Summary
本文详细介绍了使用胎儿超声心动图、尸检和使用会落共聚焦显微镜 （ECM） 的会射荧光图像捕获 （EFIC） 然后进行三维 （3D） 重建的小鼠先天性心脏病 （CHD） 诊断方法。
Abstract
先天性心脏病（CHD）是美国婴儿死亡的主要原因。在1980年代及更早，大多数中度或重度冠心病患者在成年前死亡，死亡率在出生后第一周最高。手术技术、诊断方法和医疗管理方面的显着进步导致结果的显着改善。为了满足了解先天性心脏缺陷的关键研究需求，小鼠模型提供了一个理想的研究平台，因为它们的心脏解剖结构与人类非常相似，妊娠率短。基因工程与高通量表型工具的结合允许复制和诊断结构性心脏缺陷，以进一步阐明冠心病背后的分子途径。使用无创胎儿超声心动图筛选小鼠模型中的心脏表型，再加上使用具有三维（3D）重建的会射共聚焦显微镜（ECM）组织病理学的高保真会下荧光图像捕获（EFIC），可以详细查看各种先天性心脏缺陷的解剖结构。该协议概述了这些方法的完整工作流程，以获得小鼠先天性心脏缺陷的准确诊断。将这种表型方案应用于模型生物体将允许准确的冠心病诊断，从而深入了解冠心病的机制。确定冠心病的潜在机制为潜在的治疗和干预提供了机会。
Introduction
先天性心脏病（CHDs）是最常见的新生儿出生缺陷1，2，影响约0.8%-1.7%的新生儿，导致显着的新生儿死亡率和发病率3。冠心病4，5 强烈提示遗传病因。转基因小鼠模型已被广泛用于了解冠心病的复杂性以及导致冠心病的机制，因为小鼠在小鼠和人类胎儿中具有四腔心脏和可比的心脏发育DNA序列6。鉴定小鼠突变体的表型是表征靶基因功能的基本第一步。表达基因剂量效应的小鼠模型，其中单个基因突变可导致一系列模仿人类冠心病的心脏缺陷，对于理解冠心病的复杂性和导致它们的机制非常重要。
本文概述了表征小鼠模型中心脏表型的管道。应用的方法利用胎儿超声心动图7，然后是尸检和ECM组织病理学7，8，可以显示发育中的小鼠心脏表型的详细解剖结构。胎儿超声心动图是一种无创方式，允许以合理的成像分辨率直接可视化多个胚胎。此外，胎儿超声心动图可以快速确定一窝胚胎的总数、它们的发育阶段以及子宫角中的相对方向和位置。使用光谱多普勒/彩色血流，可以根据结构、血流动力学紊乱、生长受限或水肿的发展来识别异常胚胎。由于胎儿超声心动图研究是一种非侵入性技术，因此可用于多天扫描并观察血流动力学或心脏形态的变化。获得胎儿超声心动图的高质量成像需要实践和技能，因为由于缺乏经验和知识，可能会错过特定的心脏缺陷。因此，可以通过尸检和ECM组织病理学的组合获得更明确的心脏形态分析。尸检可直接显示弓结构、主动脉和肺动脉的相对关系、心室和心房的大小、心脏相对于胸部的位置以及支气管肺结构。然而，心脏瓣膜和壁厚等内部特征可能难以仅通过尸检进行评估。因此，建议将 ECM 组织病理学检查作为结论性诊断。ECM组织病理学是一种高分辨率可视化技术，允许对图像堆栈9进行2D和3D重建。这些图像是通过石蜡包埋样品的连续落射荧光成像获得的，因为它通过自动切片机以一致的间隔进行薄切。与经典组织学不同，图像在从块中切割之前被捕获为一个部分，以便在同一参考系内捕获所有图像。因此，ECM组织病理学产生的2D图像堆栈可以在三维空间中轻松可靠地重建。这是使用 DICOM 查看器完成的，该查看器允许在三个解剖平面（冠状面、矢状面和横向）中对图像进行 3D 可视化。通过这些高分辨率的3D重建，可以做出明确的心脏诊断。这三种不同的可视化模式的应用，无论是单独还是组合，都可以准确表征小鼠胚胎中的结构性心脏缺陷。
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Protocol
