandling. Kronisk neuropatisk smärta kommer att utvecklas över 2 veckor efter operationen, varefter beteendetester kan utföras efter administrering av föreningar av intresse.
- Använd von Frey, Hargreaves eller värmeplattetestet för att utvärdera både termisk och mekanisk överkänslighet och dess potentiella vändning.
- Ta bort alla djur från studien om de uppfyller endpointkriterierna som beskrivs av den institutionella kommittén för djurvård och användning.
- Avliva djuren enligt procedurer som beskrivs av den institutionella djurvårds- och användningskommittén i slutet av beteendetestningen.
8. Analys av data
- von Frey:
- Analysera data med hjälp av den icke-parametriska metoden för Dixon, som beskrivs av Chaplan och kollegor23, och uttrycka data som den genomsnittliga uttagströskeln.
- På huvudsidan för den refererade programvaran (se Materialförteckning) väljer du alla filament som användes för studien (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 och 4.56). I grupppanelen väljer du filamentet som motsvarar den senaste simuleringen. I den tomma rutan rapporterar du positiva (X ) och negativa (o) svar. Skriv ner de tröskelvärden som rapporteras i rutan till vänster om det observerade svarsmönstret.
Anm.: Ett exempel på mönster och kvantifiering presenteras i kompletterande figur S2.
- På huvudsidan för den refererade programvaran (se Materialförteckning) väljer du alla filament som användes för studien (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 och 4.56). I grupppanelen väljer du filamentet som motsvarar den senaste simuleringen. I den tomma rutan rapporterar du positiva (X ) och negativa (o) svar. Skriv ner de tröskelvärden som rapporteras i rutan till vänster om det observerade svarsmönstret.
- Analysera data med hjälp av den icke-parametriska metoden för Dixon, som beskrivs av Chaplan och kollegor23, och uttrycka data som den genomsnittliga uttagströskeln.
- Hargreaver och kokplatta:
- Rapportera svarstiderna i ett kalkylblad för ytterligare statistisk analys.
- Plotta resultaten som medelvärdet av känsligheterna (trösklar eller latenser) som en funktion av tiden.
9. Instruktioner för hur man gör nervglaskroken
OBS: Öva brandsäkerhet under hela denna process. Använd lämpligt skydd, såsom värmebeständiga handskar eller glasögon efter behov.
- Slå på Bunsen-brännaren.
- Håll ena änden av glasstaven (A) mot elden i ena handen. När denna glasstav smälter, använd en annan glasstav (B) i den andra handen för att styra och dra i smältglaset på stång A. Ta bort glasstång A från elden och låt änden av den smälta delen naturligt rulla inåt för att bilda en liten kulform. Använd glasstaven B för att styra denna form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kronisk neuropatisk smärta inducerades genom partiell ligering av ischiasnerven hos C57Bl6/J hanmöss (figur 1A). Mekanisk känslighet utvärderades med hjälp av von Frey-filament och "upp-och-ner" -metoden. Värmekänsligheten för värme utvärderades med hjälp av Hargreaves och värmeplatttester. Alla data analyserades med en upprepad tvåvägs ANOVA med Geisser-Greenhouse-korrigering, för att jämföra effekten av pSNL-kirurgi på skendjur över tid eller effekterna av olika doser morfin och ibuprofen.
Möss som genomgick pSNL-kirurgi visade lägre trösklar för mekaniska stimuli jämfört med skendjur under 28 dagar (figur 1B). Liknande resultat erhölls med termisk överkänslighetsutvärdering; Tassuttagets latenser efter exponering för strålningsvärmestimulans ökade hos pSNL-djur (figur 1C), liksom uttagsfördröjningarna när djuren placerades på en 52 °C-platta (figur 1D).
Efter etableringen av kronisk neuropatisk smärta, 14 dagar efter operationen, utvärderade vi de antinociceptiva effekterna av olika doser morfin eller ibuprofen. Möss injicerades intraperitonealt med antingen saltlösning eller två olika doser morfin (1 och 5 mg/kg). Båda morfininjicerade grupperna uppvisade en reversering av pSNL-inducerad överkänslighet, som varade från 1 (1 mg/kg) till 2 timmar (5 mg/kg) (figur 2A). Mekanisk överkänslighet återgick till baslinjen 4 timmar efter injektion av morfin. När två olika doser av ibuprofen (10 och 30 mg/kg) administrerades intraperitonealt till mössen visade resultaten minskad mekanisk överkänslighet jämfört med saltlösningsinjicerade möss (figur 2B). De antinociceptiva effekterna av ibuprofen varade upp till 2 timmar. Sammantaget visade resultaten att pSNL-kirurgi inducerar långvarig kronisk neuropatisk smärta. Dessutom kunde vi visa att denna modell är känslig för olika doser av smärtstillande medel.
