Summary
Denne artikel beskriver murine medfødt hjertesygdom (CHD) diagnostiske metoder ved hjælp af føtal ekkokardiografi, obduktion og episkopisk fluorescens billedoptagelse (EFIC) ved hjælp af episkopisk konfokal mikroskopi (ECM) efterfulgt af tredimensionel (3D) rekonstruktion.
Abstract
Medfødte hjertesygdomme (CHD'er) er hovedårsagerne til spædbarnsdød i USA. I 1980'erne og tidligere døde de fleste patienter med moderat eller svær CHD før voksenalderen, med den maksimale dødelighed i den første uge af livet. Bemærkelsesværdige fremskridt inden for kirurgiske teknikker, diagnostiske tilgange og medicinsk behandling har ført til markante forbedringer i resultaterne. For at imødekomme de kritiske forskningsbehov for at forstå medfødte hjertefejl har murinmodeller givet en ideel forskningsplatform, da de har meget lignende hjerteanatomi som mennesker og korte drægtighedshastigheder. Kombinationen af genteknologi med fænotypeværktøjer med høj kapacitet har gjort det muligt at replikere og diagnosticere strukturelle hjertefejl for yderligere at belyse de molekylære veje bag CHD'er. Brugen af ikke-invasiv føtal ekkokardiografi til screening af hjertefænotyperne i musemodeller kombineret med high fidelity af episkopisk fluorescensbilledoptagelse (EFIC) ved hjælp af episkopisk konfokal mikroskopi (ECM) histopatologi med tredimensionelle (3D) rekonstruktioner muliggør et detaljeret overblik over anatomien af forskellige medfødte hjertefejl. Denne protokol skitserer en komplet arbejdsgang af disse metoder for at opnå en nøjagtig diagnose af murin medfødte hjertefejl. Anvendelse af denne fænotypeprotokol på modelorganismer vil muliggøre nøjagtig CHD-diagnose, hvilket giver indsigt i mekanismerne i CHD. Identifikation af de underliggende mekanismer for CHD giver muligheder for potentielle terapier og interventioner.
Introduction
Medfødte hjertesygdomme (CHD'er) er den mest almindelige neonatale fødselsdefekt 1,2, der påvirker ca. 0,8% -1,7% af nyfødte og resulterer i signifikant neonatal dødelighed og sygelighed3. En genetisk ætiologi er stærkt indiceret med CHD'er 4,5. Genetisk modificerede musemodeller er blevet brugt bredt til at forstå kompleksiteten af CHD'er og de mekanismer, der forårsager dem, fordi musene har firekammerhjerter og sammenlignelige hjerteudviklings-DNA-sekvenser i mus og humane fostre6. Identifikation af fænotypen af musemutanterne er det grundlæggende første skridt i karakteriseringen af funktionen af det målrettede gen. Musemodeller, der udtrykker gendoseringseffekter, hvor en enkelt genetisk mutation kan resultere i et spektrum af hjertefejl, der efterligner humane CHD'er, er vigtige for at forstå kompleksiteten af CHD'er og de mekanismer, der forårsager dem.
Denne artikel skitserer en pipeline til karakterisering af hjertefænotyper i musemodeller. De anvendte metoder anvender føtalt ekkokardiogram 7 efterfulgt af obduktion og ECM-histopatologi 7,8, som kan vise den detaljerede anatomi ved udvikling af murinhjertefænotyper. Et føtalt ekkokardiogram er en ikke-invasiv modalitet, der tillader direkte visualisering af flere embryoner med rimelig billedopløsning. Derudover giver et føtalt ekkokardiogram en hurtig bestemmelse af det samlede antal embryoner i et kuld, deres udviklingsstadier og den relative orientering og placering i livmoderhornet. Ved hjælp af en spektral Doppler / farvestrøm kan unormale embryoner identificeres baseret på strukturen, den hæmodynamiske forstyrrelse, vækstbegrænsningen eller udviklingen af hydrops. Da en føtal ekkokardiogramundersøgelse er en ikke-invasiv teknik, kan den bruges til at scanne på flere dage og til at observere ændringerne i hæmodynamik eller hjertemorfologi. At opnå billeddannelse af høj kvalitet af føtale ekkokardiogrammer kræver øvelse og dygtighed, da specifikke hjertefejl kan gå glip af på grund af manglende erfaring og viden. På grund af dette kan en mere definitiv analyse af hjertemorfologi opnås gennem en kombination af obduktion og ECM-histopatologi. Obduktion