使用小鼠进行这些研究是必要的，因为小鼠具有可以模仿人类冠心病的四腔心脏。 小鼠被提供兽医护理，并饲养在该机构的实验动物护理评估和认证协会（AAALAC）认可的动物护理设施中。遵循严格的方案，以尽量减少小鼠的不适，压力，疼痛和伤害。使用CO2 气体对小鼠实施安乐死，根据美国兽医协会安乐死指南，小型啮齿动物可以接受。本手稿中对小鼠的研究是在匹兹堡大学批准的IACUC协议下进行的。
1.胎儿超声心动图
注意：超声心动图是识别小鼠心血管畸形和心外缺陷的有力工具。由于小鼠胚胎体积小（妊娠中期约1-2毫米，出生时约3.5毫米），因此需要具有超声生物显微镜（UBM）的超高频超声心动图设备。UBM提供不同的高频（30-50 MHz）探头，具有小成像窗口（15 mm x 14 mm），可提供分辨率（30 μm轴向x 68 μm横向），一次可视化一个小鼠胎儿。40 MHz 换能器提供高分辨率图像以识别心血管表型7。
- 打开超声心动图机并选择程序心脏病 学。
注意：以下协议可用于胚胎日（E）14.5至19.5的任何小鼠背景。 - 在麻醉诱导室中麻醉所需的小鼠。使用浓度为4%异氟醚和医用氧气以1L / min的流速诱导麻醉，并将其降低至2%-3%以进行维持。
- 快速将鼠标放在成像平台上。成像平台具有加热钢，可在手术过程中保持鼠标温暖。将小鼠的嘴和鼻子放入麻醉鼻锥中。用胶带固定四肢以避免移动。监测心率以确保其保持在 400-450 次/分之间。
- 使用直肠温度计探头监测温度，并确保其保持在 37 °C ± 0.5 °C。 监测呼吸以避免缺氧。对探头保持温和的力以防止伤害。
注意：可以在鼠标上方设置加热灯，以防止在鼠标下方体温过低并从麻醉中恢复。凡士林眼用软膏可用作润滑剂，避免眼睛干涩。 - 使用脱毛膏去除胸部和腹部的皮毛。涂抹乳霜并等待 3 分钟后卸除。用70%乙醇清洁该区域。乙醇作为剃须润滑剂比水更有效。
- 将超声凝胶预热至正常体温。大量涂抹超声凝胶并将换能器放在腹部，使其在水平面上定向并在屏幕上识别膀胱。一旦确定膀胱，从膀胱进行颅骨扫描并寻找胎儿。测量冠到臀部的长度以确定胎龄10 （图 1和 表1）。
注意：更改换能器位置以可视化不同的平面，包括横向四腔、矢状和额/冠状成像平面7 （图 1）。 - 使用彩色多普勒分析心脏血流。
- 如果胚胎没有达到预定阶段，请将小鼠放回笼子中。否则，准备收获鼠标。
注意：在将其放回笼子之前，请确保鼠标已经唤醒并从麻醉中恢复良好。 - 关闭异氟醚和氧气，清洁工作区域，然后关闭机器。
注意：从换能器上取下凝胶很重要。
2. 尸检
注意：一旦使用胎儿超声心动图怀疑异常的心脏表型，则通过全身浸没在固定溶液中 收集 胎儿并固定：10%缓冲福尔马林磷酸盐或4%多聚甲醛（PFA）。检查样品的外部和内部形态，寻找宏观解剖异常或畸形。
- 准备鼠标。
- 如果小鼠是成年人，请使用标准CO2 协议对小鼠实施安乐死。使用镊子或解剖剪刀在侧胸和腹部切开切口（约 3 厘米），以使固定剂渗透到内脏器官中。
注意：如果胚胎年龄超过E24.5，则样品应在尸检前固定至少24小时。
- 如果小鼠是成年人，请使用标准CO2 协议对小鼠实施安乐死。使用镊子或解剖剪刀在侧胸和腹部切开切口（约 3 厘米），以使固定剂渗透到内脏器官中。
- 分析身体的外观。
- 设置软件以保存带有名称的图片，包括样品的标识，显微镜放大倍率和图片的内容。
注意：1.0倍至3.2倍的放大倍率应该足以对E14.5或更老小鼠的大多数结构进行成像。 - 将鼠标放在体视显微镜镜头下方的平板上。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）填充板以完全覆盖样品，以防止图片中的脱水和反射。调整放大倍率，使屏幕包括整个胚胎，然后拍摄胚胎左右两侧的照片。