Figur 1: Långvarig termisk och mekanisk överkänslighet hos möss på grund av partiell ligering av ischiasnerven. Värmekänslighet för värme (Hargreaves och värmeplatttest) och mekanisk känslighet för von Frey-filament bedömdes för att undersöka induktion och persistens av överkänslighet i en modell av kronisk neuropatisk smärta (pSNL). Baslinjevärden mättes före ligering av ischiasnerven och överkänslighet utvärderades under 28 dagar efter operationen. (A) Illustrationen representerar partiell ligering av ischiasnerven. (B) Mekaniska utsättningströsklar jämfördes mellan skenmöss och pSNL-möss vid varje tidpunkt. Upprepade åtgärder tvåvägs ANOVA med Geisser-Greenhouse-korrigering avslöjade en signifikant effekt av pSNL (F (1, 10) = 222,3, p < 0,0001, n = 5-7 per tillstånd). Sidaks multipla jämförelsetest visade en signifikant ökning av överkänslighet mellan dag 1 och 28 (p < 0,05). (C) Termiska uttagslatenser, uppmätta med Hargreaves-testet, jämfördes mellan skam- och pSNL-möss. Upprepade åtgärder tvåvägs ANOVA med Geisser-Greenhouse-korrigering avslöjade en signifikant effekt av pSNL (F (1 , 8) = 113,8; p < 0,0001, n = 4-6 per tillstånd). Sidaks multipla jämförelsetest visade en signifikant ökning av överkänslighet vid dag 2 och 14 (p < 0,05). (D) Termiska uttagslatens, mätt med värmeplatttestet, jämfördes mellan skenmöss och pSNL-möss. Vanlig tvåvägs ANOVA avslöjade en signifikant effekt av pSNL (F (1, 32) = 19, 10, p = 0, 0001, n = 4-6 per tillstånd). Sidaks multipla jämförelsetest visade en signifikant ökad känslighet för värme vid 4 veckor efter pSNL-operation (p = 0,0026). Data presenteras som medelvärde ± S.E.M. Förkortningar: pSNL = partiell ligering av ischiasnerven; BL = baslinje. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Dosberoende reversering av pSNL-inducerad mekanisk överkänslighet genom intraperitoneal injektion av morfin eller ibuprofen. Mekanisk överkänslighet (med användning av von Frey-filament) utvärderades för att undersöka de potentiella antinociceptiva effekterna av morfin eller ibuprofen i en musmodell av pSNL. Baslinjevärden (pre-pSNL) förvärvades före ischiasnervligering. Efter etablering av kronisk neuropatisk smärta baseline på dag 14 djur en andra gång för att säkerställa pSNL-inducerad överkänslighet (post-pSNL). Därefter injicerades två doser av antingen morfin (1/5 mg/kg) eller ibuprofen (10/30 mg/kg) intraperitonealt. Potentiell reversering av mekanisk överkänslighet bedömdes under 4 timmar efter injektioner. (A) Mekaniska utsättningströsklar jämfördes mellan saltlösningstillståndet och de två doserna morfin. Upprepade åtgärder tvåvägs ANOVA med Geisser-Greenhouse-korrigering visade en signifikant effekt på 1 mg/kg morfin (F(1, 11) = 11,16, p = 0,0066, n = 6-7 per tillstånd) och en signifikant effekt på 5 mg/kg morfin (F(1, 10) = 21,78, p = 0,0009, n = 6 per tillstånd). Sidaks multipla jämförelsetest visade en signifikant minskning av mekanisk överkänslighet 1 timme efter injektion för båda doserna, men endast en signifikant effekt för tillståndet 5 mg/kg vid 2 timmar (*p < 0,05). (B) Mekaniska utsättningströsklar jämfördes mellan saltlösningstillståndet och de två doserna av ibuprofen. Upprepade åtgärder tvåvägs ANOVA med Geisser-Greenhouse-korrigering visade en signifikant effekt på 10 mg / kg iburofen (F (1, 11) = 7,788, p = 0,0176, n = 6-7 per tillstånd) och en signifikant effekt på 30 mg / kg ibuprofen (F (1, 10) = 18,79, p = 0,0015, n = 6 per tillstånd). Sidaks multipla jämförelsetest visade en signifikant minskning av mekanisk överkänslighet 1 och 2 timmar efter injektion för båda doserna (*p < 0,05). Data presenteras som medelvärde ± S.E.M. Förkortningar: pSNL = partiell ligering av ischiasnerven; IP = intraperitoneal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Kirurgiska verktyg. De två bilderna illustrerar de olika verktyg som användes för operationen. a) Fin Castroviejo nålhållare. b) Castroviejo nålhållare. c) Mikro Adson-pincett. d) extra fina Graefe-pincetter, E) Nervglaskrok. (F) fin sax (11,5 cm); g) fin sax (9 cm); h) Bindning av pincett. (I) irispincett. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Representativt mönster för tassuttagets respons mätt med von Frey-filamenttestet. För denna studie svarade musen inte på de tre första stimuleringarna utan drog tillbaka sin tass vid den fjärde stimuleringen med 4.56-filamentet. Efter positiv respons (x) användes en tunnare glödtråd (4.31), följd av filament av mindre storlek tills musen inte svarade på en annan glödtråd (i detta fall 4.08). Experimentet måste minska filamentens storlek, en efter en, tills en frånvaro av svar (o). Efter frånvaro av respons använde experimentören ett tjockare filament tills de fick ett positivt svar och minskade sin storlek efter det positiva svaret (erhållet här med 4,31-filamentet). Fyra stimuli genomfördes efter det första positiva svaret; Det kronologiska mönstret för varje stimulering kommenteras med siffror i rött i panel A. I detta fall användes aldrig filament 2,44 till 3,22 eftersom djuret inte visade ett positivt svar med 3,61-filamentet. (B) Svarsmönstret fylldes sedan i i Allodynia-programvaran, rapporterades i samma ordning som filamenten applicerades (000xx0x0), i rutan markerad med vitt. Det resulterande tröskelvärdet beräknades sedan av programvaran (2,60839). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S1: Datainsamlingsblad för von Frey-testning. Denna tabell gör det möjligt för experimenter att fylla i svarsmönster när man använder von Frey-filament. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronisk smärtbehandling kräver ofta långvarig medicinering, vilket gör smärtlindring utmanande. Prekliniska modeller är därför ett viktigt verktyg för att utvärdera de potentiella fördelarna med innovativa terapier som bygger på farmakologiska eller icke-farmakologiska metoder. De många modellerna av kronisk neuropatisk smärta medför utmaningar på grund av ökad variation i kirurgiska tekniker bland olika forskare, vilket leder till minskad reproducerbarhet. Således är det viktigt att karakterisera de potentiella antinociceptiva effekterna av nya terapier i flera modeller som är väl karakteriserade och standardiserade.
Denna rapport visar att partiell ligering av ischiasnerven resulterar i utveckling av långvarig kronisk neuropatisk smärta hos möss med relativt billiga metoder. pSNL överdriver svaren på termiska och mekaniska stimuli, och modellen svarar på administrering av vanliga analgetika på ett dosberoende sätt. Därför verkar pSNL-modellen vara en bekväm och känslig modell för att utvärdera de potentiella fördelarna med nya läkemedel. De primära egenskaperna hos neuropatisk smärta är hyperalgesi och allodyni. Denna rapport visar hur mekanisk allodyni och termisk hyperalgesi påverkas. Mekanisk hyperalgesi mättes dock inte. Det finns ett stort grått område av överlappning mellan allodyni och hyperalgesi. Båda känslorna faller under paraplyet av allmän överkänslighet mot en sensorisk stimulans24. Således kan den stimulerade känslan uppfattas som en annan känsla, såsom värme som kall smärta eller beröring som känslan av brännande. Därför är hyperalgesi och allodyni ofta svåra att skilja, särskilt i djursmärtmodeller.
