Summary
Bu makalede fetal ekokardiyografi, nekropsi ve Episkopik floresan görüntü yakalama (EFIC) ve ardından üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon kullanılarak yapılan murin konjenital kalp hastalığı (KKH) tanı yöntemleri detaylandırılmıştır.
Abstract
Konjenital kalp hastalıkları (KKH) Amerika Birleşik Devletleri'nde bebek ölümlerinin başlıca nedenleridir. 1980'lerde ve daha öncesinde, orta veya şiddetli KKH'li hastaların çoğu, yaşamın ilk haftasında maksimum mortalite ile yetişkinlikten önce öldü. Cerrahi tekniklerdeki, tanısal yaklaşımlardaki ve tıbbi yönetimdeki dikkate değer ilerlemeler, sonuçlarda belirgin iyileşmelere yol açmıştır. Konjenital kalp kusurlarını anlamanın kritik araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için, murin modelleri, insanlara çok benzer kalp anatomisine ve kısa gebelik oranlarına sahip oldukları için ideal bir araştırma platformu sağlamıştır. Genetik mühendisliğinin yüksek verimli fenotipleme araçlarıyla kombinasyonu, CHD'lerin arkasındaki moleküler yolları daha da aydınlatmak için yapısal kalp kusurlarının replikasyonuna ve teşhisine izin vermiştir. Fare modellerinde kardiyak fenotipleri taramak için noninvaziv fetal ekokardiyografinin kullanılması, üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonlarla Piskoposik konfokal mikroskopi (ECM) histopatolojisi kullanılarak Piskoposluk floresan görüntü yakalamanın (EFIC) yüksek doğruluğu ile birleştiğinde, çeşitli konjenital kalp defektlerinin anatomisine ayrıntılı bir bakış açısı sağlar. Bu protokol, murin konjenital kalp kusurlarının doğru bir teşhisini elde etmek için bu yöntemlerin eksiksiz bir iş akışını özetlemektedir. Bu fenotipleme protokolünün organizmaları modellemek için uygulanması, doğru KKH tanısına izin verecek ve KKH'nin mekanizmaları hakkında fikir verecektir. KKH'nin altında yatan mekanizmaların belirlenmesi, potansiyel tedaviler ve müdahaleler için fırsatlar sağlar.
Introduction
Konjenital kalp hastalıkları (KKH) en sık görülen yenidoğan doğum defekti 1,2 olup, yenidoğanların yaklaşık %0,8-%1,7'sini etkileyerek önemli neonatal mortalite ve morbidite ile sonuçlanır 3. Genetik etiyoloji, CHD 4,5 ile güçlü bir şekilde endikedir. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, CHD'lerin karmaşıklığını ve farelerin dört odacıklı kalplere ve fare ve insan fetüslerinde karşılaştırılabilir kardiyak gelişimsel DNA dizilerine sahip olmaları nedeniyle bunlara neden olan mekanizmaları anlamak için yaygın olarak kullanılmıştır6. Fare mutantlarının fenotipini tanımlamak, hedeflenen genin işlevini karakterize etmede temel ilk adımdır. Tek bir genetik mutasyonun insan KKH'lerini taklit eden bir kardiyak defekt spektrumuna neden olabileceği gen dozaj etkilerini ifade eden fare modelleri, KKH'lerin karmaşıklığını ve bunlara neden olan mekanizmaları anlamak için önemlidir.
Bu makalede, fare modellerinde kardiyak fenotipleri karakterize etmek için bir boru hattı özetlenmektedir. Uygulanan yöntemlerde fetal ekokardiyogram 7, ardından gelişen murin kardiyak fenotiplerinin ayrıntılı anatomisini gösterebilen nekropsi ve ECM histopatolojisi 7,8 kullanılmaktadır. Fetal ekokardiyografi, makul görüntüleme çözünürlüğü ile çoklu embriyoların doğrudan görüntülenmesini sağlayan noninvaziv bir modalitedir. Ek olarak, bir fetal ekokardiyogram, bir çöpteki toplam embriyo sayısının, gelişim aşamalarının ve uterus boynuzundaki göreceli oryantasyonun ve yerin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar. Spektral Doppler/renk akışı kullanılarak anormal embriyolar yapıya, hemodinamik bozulmaya, büyüme kısıtlamasına veya hidrops gelişimine bağlı olarak tanımlanabilir. Fetal ekokardiyogram çalışması noninvaziv bir teknik olduğundan, birden fazla günde tarama yapmak ve hemodinamik veya kardiyak morfolojideki değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir. Fetal ekokardiyogramların yüksek kaliteli görüntülenmesi pratik ve beceri gerektirir, çünkü deneyim ve bilgi eksikliği nedeniyle spesifik kalp kusurları gözden kaçırılabilir. Bu nedenle, nekropsi ve ECM histopatolojisinin bir kombinasyonu ile kardiyak morfolojinin daha kesin bir analizi elde edilebilir. Nekropsi, ark yapısının, aort ve pulmoner arterin göreceli ilişkilerinin, ventriküllerin ve atriyumun büyüklüğünün, kalbin göğse göre konumunun ve bronkopulmoner yapıların doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, kalp kapakçıkları