注意：板的底部应涂有石蜡，硅或其他此类基板，以方便固定。 - 将样品穿过喉咙，面朝上，然后拍摄另一张照片。
注意：将销略微向上定向，以确保胸腔的重要结构没有被刺穿。
- 设置软件以保存带有名称的图片，包括样品的标识，显微镜放大倍率和图片的内容。
- 分析胸部。
- 用镊子提起颈部中间的皮肤时，用剪刀将皮肤切向两个腋窝，然后沿着中轴向尾部切割皮肤。然后，从脐部到腿部切开皮肤。将样品固定在手腕和脚踝上。
注意：小心只切开皮肤。建议水平或向上倾斜握住剪刀的刀片。 - 要破坏结缔组织，请用一对镊子提起皮肤，同时用另一对镊子将下面的组织固定到位。将样品固定在皮肤上，以帮助暴露胸部和腹部（图2）。
注意：固定、切割或刮擦时拉伸过多可能会导致组织损伤。 - 拍摄裸露的肌肉的照片，然后轻轻刮掉肌肉以露出肋骨。
- 拍摄裸露的肋骨的照片。将肋骨与隔膜分开，并在朝向颈部的侧轴上尽可能切开两侧的肋骨。
- 通过去除切开的肋骨来暴露心脏。拍一张心脏的照片。
- 用一对镊子将其剥开，取出胸腺。使用另一对镊子稳定胸腺的底部，以避免撕裂任何下层血管。拍摄心脏和大血管的照片。
注意：使用引脚拉伸一些相邻结构可能有助于获得更好的成像视图。此外，拍摄单独的照片，聚焦于大动脉、心脏和其他感兴趣的结构，因为它们可能没有聚焦在一起。
- 用镊子提起颈部中间的皮肤时，用剪刀将皮肤切向两个腋窝，然后沿着中轴向尾部切割皮肤。然后，从脐部到腿部切开皮肤。将样品固定在手腕和脚踝上。
- 分析腹部。
- 拉动横膈膜将其取出并露出肝脏。拍照。
- 将肝脏固定回去，露出胃和胰腺。拍照。
- 切开食道。用镊子将它们拉出，取出结肠和肠道。切开肝脏上方并将其移除以露出肾脏和肾上腺。拍照。
注意：取出的器官应保存在固定溶液中。
- 隔离胸部以进行 ECM 分析。
- 沿着肝脏和肺部之间的直线切下胸部。将头部切得足够高，以免切断颈动脉的分支。
- 轻轻去除侧肋骨，同时保持背肋和脊柱。剥开并刮掉背部脂肪。
- 将胸部与身体其他部位分离，并将其放入10%的福尔马林磷酸盐缓冲溶液中。
3. 嵌入
- 将固定剂倒入适当的危险废物瓶中。用1x PBS洗涤样品15分钟三次。
- 使用浓度增加的乙醇和二甲苯使样品脱水。以下所有步骤的持续时间取决于胚胎的阶段。详情请参阅 表2 。
注意：更换溶液时应小心，以免损坏样品。样品处理的最佳参数可以根据经验进行调整。二甲苯会溶解某些塑料;应使用玻璃仪器和容器。 - 用石蜡代替二甲苯，持续时间长。将瓶子在65°C培养箱中放置适当的时间（表2）。
- 使用新鲜石蜡将样品嵌入所需位置。
注意：建议将样品定向到石蜡块的中间，其背侧朝向块的顶部，后侧朝向块的前部。定向样品时，请记住样品嵌入模块朝下。
4. 会阴共聚焦显微镜 （ECM）
注意：适当包埋后，胚胎 通过ECM 连续进行图像收集以进行组织病理学分析。可以从切片机中回收单个载玻片以进行进一步研究。
- 从-20°C冰箱中取出石蜡块并取出金属模具。
- 使用剃须刀片修剪盒边缘和背面的蜡。切割样品周围的蜡，直到将其包裹在连接到盒上的小方块蜡中。
注意：处理刀片时要格外小心。 - 使用金属杠杆将石蜡块夹在切片机的切片台上。在运行模式下选择MAN（手动）功能，将石蜡表面靠近刀片，然后运行几张幻灯片以确保刀片接触石蜡块。
- 打开 LAS AF 应用程序并选择 矩阵筛选器。选择 “单个正则矩阵 ”并加载以前保存的相应模板。单击 快速 LUT 按钮切换到白色和橙色渐变色。
- 选择 设置作业 并将 405 nm 可见激光拖动到最大。将光谱块的左边缘与 405 nm 线匹配，并将右边缘拖动到 800 nm 线。标记 针孔 选项并启动 实时 视图。