pSNL-modellen har använts i flera kroniska smärtstudier för att utvärdera effekten av smärtstillande föreningar, de underliggande mekanismerna för kronisk smärta eller till och med den kognitiva effekten av långvarig neuropatisk smärta. Persistensen av mekanisk överkänslighet upp till 70 dagar möjliggör studier av långsiktiga effekter av nya läkemedel25. Det är viktigt att den optimala perioden för beteendetestning omfattar den första, andra och tredje veckan efter operationen, när kronisk smärta har etablerats 8,11,26,27. För att utvärdera styrkan och effekten av ett läkemedel eller en icke-farmakologisk terapi bör positiva kontrollbehandlingar såsom morfin eller ibuprofen övervägas, beroende på experimentell design. Till skillnad från svanssnärttestet applicerar värmeplatttestet en stimulans på tassen som integrerar supraspinala vägar19. Platttestet har använts i stor utsträckning för att karakterisera läkemedelsantinociceptiva egenskaper i modeller av kronisk neuropatisk smärta i nyligen genomförda studier 19,28,29,30,31,32,33.
Denna modell användes för att karakterisera nya icke-opioida behandlingar och identifiera en ny smärtväg som involverar neurotensinreceptor typ 211,13. Det användes också för att demonstrera involveringen av glycinerga moduleringar vid kronisk smärta12 och utvecklingen av nya terapier och vägar vid skärningspunkten mellan sömn och smärta10. Ändå har inga artiklar hittills presenterat en detaljerad förklaring av operationen kompletterad med en beskrivande video.
En vanlig kritik av pSNL och liknande modeller är tillförlitligheten av konsistensen av graden av skada orsakad av neuropatisk nervskada bland djur6. Den här artikeln beskriver en procedur för att manuellt smälta och forma en glasstav för att skapa en speciell nervglaskrok för att lösa problemet. De flesta djuroperationer använder pincett för att plocka upp fina nerver eller kärl. Nervglaskrokverktyget möjliggör en säkrare, mindre skadebenägen metod för att hantera nerven. Även om syftet med denna modell är att skapa nervskada, är det klokt att undvika ytterligare skador på nerven än den som orsakas av suturen placerad genom en tredjedel av ischiasnervens bredd. Nervglaskroken är en slät, icke-skadlig yta för nerven att vila på; Dessutom möjliggör kulan / kroken i slutet enkel upptagning och stabilisering. Vid suturering av nerven rekommenderar dessutom den ovan beskrivna tekniken (protokollavsnitt not 5.7) att hålla trådarna djupt inne i kroppshålan, närmast där knuten kommer att dyka upp. Detta undviker att dra i slutet av suturerna och främjar att applicera spänning på suturen närmast nerven när du drar åt knuten. Denna teknik förhindrar ytterligare sträckskada om nerven oavsiktligt skulle dras av nervglaskroken, mot utsidan av håligheten i processen att knyta knuten hårdare. En ytterligare fördel är användningen av fin sax för att göra det första snittet. Detta möjliggör ett mycket mindre snittställe och därmed snabbare läkning, i motsats till de större snitt som görs med skalpellblad.
Metoderna som rapporteras i den här artikeln har också vissa begränsningar. Utvecklingen av kronisk smärta i pSNL-modellen påverkas av djurens kön34. Därför är det viktigt att forskningsstudier inkluderar båda könen i sin analys. Syftet med denna rapport var att fokusera på ett kirurgiskt ingrepp och karakteriserade inte sexuell dimorfism i smärtmodellen. Det är värt att nämna att mätningar av värmekänslighet hos möss med Hargreaves-testet är utmanande; Djur måste stå stilla i ett litet hölje i några sekunder medan stimulansen appliceras. Således är vana mössen till plexiglashöljet en nyckelfaktor för att uppnå framgångsrika resultat. Mätning av framkallad smärta kräver också noggrann experimentutbildning. Både framkallade och spontana beteendetester rekommenderas för att utvärdera den termiska och mekaniska känsligheten, liksom lemmens funktionalitet. Dessutom, i denna studie, morfin och ibuprofen användes som positiva kontroller för antinociceptiv effekt. Dessa två läkemedel valdes eftersom de ofta används som positiva kontroller i flera smärtmodeller och möjliggör en bättre jämförelse mellan de olika modellerna. Det är dock viktigt att nämna att pregabalin och gabapentin ofta ordineras för att behandla neuropatisk smärta, och studier som fokuserar på neuropatisk smärtlindring bör inkludera dessa läkemedel som positiva kontroller.