ve duvar kalınlığı gibi iç özelliklerin tek başına nekropsi ile değerlendirilmesi zor olabilir. Bu nedenle, kesin bir tanı için ECM histopatolojisi önerilir. ECM histopatolojisi, görüntü yığını9'un hem 2B hem de 3B rekonstrüksiyonuna izin veren yüksek çözünürlüklü bir görselleştirme tekniğidir. Bu görüntüler, parafine gömülü bir numunenin seri Episkopik floresan görüntülemesi yoluyla, otomatik bir mikrotom tarafından tutarlı bir aralıkta ince bir şekilde kesitlendiği için elde edilir. Klasik histolojiden farklı olarak, görüntüler bloktan kesilmeden önce bir bölüm olarak yakalanır, böylece tüm görüntüler aynı referans çerçevesi içinde yakalanır. Bu nedenle, ECM histopatolojisi tarafından üretilen 2D görüntü yığını üç boyutlu olarak kolayca ve güvenilir bir şekilde yeniden yapılandırılabilir. Bu, üç anatomik düzlemdeki görüntülerin 3D görselleştirilmesine izin veren bir DICOM görüntüleyici kullanılarak yapılır: koronal, sagital ve enine. Bu yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlardan kesin bir kardiyak tanı konulabilir. Bu üç farklı görselleştirme yönteminin ayrı ayrı veya kombinasyon halinde uygulanması, fare embriyolarındaki yapısal kalp defektlerinin doğru karakterizasyonunu sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmalar için farelerin kullanılması, farelerin insan KKH'lerini taklit edebilen dört odacıklı kalplere sahip olmaları nedeniyle gereklidir. Farelere veteriner bakımı sağlanmış ve kurumun Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş hayvan bakım tesisinde barındırılmıştır. Farelerin rahatsızlığını, stresini, ağrısını ve yaralanmasını en aza indirmek için sıkı protokoller izlendi. Fareler, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötenazi Kılavuzlarına göre küçük kemirgenler için kabul edilebilir olan CO2 gazı kullanılarak ötenazi yapıldı. Bu makalede fareler üzerinde yapılan çalışmalar, Pittsburgh Üniversitesi'nde onaylanmış bir IACUC protokolü ile gerçekleştirilmiştir.
1. Fetal ekokardiyogram
NOT: Bir ekokardiyogram, farelerde kardiyovasküler malformasyon ve ekstrakardiyak defektlerin tanımlanması için güçlü bir araçtır. Fare embriyolarının küçük boyutu nedeniyle (orta gebelikte yaklaşık 1-2 mm, doğumda 3.5 mm), ultrason biyomikroskopisi (UBM) ile ultra yüksek frekanslı ekokardiyografik ekipman gereklidir. UBM, bir seferde bir fare fetüsünü görselleştirmek için çözünürlük (30 μm eksenel x 68 μm yanal) sağlayan küçük bir görüntüleme penceresine (15 mm x 14 mm) sahip farklı yüksek frekanslı (30-50 MHz) problar sağlar. 40 MHz'lik bir dönüştürücü, kardiyovasküler fenotipleri7 tanımlamak için yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar.
- Ekokardiyogram makinesini açın ve Kardiyoloji programını seçin.
NOT: Aşağıdaki protokol, embriyonik gün (E)14,5 ila 19,5 arasındaki herhangi bir fare arka planı için kullanılabilir. - İstenilen fareyi anestezik indüksiyon odasında anestezi altına alın. % 4'lük bir izofluran konsantrasyonu ve 1 L / dak akış hızında tıbbi oksijen kullanarak anesteziyi indükleyin ve bakım için% 2-3'e düşürün.
- Fareyi hızlı bir şekilde görüntüleme platformuna yerleştirin. Görüntüleme platformu, işlem sırasında fareyi sıcak tutmak için ısıtılmış çeliğe sahiptir. Farenin ağzını ve burnunu anestezik burun konisine koyun. Hareketi önlemek için uzuvları bantla sabitleyin. Kalp atış hızını 400-450 bpm arasında kaldığından emin olmak için izleyin.
- Bir rektal termometre probu kullanarak sıcaklığı izleyin ve 37 ° C'de ± 0,5 ° C'de durduğundan emin olun. Hipoksiyi önlemek için nefes almayı izleyin. Zararı önlemek için prob üzerinde nazik bir kuvvet tutun.
NOT: Altındayken hipotermiyi önlemek ve anesteziden kurtulmak için farenin üzerine bir ısı lambası ayarlanabilir. Petrolatum oftalmik merhem, kuru gözlerden kaçınmak için bir kayganlaştırıcı olarak kullanılabilir. - Tüy dökücü krem kullanarak kürkü göğüs kafesinden ve karından çıkarın. Kremayı uygulayın ve çıkarmadan önce 3 dakika bekleyin. Bölgeyi% 70 etanol ile temizleyin. Etanol, tıraş yağlayıcısı olarak sudan daha iyi çalışır.
- Ultrason jelini normal vücut sıcaklığına ısıtın. Ultrason jelini cömertçe uygulayın ve dönüştürücüyü yatay bir düzlemde yönlendirmek ve ekrandaki mesaneyi tanımlamak için karın üzerine yerleştirin. Mesane tanımlandıktan sonra, mesaneden kraniyal olarak tarayın ve fetüsü arayın. Gebelik yaşı10'u belirlemek için taç-yumru uzunluğunu ölçün (Şekil 1 ve Tablo 1).