- 调整激光投影的位置，使标本在屏幕上居中，并将 变焦 旋钮调整为 ~20 倍。要优化分辨率，请将增益设置为1，250 V，并使用对焦旋钮最大化蓝色区域;然后，将增益重置为约750 V以进行成像。
注意：具体值可能因胚胎状况而异。 - 将切割方法切换到 自动，将厚度设置为50μm左右，然后运行滑块。当肺部和气道在视野范围内时停止切割。
- 在 8-10 μm 之间选择切割厚度并停止 实时 视图。打开 切片机通讯器 以开始成像。在收集映像之前，请确保临时存储文件夹为空。
- 当没有看到额外的心脏结构时停止切割。关闭 切片机通信器 应用程序，并通过图像处理软件 将 临时文件导出到一个.tiff图像系列中，以便以后进行 3D 重建。
5. 三维（3D）重建
注意：3D重建的目的是将ECM成像中的2D图像堆栈处理成冠状，矢状和横向的3D视频，并使用3D视频诊断样品中的结构和解剖异常。
- 在图像处理软件中打开 ECM 图像堆栈。
- 将图像文件拖放到图像处理软件中。通过选择“ 图像>变换”>“水平翻转 ”来水平翻转 ECM 图像。
- 保存翻转的图像并关闭图像处理软件。
- 在DICOM查看软件中导入ECM图像堆栈。
- 将水平翻转的 ECM 图像拖放到 DICOM 查看软件中。确保示例列表周围有浅蓝色边框，否则图像可能已添加到现有示例文件夹。
- 在弹出窗口出现时选择要复制到数据库中的链接或文件。新示例将出现在示例列表中，其名称与复制到 DICOM 查看软件中的文件相同。
- 单击新添加的文件将其打开。
- 执行 3D 重建。
- 打开文件后，单击工具栏中的 “2D/3D 重建工具” 菜单，然后选择“ 3D MPR”。
- 对于 像素 X 分辨率和 像素 Y 分辨率，通过给出 ECM 成像期间使用的缩放来输入图像分辨率。对于 切片间隔，输入用于在 ECM 成像期间切割的切片厚度。
注意：相机分辨率根据相机的变焦而变化，并且可能因相机而异。
- 使用左侧“工具”选项卡中的不同 工具 根据需要调整图像堆栈。
- 使用 WW/WL 工具调整窗口 宽度 和 窗口级别。向上单击并拖动图像上的工具可降低图像亮度，向下拖动可增加图像亮度。单击并向右拖动图像上的工具可降低图像对比度，向左拖动可增加图像对比度。
注意：一种结构的最佳 WW/WL 设置对于另一种结构可能不是最佳的。因此，建议创建单独的视频来查看不同的结构。 - 使用平移工具将图像拖动到所需位置。使用缩放工具根据需要放大或缩小图像，使用旋转工具根据需要旋转图像。
注：放大图像可能会导致图像质量下降。旋转图像时要小心，因为这样做可能会导致轴翻转。
- 使用 WW/WL 工具调整窗口 宽度 和 窗口级别。向上单击并拖动图像上的工具可降低图像亮度，向下拖动可增加图像亮度。单击并向右拖动图像上的工具可降低图像对比度，向左拖动可增加图像对比度。
- 单击并拖动第一个面板的彩色轴。请注意旋转此轴如何更改其他两个面板的方向。旋转三个面板的轴，直到三个面板代表样品的冠状视图、矢状面和横向视图。
注意：重新定向样品时，保持正确的前/后方向。 - 生成视频。
- 一旦所有三个面板都正确定位、定向和变亮，单击代表日冕视图的面板。
- 点击 电影导出 在菜单栏的右侧。单击 批处理 并拖动 “从” 和 “到 ”滑块以包含整个感兴趣区域。对于 间隔，选择与 厚度相同 选项。保存指示视图方向的视频。
- 查看视频，看看是否可以充分识别感兴趣的结构。如果没有，请使用工具（步骤5.4）根据需要重新调整视频并重新保存视频。
- 对横向和矢状视图重复步骤 5.6。使用重建的视频诊断样本。