Denna rapport beskriver med precision en operation som vanligtvis används för studier av kronisk neuropatisk smärta. Att låta forskare och praktikanter dra nytta av en visuell beskrivning av denna musmodell kommer att underlätta utvecklingen av forskningsprojekt som fokuserar på att förstå mekanismerna för kronisk smärta eller syftar till karakterisering av innovativa terapier. Dessutom är användningen av flera smärtmodeller avgörande för att förbättra reproducerbarheten, och denna rapport kommer att underlätta implementeringen av pSNL-modellen i nya laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att rapportera. Ingen av författarna till manuskriptet fick någon ersättning eller någon ersättning eller honorarium på något annat sätt. Författarna är inte anslutna till någon leverantör eller läkemedelsföretag i samband med denna studie.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Center for Complementary and Integrative Health [R01AT009716, 2017] (M.M.I.), Comprehensive Chronic Pain and Addiction Center-University of Arizona (M.M.I.) och Medical Scientist Training Program (MSTP) vid University of Arizona, College of Medicine, Tucson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5/0, FS-2, 30" Undyed PGA Braided Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Suture | CP Medical | 421A | https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/ |
| 6/0, P-1, 18" Blue Polypropylene Monofilament Non-Absorbable Suture | CP Medical | 8697P | https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/ |
| 9/0 (0.3 metric) Nylon Black Monofilament Suture | Crestpoint Ophthalmics | MANI 1407 | https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html |
| Allodynia Software | National Instruments, LabView 2015 | Quantification of mean withdrawal thresholds (Von Frey data) | |
| C57Bl6/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| Castroviejo needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14 |
| Cold Hot Plate Test | Bioseb | BIO-CHP | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html |
| Elevated metal mesh stand for Von Frey | Bioseb | BIO-STD2-EVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html |
| Extra fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110 |
| Fine Castroviejo needle holder | Simovision/Geuder | 17565 | https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf |
| Fine scissors (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14558-11 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11 |
| Fine scissors (9 cm) | Fine Science Tools | 14558-09 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09 |
| Iris forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07 |
| Micro Adson forceps | Fine Science Tools | 392487 | https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps |
| Modular holder cages for rats and mice | Bioseb | BIO-PVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html |
| Moretti/Effetre #240 Light Cobalt Blue glass rods 4 mm | Ebay | N/A | https://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS w9CtfnIVJ&amdata=enc %3AAQAHAAAAwCoqvgWRo NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL k81J1AFu%2Fkcbsk6pxYtJi6 digE5TL9SzlgMzYUMNDr%2B dku2%2B%2FEvB1qXqFmebE 020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0 9xfWYvIzBYQYh6FRWyUJngC uuA9Bkjb9lxtZoYlg5y6PyFR2P 34xFk5xaNC5ib65M1%2Fr%2F 4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0 AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx 4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q %3D%3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6- 6LfYA |
| Plantar Test for Thermal Stimulation - Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37570 | https://ugobasile.com/products/categories/pain-and-inflammation/plantar-test-for-thermal-stimulation |
| Touch-Test Sensory Evaluators, Set of 20 Monofilaments | North Coast Medical | NC12775-99 | https://www.ncmedical.com/products/touch-test-sensory-evaluators_1278.html |
| Tying forceps | Duckworth & Kent | 2-504ER8 | https://duckworth-and-kent.com/product/tying-forceps-9/ |
References
- Hassett, A. L., Gevirtz, R. N. Nonpharmacologic treatment for fibromyalgia: patient education, cognitive-behavioral therapy, relaxation techniques, and complementary and alternative medicine. Rheumatic Disease Clinics of North America. 35 (2), 393-407 (2009).
- Hylands-White, N., Duarte, R. V., Raphael, J. H. An overview of treatment approaches for chronic pain management. Rheumatology International. 37 (1), 29-42 (2017).
- Campbell, J. N., Meyer, R. A.
- Colloca, L., et al.
- Colleoni, M., Sacerdote, P. Murine models of human neuropathic pain. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (10), 924-933 (2010).
- Challa, S. R. Surgical animal models of neuropathic pain: Pros and cons. International Journal of Neuroscience. 125 (3), 170-174 (2015).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43 (2), 205-218 (1990).
- Hasnie, F. S., Wallace, V. C., Hefner, K., Holmes, A., Rice, A. S. Mechanical and cold hypersensitivity in nerve-injured C57BL/6J mice is not associated with fear-avoidance-and depression-related behaviour. British Journal of Anaesthia. 98 (6), 816-822 (2007).