NOT: Enine dört odacıklı, sagital ve ön/koronal görüntüleme düzlemleri7 dahil olmak üzere farklı düzlemleri görselleştirmek için dönüştürücü konumlarını değiştirin (Şekil 1). - Kalpten kan akışını analiz etmek için renkli Doppler'i kullanın.
- Embriyolar amaçlanan aşamaya ulaşmamışsa fareyi tekrar kafese koyun. Aksi takdirde, fareyi hasat için hazırlayın.
NOT: Fareyi tekrar kafese koymadan önce uyanık olduğundan ve anesteziden iyi bir şekilde kurtulduğundan emin olun. - İzofluran ve oksijeni kapatın, çalışma alanını temizleyin ve makineyi kapatın.
NOT: Jeli dönüştürücüden çıkarmak önemlidir.
2. Nekropsi
NOT: Fetal ekokardiyografi kullanılarak anormal kardiyak fenotiplerden şüphelenildiğinde, fetüsler toplanır ve fiksatif çözeltiye tam vücut daldırma yoluyla sabitlenir: % 10 tamponlanmış formalin fosfat veya% 4 paraformaldehit (PFA). Makroskopik anatomik anormallikler veya malformasyonlar arayarak numunenin dış ve iç morfolojisini inceleyin.
- Fareyi hazırlayın.
- Fare bir yetişkinse, standart bir CO2 protokolü kullanarak fareyi ötenazi yapın. Fiksatifin iç organlara nüfuz etmesine izin vermek için lateral toraks ve karın bölgesinde insizyonlar (yaklaşık 3 cm) yapmak için forseps veya diseksiyon makası kullanın.
NOT: Embriyo E14.5'ten büyükse, numune nekropsiden önce en az 24 saat sabitlenmelidir.
- Fare bir yetişkinse, standart bir CO2 protokolü kullanarak fareyi ötenazi yapın. Fiksatifin iç organlara nüfuz etmesine izin vermek için lateral toraks ve karın bölgesinde insizyonlar (yaklaşık 3 cm) yapmak için forseps veya diseksiyon makası kullanın.
- Vücudun dışını analiz edin.
- Fotoğrafları, numunenin tanımlanması, mikroskop büyütmesi ve resmin içeriği dahil olmak üzere bir adla kaydetmek için yazılımı ayarlayın.
NOT: 1,0x ila 3,2x büyütme, E14.5 farelerde veya daha büyük farelerde çoğu yapıyı görüntülemek için yeterli olmalıdır. - Fareyi stereomikroskop merceğinin altındaki plakaya yerleştirin. Resimlerde dehidrasyon ve yansımayı önlemek amacıyla numuneyi tamamen örtmek için plakayı fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun. Büyütmeyi, ekran tüm embriyoyu içerecek şekilde ayarlayın ve ardından embriyonun hem sol hem de sağ taraflarının fotoğrafını çekin.
NOT: Sabitlemeyi kolaylaştırmak için plakanın tabanı parafin, silikon veya başka bir substratla kaplanmalıdır. - Numuneyi boğazından yukarı bakacak şekilde sabitleyin ve başka bir fotoğraf çekin.
NOT: Torasik boşluğun önemli yapılarının delinmediğinden emin olmak için pimi hafifçe yukarı doğru yönlendirin.
- Fotoğrafları, numunenin tanımlanması, mikroskop büyütmesi ve resmin içeriği dahil olmak üzere bir adla kaydetmek için yazılımı ayarlayın.
- Göğsü analiz edin.
- Boynun ortasındaki cildi forseps ile kaldırırken, deriyi medyan eksen boyunca kuyruğa doğru kesmeden önce deriyi makasla her iki koltuk altlarına doğru kesin. Ardından, cildi göbek kemiğinden bacaklara kadar kesin. Numuneyi bileklerinden ve ayak bileklerinden sabitleyin.
NOT: Sadece cildi kesmeye dikkat edin. Makasın bıçaklarının yatay veya yukarı doğru açılı tutulması önerilir. - Bağ dokusunu kırmak için, altta yatan dokuyu diğer çiftle yerinde tutarken cildi bir çift forseps ile kaldırın. Göğsün ve karnın açığa çıkmasına yardımcı olmak için numuneyi deriden geçirin (Şekil 2).
NOT: Sabitleme, kesme veya kazıma sırasında çok fazla germe doku hasarına neden olabilir. - Açıkta kalan kasların fotoğrafını çekin ve ardından kaburgaları ortaya çıkarmak için kasları yavaşça kazıyın.
- Açıkta kalan kaburgaların fotoğrafını çekin. Kaburgaları diyaframdan ayırın ve her iki taraftaki kaburgaları yanal eksende boyuna doğru mümkün olduğunca kesin.
- Kesilmiş kaburgaları çıkararak kalbi açığa çıkarın. Kalbin fotoğrafını çekin.
- Timüsü bir çift forseps ile soyarak çıkarın. Altta yatan damarların yırtılmasını önlemek için timus tabanını stabilize etmek için diğer forseps çiftini kullanın. Kalbin ve büyük kapların fotoğraflarını çekin.