注意：仔细观看每个方向的视频，以全面评估样本是否表现出任何解剖异常或疾病表型（图3）。
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Representative Results
具有显着血流动力学缺陷的小鼠胚胎被注意到是胚胎致命的。使用不同的视图，通过高输出、无创胎儿超声心动图可以识别多种冠心病（图1）。
间隔缺损：最常见的冠心病是室间隔缺损，例如室间隔缺损 （VSD）、房室间隔缺损 （AVSD） 和房间隔缺损 （ASD）1。VSD或AVSD可以使用2D图像和彩色流图像轻松可视化。通过心室或心房和心室之间的血流可以很容易地识别（图3）。ASD很难与胎儿卵圆孔未闭区分开来。
流出道异常： 如图 3所示，主肺动脉中的血流穿过正常胚胎的升主动脉血流。在具有右心室双出口（DORV）的胚胎中，可以看到两条大动脉都起源于右心室。DORV也与VSD相关（图3D），可以使用颜色流进行识别。然而，鉴于胚胎体积小，DORV 有时无法可靠地与主动脉覆盖、肺闭锁或持续性永存动脉干 （PTA） 区分开来。在PTA中，胎儿超声心动图中只能看到一个流出道流（图3E）。详细的弓结构和主肺动脉可以通过尸检观察到（图2E，F）。
尸检可以快速诊断胸部和腹部的坐位状态以及相对于胸部的心脏位置（左心动过速（图 2C-E）或右旋心动过速）。流出道结构以及心房和心室的相对大小可以很容易地看到（图2E，F）。
ECM 组织病理学是评估任何结构性心脏异常的金标准技术8，11，12。它为胚胎结构提供了无与伦比的分辨率和细节。使用不同平面和视图的三维重建可以很容易地识别大动脉和心室之间的关系（图3）以及心室和心房之间的缺陷。
图 1：在胚胎的 2D 超声心动图图像中测量冠臀长度以确定胎龄的位置。 胚胎的2D超声心动图图像在（A）E11.5，（B）E12.5，（C，D）E13.5-E14.5。（D）患病胚胎小于其（C）兄弟姐妹，并且注意到具有带有水肿（箭头）的“糊状”外观。（A-C）活胚胎表现出不同的器官。具有代表性的 VB 模式，具有 E14.5 心脏的彩色图像，冠状 4 腔室视图向前倾斜以成像 （E） 流出道，显示完整的室间隔与大动脉的正常关系，这在 （E'） 冠状视图中通过 ECM 得到证实。（F） E14.5 心脏的代表性矢状面视图显示左心室和右心室流出道，升主动脉 （AO） 指向颅骨，肺动脉指向后方（朝向脊柱），这在 （F'） 矢状位视图中通过 ECM 得到证实。（G） 左心室 （LV） 和右心室 （RV） 的代表性横视图，在 （G'） 横视图中通过 ECM 确认。（H） ECM 中心脏底部的横视图显示主动脉瓣 （AV） 和肺动脉瓣 （PV） 明显且分离。PV 位于房室前方。 （H'） 代表性的持续性永存动脉干 （PTA） 横向视图显示左肺动脉和右肺动脉由未分裂的持续性躯干动脉向后起源，左颈动脉从持续性躯干动脉向前和颅部起源。缩写：A：前动脉，AO：主动脉，AV：主动脉瓣，Cd：尾部，Cr：颅骨，DAO：降主动脉，L：左，LA：左心房，LCA：左颈动脉，LPA：左肺动脉，左心室，P：后，PA：肺动脉，PTA：持续性永存动脉干，R：右，RA：右心房，RPA：右肺动脉，RV：右心室。比例尺：0.5毫米。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于观察心血管异常的尸检的代表性图像 。 （A）固定在黑色背景解剖皿上的胚胎，没有明显的表型。该图像显示了头部、手指、胸腔和腹部的大体解剖结构。（B）从幼崽身上取出真皮，露出下颌下腺体，胸腔和腹部。（C）胸腔被抬起，露出胸腔的大体解剖结构，包括胸腺、心脏、肺和膈肌。（D）胸腔被移除后胸部的放大视图。（E）胸腺被切除，露出大血管和气管。（F） 大型船只的放大视图。缩写：AAO：升主动脉，D：膈肌，LA：左心房，LCA：左颈动脉，LSVC：左上腔静脉，左心室：左心室，P：心包，RA：右心房，Rb：肋骨，RCA：右颈动脉，RL：右肺，RSVC：右上腔静脉，RV：右心室，S：胸骨，SCA：右锁骨下动脉，SMG：下颌下腺，T：气管，Th：胸腺。比例尺：1毫米。 请点击此处查看此图的大图。