giver direkte visualisering af buestrukturen, de relative forhold mellem aorta og lungearterien, størrelsen af ventriklerne og atrierne, hjertets position i forhold til brystet og bronkopulmonale strukturer. Imidlertid kan indvendige funktioner som hjerteklapper og vægtykkelse være vanskelige at vurdere gennem obduktion alene. Således anbefales ECM histopatologi til en afgørende diagnose. ECM-histopatologi er en visualiseringsteknik med høj opløsning, der giver mulighed for både 2D- og 3D-rekonstruktion af billedstakken9. Disse billeder opnås gennem seriel episkopisk fluorescerende billeddannelse af en paraffinindlejret prøve, da den er tyndt snittet med et ensartet interval af et automatisk mikrotom. I modsætning til klassisk histologi tages billeder som et afsnit, før det skæres ud af blokken, således at alle billeder tages inden for den samme referenceramme. På grund af dette kan 2D-billedstakken produceret af ECM-histopatologi let og pålideligt rekonstrueres i tre dimensioner. Dette gøres ved hjælp af en DICOM-fremviser, som tillader 3D-visualisering af billederne i de tre anatomiske planer: koronal, sagittal og tværgående. Fra disse højopløselige 3D-rekonstruktioner kan der stilles en endelig hjertediagnose. Anvendelsen af disse tre forskellige visualiseringsmetoder, enten individuelt eller i kombination, kan give nøjagtige karakteriseringer af strukturelle hjertefejl i museembryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af mus til disse undersøgelser er nødvendig, da mus har hjerter med fire kamre, der kan efterligne humane CHD'er. Mus blev ydet dyrlægepleje og anbragt i institutionens Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) -akkrediterede dyreplejefacilitet. Strenge protokoller blev fulgt for at minimere musenes ubehag, stress, smerte og skade. Mus blev aflivet ved hjælp af CO2 -gas, hvilket er acceptabelt for små gnavere i henhold til American Veterinary Medical Association Guidelines on Eutanasi. Undersøgelserne på mus i dette manuskript blev udført med en godkendt IACUC-protokol ved University of Pittsburgh.
1. Føtal ekkokardiografi
BEMÆRK: Et ekkokardiogram er et kraftfuldt værktøj til at identificere kardiovaskulære misdannelser og ekstrakardiale defekter hos mus. På grund af den lille størrelse af museembryonerne (ca. 1-2 mm ved midgestation, 3,5 mm ved fødslen) kræves ultrahøjfrekvent ekkokardiografisk udstyr med ultralydbiomikroskopi (UBM). UBM giver forskellige højfrekvente (30-50 MHz) sonder med et lille billedvindue (15 mm x 14 mm), der giver opløsningen (30 μm aksial x 68 μm lateral) til at visualisere et musefoster ad gangen. En 40 MHz transducer giver billeder i høj opløsning til identifikation af kardiovaskulære fænotyper7.
- Tænd ekkokardiogrammaskinen, og vælg programmet Kardiologi.
BEMÆRK: Følgende protokol kan bruges til enhver musebaggrund fra embryonal dag (E)14.5 til 19.5. - Bedøv den ønskede mus i et bedøvelsesinduktionskammer. Inducer anæstesi ved hjælp af en koncentration på 4% isofluran og medicinsk ilt ved en strømningshastighed på 1 l / min og reducer den til 2% -3% til vedligeholdelse.
- Placer musen hurtigt på billedplatformen. Billedplatformen har opvarmet stål for at holde musen varm under proceduren. Sæt musens mund og næse i bedøvelsesens næsekegle. Fastgør lemmerne med tape for at undgå bevægelse. Overvåg pulsen for at sikre, at den forbliver mellem 400-450 bpm.
- Overvåg temperaturen ved hjælp af en rektal termometersonde, og sørg for, at den hviler ved 37 °C ± 0,5 °C. Overvåg vejrtrækningen for at undgå hypoxi. Hold en blid kraft på sonden for at forhindre skade.
BEMÆRK: En varmelampe kan indstilles over musen for at forhindre hypotermi under og for at komme sig efter anæstesi. Petrolatum oftalmisk salve kan bruges som smøremiddel for at undgå tørre øjne. - Fjern pelsen fra brystkassen og maven ved hjælp af hårfjerningscreme. Påfør cremen og vent 3 minutter, før du fjerner den. Rengør området med 70% ethanol. Ethanol fungerer bedre end vand som barbersmøremiddel.