NOT: Bazı bitişik yapıları germek için pimlerin kullanılması, daha iyi görüntüleme görünümleri elde etmenize yardımcı olabilir. Ek olarak, büyük arterlere, kalbe ve diğer ilgi çekici yapılara odaklanmış ayrı fotoğraflar çekin, çünkü bunlar birlikte odaklanmayabilir.
- Boynun ortasındaki cildi forseps ile kaldırırken, deriyi medyan eksen boyunca kuyruğa doğru kesmeden önce deriyi makasla her iki koltuk altlarına doğru kesin. Ardından, cildi göbek kemiğinden bacaklara kadar kesin. Numuneyi bileklerinden ve ayak bileklerinden sabitleyin.
- Karnı analiz edin.
- Diyaframı çıkarmak ve karaciğeri açığa çıkarmak için çekin. Fotoğraf çekin.
- Mide ve pankreası açığa çıkarmak için karaciğeri geri sabitleyin. Fotoğraf çekin.
- Yemek borusunu kesin. Kolonu ve bağırsakları forseps ile çekerek çıkarın. Karaciğerin hemen üstünde kesin ve böbrekleri ve adrenal bezleri ortaya çıkarmak için çıkarın. Fotoğraf çekin.
NOT: Çıkarılan organlar fiksatif solüsyonda tutulmalıdır.
- ECM analizi için toraksı izole edin.
- Alt toraksı karaciğer ve akciğerler arasındaki düz bir çizgi boyunca kesin. Başını, karotis arterlerin dallarını kesmeyecek kadar yüksek kesin.
- Dorsal kaburgaları ve omurgayı korurken yanal kaburgaları yavaşça çıkarın. Sırt yağını soyun ve kazıyın.
- Toraksı vücudun geri kalanından ayırın ve% 10 tamponlu formalin fosfat çözeltisine yerleştirin.
3. Katıştırma
- Fiksatifi uygun bir tehlikeli atık şişesine boşaltın. Numuneleri 15 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Numuneleri kurutmak için artan konsantrasyonlarda etanol ve ksilen kullanın. Aşağıdaki adımların tümünün süresi embriyoların aşamasına bağlıdır. Ayrıntılar için lütfen Tablo 2'ye bakın.
NOT: Numunelere zarar vermemek için çözeltileri değiştirirken dikkatli olunmalıdır. Numune işleme için en uygun parametreler ampirik olarak ayarlanabilir. Ksilen bazı plastikleri çözecektir; cam aletler ve kaplar kullanılmalıdır. - Ksilen'i istenen süre boyunca parafin ile değiştirin. Şişeleri uygun süre boyunca 65 °C'lik bir inkübatörde bırakın (Tablo 2).
- Numuneleri istenen konuma yerleştirmek için taze parafin kullanın.
NOT: Numunenin parafin bloğun ortasına, dorsal tarafı üste ve arka tarafı bloğun önüne bakacak şekilde yönlendirilmesi önerilir. Numuneyi yönlendirirken, numunenin blok baş aşağı bakacak şekilde gömüldüğünü unutmayın.
4. Episkopik konfokal mikroskopi (ECM)
NOT: Uygun gömme işleminden sonra, embriyolar histopatoloji analizi için ECM aracılığıyla seri olarak görüntü toplamaya tabi tutulur. Daha ileri çalışmalar için mikrotomdan bireysel slaytlar kurtarılabilir.
- Parafin bloğunu -20 °C dondurucudan çıkarın ve metal kalıpları çıkarın.
- Kasetin kenarlarındaki ve arkasındaki balmumunu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Numuneyi çevreleyen balmumunu, kasete tutturulmuş küçük bir balmumu karesi içine alınana kadar kesin.
NOT: Bıçakları tutarken çok dikkatli olun. - Parafin bloğunu mikrotomun dilimleme aşamasına karşı sıkıştırmak için metal kolu kullanın. Çalıştırma Modu'nda MAN (manuel) işlevini seçin, parafinin yüzeyini bıçağa yakın bir yere kaldırın ve bıçağın parafin bloğuna temas ettiğinden emin olmak için birkaç slayt çalıştırın.
- LAS AF uygulamasını açın ve MatrixScreener'ı seçin. Tek Normal Matris'i seçin ve önceden kaydedilmiş uygun şablonu yükleyin. Beyaz ve turuncu ombre'ye geçmek için Hızlı LUT düğmesine tıklayın.
- İşleri Ayarla'yı seçin ve 405 nm görünür lazeri maksimuma sürükleyin. Spektrum bloğunun sol kenarını 405 nm çizgisiyle eşleştirin ve sağ kenarı 800 nm çizgisine sürükleyin. İğne Deliği seçeneğini işaretleyin ve Canlı görünümü başlatın.
- Numuneyi ekranda ortalamak için lazer projeksiyonun konumunu ayarlayın ve Yakınlaştırma düğmesini ~ 20x olarak ayarlayın. Çözünürlüğü optimize etmek için kazancı 1.250 V'a ayarlayın ve odak düğmesini kullanarak mavi alanı en üst düzeye çıkarın; Ardından, görüntüleme için kazancı yaklaşık 750 V'a sıfırlayın.
NOT: Spesifik değerler embriyonun durumuna bağlı olarak değişebilir. - Kesme yöntemini Otomatik olarak değiştirin, kalınlığı yaklaşık 50 μm'ye ayarlayın ve slaytları çalıştırın. Akciğerler ve hava yolu göründüğünde kesmeyi bırakın.