图3：代表性胎儿超声心动图（Echo）和来自落射共聚焦显微镜（ECM）的图像。 （A） 超声显示完整的室间隔，没有心室间分流，正常对照组相关大动脉正常，经 E14.5-15.5 阶段的 （A'） ECM 证实。（B）房室间隔缺损（AVSD）的超声检测。4腔室视图中的回波成像显示了LA，RA，LV和RV之间的通信，在E14.5阶段由（B'）ECM确认。（C） 伴彩色血流的室间隔缺损 （VSD） 的超声诊断显示左心室和右心室血流，在 E16.5 阶段由 （C'） ECM 确认。（D） 超声和 （D'） ECM 显示 DORV 在 E14.5 阶段左心室和右心室室间隔缺损伴并排大动脉（主动脉正好位于肺动脉）。（E）持续性永存动脉干（PTA）的超声诊断显示左心室和右心室之间的通信，单个流出道覆盖两个心室（PTA）。（E'）ECM在E14.5阶段证实了这种病理。比例尺：0.5 毫米。 AO：主动脉，AVSD：房室间隔缺损，Cd：尾部，Cr：颅骨，L：左，LA：左心房，左心室，PA：肺动脉，PTA：持续性永存动脉干，R：右，RA：右心房，RV：右心室，室间隔缺损。比例尺：0.5毫米。 请点击此处查看此图的大图。
| 阶段 | 冠到臀部长度（毫米） | 胎儿面积（毫米2） | 心脏面积（毫米2） | 心脏区/胎儿区 |
| E12，5 | 7.9 ± 0.8 （n = 77） | 23.2 ± 5 （n = 77） | ||
| E13，5 | 10.5 ± 0.9 （n = 92） | 40.9 ± 7 （n = 92） | ||
| E14，5 | 12.5 ± 0.9 （n = 101） | 57.6 ± 8 （n = 101） | 2.9 ± 0.5 （n = 70） | 0.050 ± 0.004 （n = 70） |
| E15，5 | 14.1 ± 0.5 （n = 134） | 71.4 ± 6 （n = 134） | 3.8 ± 0.4 （n = 87） | 0.053 ± 0.004 （n = 87） |
| E16，5 | 15.4 ± 0.6 （n = 112） | 82.7 ± 6 （n = 112） | 4.9 ± 0.5 （n = 87） | 0.058 ± 0.007 （n = 87） |
| E17，5 | 16.6 ± 0.4 （n = 211） | 96.9 ± 7 （n = 211） | 6.1 ± 0.6 （n = 146） | 0.063 ± 0.004 （n = 146） |
| E18，5 | 17.7 ± 0.6 （n = 139） | 112.1 ± 8 （n = 139） | 7.1 ± 0.8 （n = 93） | 0.063 ± 0.005 （n = 93） |
| E19，5 | 18.7 ± 0.7 （n = 57） | 126.7 ± 8 （n = 57） | 7.7 ± 0.7 （n = 36） | 0.062 ± 0.005 （n = 36） |
表1：胎儿生长的发育概况。
| E14，5 | E16，5 | E18，5 | 新生儿 | |