- Opvarm ultralydsgel til en normal kropstemperatur. Påfør ultralydgelen generøst og placer transduceren på maven for at orientere den i et vandret plan og identificere blæren på skærmen. Når blæren er identificeret, scan kranialt fra blæren og kig efter fosteret. Mål krone-til-rumpe-længden for at bestemme svangerskabsalderen10 (figur 1 og tabel 1).
BEMÆRK: Skift transducerpositioner for at visualisere forskellige planer, herunder de tværgående firekammer-, sagittal- og frontale/koronale billeddannelsesplaner7 (figur 1). - Brug farven Doppler til at analysere blodgennemstrømningen fra hjertet.
- Sæt musen tilbage i buret, hvis embryonerne ikke har nået det tilsigtede stadium. Ellers skal du forberede musen til høst.
BEMÆRK: Sørg for, at musen allerede er vågen og kommer sig godt efter anæstesi, før du sætter den tilbage i buret. - Sluk for isofluran og ilt, rengør arbejdsområdet, og sluk for maskinen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne gelen fra transduceren.
2. Obduktion
BEMÆRK: Når der er mistanke om unormale hjertefænotyper ved hjælp af føtal ekkokardiografi, opsamles fostre og fikseres via nedsænkning i hele kroppen i fikseringsopløsningen: enten 10% bufret formalinphosphat eller 4% paraformaldehyd (PFA). Undersøg prøvens ydre og indre morfologi på udkig efter makroskopiske anatomiske abnormiteter eller misdannelser.
- Forbered musen.
- Hvis musen er voksen, skal du aflive musen ved hjælp af en standard CO2 -protokol. Brug tang eller dissekeresaks til at lave snit (ca. 3 cm) i lateral thorax og abdomen for at tillade indtrængning af fikseringsmidlet i de indre organer.
BEMÆRK: Prøven skal fastgøres i mindst 24 timer før obduktion, hvis embryoet er ældre end E14.5.
- Hvis musen er voksen, skal du aflive musen ved hjælp af en standard CO2 -protokol. Brug tang eller dissekeresaks til at lave snit (ca. 3 cm) i lateral thorax og abdomen for at tillade indtrængning af fikseringsmidlet i de indre organer.
- Analyser ydersiden af kroppen.
- Konfigurer softwaren til at gemme billederne med et navn, herunder prøvens identifikation, mikroskopforstørrelsen og billedets indhold.
BEMÆRK: Forstørrelse på 1,0x til 3,2x bør være tilstrækkelig til billeddannelse af de fleste strukturer i E14,5-mus eller ældre. - Placer musen på pladen under stereomikroskoplinsen. Fyld pladen med fosfatbufret saltvand (PBS) for at dække prøven fuldstændigt for at forhindre dehydrering og refleksion i billederne. Juster forstørrelsen, så skærmen omfatter hele embryoet, og tag derefter et billede af både venstre og højre side af embryoet.
BEMÆRK: Bunden af pladen skal være belagt med paraffin, silicium eller et andet sådant substrat for at lette fastgørelsen. - Fastgør prøven gennem halsen, vender opad, og tag et andet billede.
BEMÆRK: Vend stiften lidt opad for at sikre, at ingen vigtige strukturer i brysthulen gennembores.
- Konfigurer softwaren til at gemme billederne med et navn, herunder prøvens identifikation, mikroskopforstørrelsen og billedets indhold.
- Analyser brystet.
- Mens du løfter huden midt på halsen med tang, skal du klippe huden mod begge armhulerne med saksen, før du skærer huden langs medianaksen mod halen. Skær derefter huden fra navlen til benene. Fastgør prøven gennem håndled og ankler.
BEMÆRK: Vær omhyggelig med kun at skære huden. Det anbefales at holde saksens knive vandret eller vinklet opad. - For at bryde bindevævet væk skal du løfte huden med et par tang, mens du holder det underliggende væv på plads med det andet par. Fastgør prøven gennem huden for at hjælpe med at udsætte brystet og maven (figur 2).
BEMÆRK: For meget strækning under fastgørelse, skæring eller skrabning kan resultere i vævsskade. - Tag et billede af de udsatte muskler, og skrab derefter forsigtigt musklerne væk for at udsætte ribbenene.
- Tag et billede af de udsatte ribben. Adskil ribbenene fra membranen og skær ribbenene på begge sider så langt som muligt på sideaksen mod nakken.
- Udsæt hjertet ved at fjerne de afskårne ribben. Tag et billede af hjertet.