- 8-10 μm arasında bir kesme kalınlığı seçin ve Canlı görüntüyü durdurun. Görüntülemeye başlamak için Microtome Communicator'ı açın. Görüntüleri toplamadan önce geçici depolama klasörünün boş olduğundan emin olun.
- Ek bir kalp yapısı görselleştirilmediğinde kesmeyi bırakın. Microtome Communicator uygulamasını kapatın ve geçici dosyayı daha sonra 3D rekonstrüksiyonlar için görüntü işleme yazılımı aracılığıyla bir .tiff görüntü serisine aktarın.
5. Üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon
NOT: 3D rekonstrüksiyonun amacı, ECM görüntülemeden koronal, sagital ve enine oryantasyonlarda 3D videolara bir 2D görüntü yığınını işlemek ve örneklerdeki yapısal ve anatomik anormalliklerin teşhisi için 3D videoları kullanmaktır.
- Görüntü işleme yazılımında ECM görüntü yığınını açın.
- Görüntü dosyalarını görüntü işleme yazılımına sürükleyip bırakın. Menü çubuğunda Görüntü > Dönüştür > Yatay Çevir'i seçerek ECM görüntülerini yatay olarak çevirin .
- Çevrilen görüntüyü kaydedin ve görüntü işleme yazılımını kapatın.
- ECM görüntü yığınını DICOM görüntüleme yazılımına aktarın.
- Yatay olarak çevrilmiş ECM görüntülerini DICOM görüntüleme yazılımına sürükleyip bırakın. Örnek listesinin etrafında açık mavi bir kenarlık olduğundan emin olun, aksi takdirde görüntüler varolan bir örnek klasöre eklenebilir.
- Açılır pencere göründüğünde veritabanına kopyalanacak bağlantıları veya dosyaları seçin. Örnek listesinde, DICOM görüntüleme yazılımına kopyalanan dosyayla aynı ada sahip yeni bir örnek görünür.
- Açmak için yeni eklenen dosyaya tıklayın.
- 3B rekonstrüksiyon gerçekleştirin.
- Dosya açıldıktan sonra, araç çubuğundan 2D / 3D Yeniden Yapılandırma Araçları menüsüne tıklayın ve 3D MPR'yi seçin.
- Pixel X Çözünürlük ve Piksel Y Çözünürlüğü için, ECM görüntüleme sırasında kullanılan yakınlaştırmayı vererek görüntü çözünürlüğünü girin. Dilim Aralığı için, ECM görüntüleme sırasında kesmek için kullanılan dilim kalınlığını girin.
NOT: Kamera çözünürlüğü kameranın yakınlığına bağlı olarak değişir ve fotoğraf makinesinden kameraya farklılık gösterebilir.
- Görüntü yığınlarını istediğiniz gibi ayarlamak için sol taraftaki Araçlar sekmesindeki farklı araçları kullanın.
- Pencere Genişliğini ve Pencere Düzeyini ayarlamak için WW/WL aracını kullanın. Görüntü parlaklığını azaltmak için görüntü üzerindeki aracı tıklayıp yukarıya, artırmak için aşağı doğru sürükleyin. Görüntü kontrastını azaltmak için görüntüdeki aracı tıklayıp sağa ve artırmak için sola doğru sürükleyin.
NOT: Bir yapı için en uygun WW/WL ayarları başka bir yapı için yetersiz olabilir. Bu nedenle, farklı yapıları görüntülemek için ayrı videolar oluşturmanız önerilir. - Görüntüleri istediğiniz konumlara sürüklemek için Pan aracını kullanın. Görüntüyü istediğiniz gibi büyütmek veya küçültmek için Yakınlaştırma aracını ve görüntüyü istediğiniz gibi döndürmek için Döndürme aracını kullanın.
NOT: Görüntülerin büyütülmesi, görüntü kalitesinin düşmesine neden olabilir. Görüntüleri döndürürken dikkatli olun, çünkü bunu yapmak eksenlerin dönmesine neden olabilir.
- Pencere Genişliğini ve Pencere Düzeyini ayarlamak için WW/WL aracını kullanın. Görüntü parlaklığını azaltmak için görüntü üzerindeki aracı tıklayıp yukarıya, artırmak için aşağı doğru sürükleyin. Görüntü kontrastını azaltmak için görüntüdeki aracı tıklayıp sağa ve artırmak için sola doğru sürükleyin.
- İlk panelin renkli eksenini tıklatıp sürükleyin. Bu ekseni döndürmenin diğer iki panelin yönünü nasıl değiştirdiğine dikkat edin. Üç panelin eksenlerini, üç panel numunenin koronal, sagital ve enine görünümlerini temsil edene kadar döndürün.
NOT: Numuneleri yeniden yönlendirirken, doğru anterior/posterior oryantasyonu koruyun. - Videolar oluşturun.
- Her üç panel de düzgün bir şekilde konumlandırıldıktan sonra, yönlendirildikten ve aydınlatıldıktan sonra, koronal görünümü temsil eden panele tıklayın.
- Menü çubuğunun sağ tarafındaki Film Dışa Aktarma'ya tıklayın. Toplu İşlem'e tıklayın ve ilgilenilen tüm bölgeyi kapsayacak şekilde Kimden ve Kime kaydırıcılarını sürükleyin. Aralık için, Kalınlıkla Aynı seçeneğini belirleyin. Görünümün yönünü belirten videoyu kaydedin.