| 70%乙醇 | 1 小时 | 1.5小时 | 3小时 | 4小时 |
| 95%乙醇 | 35 分 | 45 分 | 1 小时 | 1 小时 |
| 95%乙醇 | 35 分 | 45 分 | 1 小时 | 1 小时 |
| 100%乙醇 | 15 分 | 15 分 | 30 分 | 6 分钟 |
| 二甲苯 1 | 20 分钟 | 30 分 | 40 分 | 30 分 |
| 二甲苯2 | 20 分钟 | 30 分 | 40 分 | 30 分 |
| 蜡 1 | 20 分钟 | 20 分钟 | 20 分钟 | 30 分 |
| 蜡 2 | 20 分钟 | 20 分钟 | 20 分钟 | 30 分 |
| 蜡 3 | 一 夜 之间 | 一 夜 之间 | 一 夜 之间 | 一 夜 之间 |
表2：基于胚胎天数的胚胎嵌入方案。
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Discussion
转基因小鼠已被用于了解先天性心脏缺陷的病理机制。我们在这项研究中提供的协议试图简化和标准化评估鼠胎儿心脏缺陷的过程。但是，在协议过程中需要注意一些关键步骤。小鼠胚胎在妊娠的每一天都显着生长，并且可以通过准确执行胎儿超声心动图来确定收获小鼠的正确时间。胎儿超声心动图可用于筛查胎儿心血管病理。2D图像允许识别异常的解剖结构和心脏功能，在彩色多普勒的帮助下检查血流并检测心脏腔室或异常流出道和流入道之间的任何通信。为了确定冠心病的诊断，当流出道分离和心腔形成完成时，从胚胎日E14.5开始扫描胎儿。早期扫描可能反映了发育迟缓。
组织病理学是使用切片机和光学显微镜可视化来表征冠心病8 的标准。标准方法的主要缺点是缺乏用于诊断的心血管结构的直观3D显示，并且缺乏提供样品的不同视图的限制。ECM 组织学是表征心脏缺陷的最省时的方法。如果 ECM 不可用，可以使用切片机切片胚胎并确定心脏表型。获得心脏成像的其他选择是执行高通量、高分辨率磁共振成像 （MRI） 或计算机断层扫描 （CT）。MRI或CT的一个关键方面是可以同时对多个胚胎进行成像;然而，即使在超声、CT 或 MRI 表型检查后，也需要进行组织病理学检查以确认任何冠心病诊断。
使用ECM成像进行组织病理学，在每次切割后使用安装在自动滑动切片机上的激光扫描共聚焦显微镜对胚胎进行连续成像。从ECM收集的单个图像允许后续的3D重建，并允许在任何成像平面上对样品进行数字重新切片，而无需重新拍摄图像8，11。这样的手术可以对心脏解剖结构进行全面评估，可用于不同的发育阶段。此外，可以从切片机中回收单个载玻片，同时从ECM设备收集数据。尽管 ECM 组织病理学是评估任何结构性心脏异常的金标准，但设备、软件的可用性和每个胚胎的运行时间存在局限性。切片胚胎心脏的运行时间可以从每个样本 1-3 小时不等，具体取决于其大小。由于设备的复杂性，研究人员必须定期检查计算机，以确保记录场内的感兴趣区域。研究人员还必须检查样品，以确保没有石蜡屑阻碍激光扫描仪的样品。
ECM 和随后的 3D 重建可对任何结构性心脏缺陷进行完整的高分辨率评估，无论标本的包埋计划如何。这些方案有助于成功诊断一系列冠心病，并使我们能够了解小鼠模型中的心脏胚胎发生以及与基因突变相关的病理。
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Disclosures
作者声明本手稿不存在利益冲突。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
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