- Ito, H., et al. Suvorexant and mirtazapine improve chronic pain-related changes in parameters of sleep and voluntary physical performance in mice with sciatic nerve ligation. PLoS One. 17 (2), 0264386 (2022).
- Martin, L., et al. Conotoxin contulakin-G engages a neurotensin receptor 2/R-type calcium channel (Cav2.3) pathway to mediate spinal antinociception. Pain. 163 (9), 1751-1762 (2021).
- Peiser-Oliver, J. M., et al. Glycinergic modulation of pain in behavioral animal models. Frontiers in Pharmacology. 13, 860903 (2022).
- Ramiro, I. B. L., et al. Somatostatin venom analogs evolved by fish-hunting cone snails: From prey capture behavior to identifying drug leads. Science Advances. 8 (12), (2022).
- Chung, J. M. Encyclopedia of Pain. Schmidt, R. F., Willis, W. D. , Springer. Berlin Heidelberg. 1299-1300 (2007).
- Zahn, P. K., Brennan, T. J. Primary and secondary hyperalgesia in a rat model for human postoperative pain. Anesthesiology. 90 (3), 863-872 (1999).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Yeomans, D. C., Proudfit, H. K. Characterization of the foot withdrawal response to noxious radiant heat in the rat. Pain. 59 (1), 85-94 (1994).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of thermal pain sensation in rats and mice using the Hargreaves test. Bio-Protocol. 7 (16), 2506 (2017).
- Hook, M. A., et al. The impact of morphine after a spinal cord injury. Behavioural brain research. 179 (2), 281-293 (2007).
- Loram, L. C., et al. Prior exposure to repeated morphine potentiates mechanical allodynia induced by peripheral inflammation and neuropathy. Brain, behavior, and immunity. 26 (8), 1256-1264 (2007).
- Green-Fulgham, S. M., et al. Oxycodone, fentanyl, and morphine amplify established neuropathic pain in male rats. Pain. 160 (11), 2634-2640 (2019).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurology. 13 (9), 924-935 (2014).
- Malmberg, A. B., Gilbert, H., McCabe, R. T., Basbaum, A. I. Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA receptor antagonists conantokins G and T. Pain. 101 (1-2), 109-116 (2003).
- Nakamura, Y., et al. Neuropathic pain in rats with a partial sciatic nerve ligation is alleviated by intravenous injection of monoclonal antibody to high mobility group box-1. PLoS One. 8 (8), 73640 (2013).
- Sherman, K., et al. Heterogeneity in patterns of pain development after nerve injury in rats and the influence of sex. Neurobiology of Pain. 10, 100069 (2021).
- Ba, X., et al. Cinobufacini protects against paclitaxel-induced peripheral neuropathic pain and suppresses TRPV1 up-regulation and spinal astrocyte activation in rats. Biomedicine Pharmacotherapy. 108, 76-84 (2018).
- Hao, Y., et al. Huachansu suppresses TRPV1 up-regulation and spinal astrocyte activation to prevent oxaliplatin-induced peripheral neuropathic pain in rats. Gene. 680, 43-50 (2019).
- Guo, J., et al. Effects of resveratrol in the signaling of neuropathic pain involving P2X3 in the dorsal root ganglion of rats. Acta Neurologica Belgica. 121 (2), 365-372 (2021).
- Ni, W., Zheng, X., Hu, L., Kong, C., Xu, Q. Preventing oxaliplatin-induced neuropathic pain: Using berberine to inhibit the activation of NF-kappaB and release of pro-inflammatory cytokines in dorsal root ganglions in rats. Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (2), 135 (2021).
- Wang, J., et al. Selective activation of metabotropic glutamate receptor 7 blocks paclitaxel-induced acute neuropathic pain and suppresses spinal glial reactivity in rats. Psychopharmacology. 238 (1), 107-119 (2021).
- Sun, C., Wu, G., Zhang, Z., Cao, R., Cui, S. Protein tyrosine phosphatase receptor type D regulates neuropathic pain after nerve injury via the STING-IFN-I pathway. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 859166 (2022).
- Coyle, D. E., Sehlhorst, C. S., Mascari, C. Female rats are more susceptible to the development of neuropathic pain using the partial sciatic nerve ligation (PSNL) model. Neuroscience Letters. 186 (2-3), 135-138 (1995).