- İlgilenilen yapıların yeterince tanımlanıp tanımlanamayacağını görmek için videoyu inceleyin. Değilse, videoları gerektiği gibi yeniden ayarlamak ve videoyu yeniden kaydetmek için araçları (adım 5.4) kullanın.
- Enine ve sagital görünümler için adım 5.6'yı yineleyin. Yeniden yapılandırılmış videoları kullanarak örnekleri tanılayın.
NOT: Numunenin herhangi bir anatomik anormallik veya hastalık fenotipi sergileyip sergilemediğine dair eksiksiz bir değerlendirme yapmak için her yöndeki videoları dikkatlice izleyin (Şekil 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önemli hemodinamik defektlere sahip fare embriyolarının embriyonik ölümcül olduğu kaydedildi. Çok çeşitli KKH'ler, farklı görüşler kullanılarak yüksek çıkışlı, noninvaziv fetal ekokardiyogram ile tanımlanabilir (Şekil 1).
Septal defektler: En sık görülen KKH'ler ventriküler septal defekt (VSD), atriyoventriküler septal defekt (AVSD) ve atriyal septal defekt (ASD)1 gibi septal defektlerdir. VSD veya AVSD, 2B görüntüler ve renk akışı görüntüleri kullanılarak kolayca görselleştirilebilir. Ventriküller boyunca veya atriyum ile ventriküller arasındaki kan akışı kolayca tanımlanabilir (Şekil 3). ASD'nin bir fetüste patent foramen ovale ile ayırt edilmesi zordur.
Çıkış yolu anomalileri: Şekil 3'te gösterildiği gibi, ana pulmoner arterdeki akış, normal embriyolarda yükselen aort akımı boyuncadır. Sağ ventrikülün çift çıkışı (DORV) olan embriyolarda, sağ ventrikülden kaynaklanan her iki büyük arter de görülebilir. DORV ayrıca VSD ile ilişkilidir (Şekil 3D) ve renk akışı kullanılarak tanımlanabilir. Bununla birlikte, embriyoların küçük boyutu göz önüne alındığında, DORV bazen aort, pulmoner atrezi veya kalıcı truncus arteriyozusun (PTA) baskın olmasından güvenilir bir şekilde ayırt edilemez. PTA'da fetal ekokardiyogramda sadece bir çıkış yolu debisi görülebilir (Şekil 3E). Ayrıntılı ark yapısı ve ana pulmoner arter nekropsi kullanılarak görülebilir (Şekil 2E,F).
Nekropsi, göğüs ve karın bölgesindeki situs durumunu ve göğse göre kardiyak pozisyonu (levokardi (Şekil 2C-E) veya dekstrokardi) hızlı bir şekilde teşhis edebilir. Çıkış yolu yapıları ve hem atriyum hem de ventriküllerin göreceli büyüklüğü kolayca görselleştirilebilir (Şekil 2E, F).
ECM histopatolojisi herhangi bir yapısal kardiyak anomalinin değerlendirilmesinde altın standart tekniktir 8,11,12. Embriyoların yapılarına benzersiz bir çözünürlük ve detay sağlar. Farklı düzlemler ve görünümler kullanılarak yapılan üç boyutlu rekonstrüksiyon, büyük arterler ve ventriküller arasındaki ilişkiyi (Şekil 3) ve ventriküller ile atriyum arasındaki defekti kolayca tanımlayabilir.
Şekil 1: Gebelik yaşını belirlemek için embriyoların 2D ekokardiyogram görüntülerinde kron-yumru uzunluğunu ölçme yerleri. (A) E11.5, (B) E12.5, (C,D) E13.5-E14.5'teki embriyoların 2D ekokardiyogram görüntüleri. (D) Hastalıklı embriyo (C) kardeşinden daha küçüktür ve hidrops (ok) ile "yumuşak" bir görünüme sahip olduğu belirtilir. (A-C) Canlı embriyolar farklı organlar gösterir. (E) çıkış yollarını görüntülemek için önden eğilmiş koronal 4 odacıklı bir görünümde E14.5 kalbin renkli görüntülerini içeren temsili VB modu, (E') koronal görünümde ECM ile doğrulanan büyük arterlerin normal ilişkisi ile sağlam ventriküler septum göstermektedir. (F) E14.5 kalbinin temsili sagital görünümü, (F') sagital görünümde ECM ile doğrulanan asendan aort (AO) kraniyal olarak işaret eden ve pulmoner arter posteriorda (omurgaya doğru) işaret eden sol ventrikül ve sağ ventrikül çıkış yollarını gösterir. (G) Sol ventrikülün (LV) ve sağ ventrikülün (RV) temsili enine görünümü, (G') enine görünümde ECM ile doğrulanır. (H) ECM'de kalbin tabanındaki enine bir görünüm, ayrı ve ayrı bir aort kapağı (AV) ve pulmoner kapak (PV) gösterir. Persistan truncus arteriosus'un (PTA) temsili ECM transvers görünüm görüntüsü, sol pulmoner arter ve sağ pulmoner arterin bölünmemiş persistan trunkal arterden posteriorda kaynaklandığını, sol karotis arterin inatçı trunkal arterden anterior ve kraniyal olarak ortaya çıktığını göstermektedir. Kısaltmalar: A: anterior, AO: aort, AV: aort kapağı, Cd: kaudal, Cr: kraniyal, DAO: inen aort, L: sol, LA: sol atriyum, LCA: sol karotis arter, LPA: sol pulmoner arter, LV: sol ventrikül, P: posterior, PA: pulmoner arter, PTA: kalıcı kesik arteriyoz, R: sağ, RA: sağ atriyum, RPA: sağ pulmoner arter, RV: sağ ventrikül. Ölçek çubuğu: 0,5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kardiyovasküler anormallikleri gözlemlemek için bir nekropsinin temsili görüntüleri . (A) Belirgin bir fenotipi olmayan siyah arka planlı diseksiyon kabına sabitlenmiş bir embriyo. Görüntü başın brüt anatomisini, dijitalleri, göğüs boşluğunu ve karnı göstermektedir. (B) Dermis yavrudan çıkarılır, submandibuler bezleri, göğüs kafesini ve karnı ortaya çıkarır. (C) Göğüs kafesi kaldırılır ve timus, kalp, akciğerler ve diyafram dahil olmak üzere göğüs boşluğunun brüt anatomisi ortaya çıkar. (D) Göğüs kafesi çıkarılmış olarak göğsün yakınlaştırılmış görünümü. (E) Timus çıkarılır, büyük damarlar ve trakea ortaya çıkar. (F) Büyük gemilerin yakınlaştırılmış görünümü. Kısaltmalar: AAO: yükselen aort, D: diyafram, LA: sol atriyum, LCA: sol karotis arter, LSVC: sol superior vena kava, LV: sol ventrikül, P: perikard, RA: sağ atriyum, Rb: kaburga, RCA: sağ karotis arter, RL: sağ akciğer, RSVC: sağ superior vena kava, RV: sağ ventrikül, S: sternum, SCA: sağ subklaviyen arter, SMG: submandibuler bezler, T: trakea, Th: timus. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temsili fetal ekokardiyografi (Eko) ve episkopik konfokal mikroskoptan (ECM) alınan görüntüler. (A) Eko, E14.5-15.5 aşamasında (A') ECM ile doğrulanan, normal kontrolde interventriküler şant ve normal ilişkili büyük arterler olmadan sağlam bir ventriküler septum gösterir. (B) Atriyoventriküler septal defektin (AVSD) ultrason tespiti. 4 odacıklı görünümdeki yankı görüntüleme, E14.5 aşamasında (B') ECM tarafından doğrulanan LA, RA, LV ve RV arasındaki iletişimi gösterir. (C) Ventriküler septal defektin (VSD) renk akışı ile ultrason teşhisi, E16.5 aşamasında (C') ECM tarafından doğrulanan LV ve RV boyunca akışı gösterir. (D) Eko ve (D') ECM, E14.5 aşamasında yan yana büyük arterlerle (aort pulmoner artere doğru) LV ve RV arasında bir VSD ile DORV gösterir. (E) Kalıcı truncus arteriyozusun (PTA) ultrason tanısı, LV ve RV arasındaki iletişimi gösterir ve her iki ventrikülü (PTA) geçersiz kılan tek bir çıkış yolu vardır. (E') Bu patoloji E14.5 aşamasında ECM tarafından doğrulanır. Ölçek çubuğu: 0.5 mm. AO: aort, AVSD: atriyoventriküler septal defekt, Cd: kaudal, Cr: kraniyal, L: sol, LA: sol atriyum, LV: sol ventrikül, PA: pulmoner arter, PTA: kalıcı kesik arteriyoz, R: sağ, RA: sağ atriyum, RV: sağ ventrikül, VSD: ventriküler septal defekt. Ölçek çubuğu: 0,5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Safha | Taç-Yumru Uzunluğu (mm) | Fetüs Alanı (mm2) | Kalp Bölgesi (mm2) | Kalp Alanı/Fetüs Alanı |
| E12,5 | 7.9 ± 0.8 (n = 77) | 23.2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13,5 | 10.5 ± 0.9 (n = 92) | 40.9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14,5 | 12.5 ± 0.9 (n = 101) | 57.6 ± 8 (n = 101) | 2.9 ± 0.5 (n = 70) | 0.050 ± 0.004 (n = 70) |
| E15.5 | 14.1 ± 0.5 (n = 134) | 71.4 ± 6 (n = 134) | 3.8 ± 0.4 (n = 87) | 0.053 ± 0.004 (n = 87) |
| E16,5 | 15.4 ± 0.6 (n = 112) | 82.7 ± 6 (n = 112) | 4.9 ± 0.5 (n = 87) | 0.058 ± 0.007 (n = 87) |
| E17,5 | 16.6 ± 0.4 (n = 211) | 96.9 ± 7 (n = 211) | 6.1 ± 0.6 (n = 146) | 0.063 ± 0.004 (n = 146) |
| E18,5 | 17.7 ± 0.6 (n = 139) | 112.1 ± 8 (n = 139) | 7.1 ± 0.8 (n = 93) | 0.063 ± 0.005 (n = 93) |
| E19,5 | 18.7 ± 0.7 (n = 57) | 126.7 ± 8 (n = 57) | 7.7 ± 0.7 (n = 36) | 0.062 ± 0.005 (n = 36) |
Tablo 1: Fetal Büyümenin gelişimsel profili.
| E14,5 | E16,5 | E18,5 | Yenidoğan | |
| %70 Etanol | 1 saat | 1.5 saat | 3 saat | 4 saat |
| %95 Etanol | 35 dk | 45 dk | 1 saat | 1 saat |
| %95 Etanol | 35 dk | 45 dk | 1 saat | 1 saat |
| %100 Etanol | 15 dk | 15 dk | 30 dk | 6 dk |
| Ksilen 1 | 20 dk | 30 dk | 40 dk | 30 dk |
| Ksilen 2 | 20 dk | 30 dk | 40 dk | 30 dk |
| Balmumu 1 | 20 dk | 20 dk | 20 dk | 30 dk |
| Balmumu 2 | 20 dk | 20 dk | 20 dk | 30 dk |
| Balmumu 3 | Geceleyin | Geceleyin | Geceleyin | Geceleyin |
Tablo 2: Embriyonik günlere dayalı embriyo gömme protokolü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetiği değiştirilmiş fareler, konjenital kalp defektlerinin patomekanizmalarını anlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada sunduğumuz protokoller, murin fetal kalp defektlerini değerlendirme sürecini kolaylaştırmaya ve standartlaştırmaya çalışmaktadır. Ancak, protokol sırasında dikkat edilmesi gereken kritik adımlar vardır. Fare embriyoları gebeliğin her gününde önemli ölçüde büyür ve bir fareyi hasat etmek için doğru zaman, fetal ekokardiyogramın doğru bir şekilde yapılmasıyla belirlenebilir. Fetal ekokardiyografi fetal kardiyovasküler patolojiyi taramak için kullanılabilir. 2D görüntü, kan akışını incelemek ve kalbin odaları veya anormal çıkış ve giriş yolları arasındaki iletişimi tespit etmek için renkli Doppler yardımıyla anormal anatomi ve kardiyak fonksiyonun tanımlanmasına izin verir. KKH tanısını belirlemek için fetüsler, çıkış yolu septasyonu ve kalp odası oluşumunun tamamlandığı embriyonik gün E14.5'ten itibaren taranır. Daha erken aşamalarda tarama, gelişimsel gecikmeyi yansıtabilir.
Histopatoloji, bir mikrotom ve ardından optik mikroskop görselleştirme kullanarak CHD8'i karakterize etmek için standarttır. Standart yöntemin en büyük dezavantajı, tanı için kardiyovasküler yapıların sezgisel bir 3D gösteriminin olmaması ve örneklerin farklı görünümlerinin sağlanmamasında sınırlamadır. ECM histolojisi, kalp defektlerini karakterize etmek için en verimli yöntemdir. ECM kullanılamıyorsa, embriyoyu bölmek ve kardiyak fenotipleri belirlemek için bir mikrotom kullanılabilir. Kardiyak görüntüleme elde etmek için diğer seçenekler yüksek verimli, yüksek çözünürlüklü manyetik rezonans görüntüleme (MRG) veya bilgisayarlı tomografi (BT) yapmaktır. MRG veya BT'nin önemli bir yönü, birden fazla embriyonun aynı anda görüntülenebilmesidir; Bununla birlikte, ultrason, BT veya MRG fenotiplemeden sonra bile, herhangi bir KKH tanısını doğrulamak için histopatoloji gereklidir.
Histopatoloji için ECM görüntüleme kullanılarak, embriyo her kesimden sonra otomatik kayan mikrotom üzerine monte edilmiş bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak seri olarak görüntülenir. ECM'den toplanan bireysel görüntüler, sonraki 3D rekonstrüksiyonlara izin verir ve görüntülerin 8,11'i yeniden çekmeden herhangi bir görüntüleme düzleminde dijital olarak yeniden işlenmesine izin verir. Böyle bir operasyon, farklı gelişim aşamalarında kullanılabilecek kalp anatomisinin kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar. Ayrıca, ECM ekipmanından veri toplanırken mikrotomdan bireysel slaytlar kurtarılabilir. ECM histopatolojisi herhangi bir yapısal kardiyak anomaliyi değerlendirmek için altın standart olmasına rağmen, embriyo başına ekipman, yazılım ve çalışma süresinin mevcudiyeti ile ilgili sınırlamalar vardır. Embriyonik bir kalbin bölünmesi için çalışma süresi, büyüklüğüne bağlı olarak numune başına 1-3 saat arasında değişebilir. Ekipmanın karmaşıklığı nedeniyle, araştırmacılar alanın içindeki ilgi alanının kaydedildiğinden emin olmak için bilgisayarı düzenli olarak kontrol etmelidir. Araştırmacılar ayrıca, parafin balmumu talaşının numuneyi lazer tarayıcıdan engellemediğinden emin olmak için numuneyi kontrol etmelidir.
ECM ve müteakip 3D rekonstrüksiyon, numunenin gömme planından bağımsız olarak herhangi bir yapısal kalp kusurunun tam bir yüksek çözünürlüklü değerlendirmesini sağlar. Bu protokoller, bir dizi KKH'nin başarılı bir şekilde teşhis edilmesine yardımcı olmuş ve murin modellerinde ve genetik mutasyonlarla ilgili patolojilerde kardiyak embriyogenezi anlamamızı sağlamıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu makalede çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