- Fjern thymus ved at skrælle det op med et par tang. Brug det andet par tang til at stabilisere bunden af thymus for at undgå at rive underliggende kar. Tag billeder af hjertet og de store kar.
BEMÆRK: Brug af stifter til at strække nogle tilstødende strukturer kan hjælpe med at få bedre billedvisninger. Derudover skal du tage separate billeder med fokus på de store arterier, hjerte og andre strukturer af interesse, da de måske ikke er i fokus sammen.
- Mens du løfter huden midt på halsen med tang, skal du klippe huden mod begge armhulerne med saksen, før du skærer huden langs medianaksen mod halen. Skær derefter huden fra navlen til benene. Fastgør prøven gennem håndled og ankler.
- Analyser maven.
- Træk membranen for at fjerne den og udsætte leveren. Tag et billede.
- Pin tilbage leveren for at udsætte maven og bugspytkirtlen. Tag et billede.
- Skær spiserøret. Fjern tyktarmen og tarmene ved at trække dem ud med tang. Skær lige over leveren og fjern den for at afsløre nyrerne og binyrerne. Tag et billede.
BEMÆRK: De fjernede organer skal opbevares i fikseringsopløsningen.
- Isoler thorax til ECM-analysen.
- Skær den nedre thorax langs en lige linje mellem leveren og lungerne. Skær hovedet højt nok til ikke at skære forgrenene af halspulsårerne.
- Fjern forsigtigt sideribbenene, mens du opretholder rygribbenene og rygsøjlen. Skræl op og skrab dorsalfedtet væk.
- Fjern thoraxen fra resten af kroppen og læg den i en 10% bufret formalinphosphatopløsning.
3. Indlejring
- Fikseringsmidlet dekanteres i en passende flaske med farligt affald. Prøverne vaskes med 1x PBS i 15 min tre gange.
- Brug stigende koncentrationer af ethanol og xylen til at dehydrere prøverne. Varigheden af alle følgende trin afhænger af embryonernes stadium. Se tabel 2 for yderligere oplysninger.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed ved skift af opløsninger for at undgå at beskadige prøverne. De optimale parametre til prøvebehandling kan empirisk justeres. Xylen vil opløse visse plastmaterialer; Der skal anvendes glasinstrumenter og beholdere. - Udskift xylen med paraffin i den ønskede varighed. Lad flaskerne ligge i en inkubator på 65 °C i en passende varighed (tabel 2).
- Brug frisk paraffin til at indlejre prøverne i den ønskede position.
BEMÆRK: Det anbefales at orientere prøven ind i midten af paraffinblokken med ryggen vendt mod toppen og den bageste side mod forsiden af blokken. Når du orienterer prøven, skal du huske, at prøven er indlejret med blokken vendt på hovedet.
4. Biskoppelig konfokal mikroskopi (ECM)
BEMÆRK: Efter passende indlejring gennemgår embryoner billedindsamling serielt via ECM til histopatologisk analyse. Individuelle dias kan genvindes fra mikrotomet til yderligere undersøgelser.
- Tag paraffinblokken ud af -20 °C fryseren, og fjern metalformene.
- Brug et barberblad til at trimme voksen på kanterne og bagsiden af kassetten. Skær voksen omkring prøven, indtil den er indkapslet i en lille firkant voks, der er fastgjort til kassetten.
BEMÆRK: Vær yderst forsigtig, når du håndterer knive. - Brug metalhåndtaget til at klemme paraffinblokken mod mikrotomets skæretrin. Vælg MAN-funktionen (manuel) i kørselstilstand, hæv paraffinens overflade tæt på bladet, og kør et par dias for at sikre, at bladet kommer i kontakt med paraffinblokken.
- Åbn LAS AF-applikationen , og vælg MatrixScreener. Vælg Single Regular Matrix , og indlæs den relevante tidligere gemte skabelon. Klik på Quick LUT-knappen for at skifte til hvid og orange ombre.
- Vælg Konfigurer job , og træk den synlige laser på 405 nm til det maksimale. Match venstre kant af spektrumblokken til 405 nm-linjen, og træk højre kant til 800 nm-linjen. Marker indstillingen Pinhole , og start Live View.
- Juster placeringen af laserprojektionen for at centrere prøven på skærmen, og juster zoomknappen til ~ 20x. For at optimere opløsningen skal du indstille forstærkningen til 1.250 V og maksimere det blå område ved hjælp af fokusknappen; nulstil derefter forstærkningen til ca. 750 V til billeddannelse.
BEMÆRK: Specifikke værdier kan variere afhængigt af embryoets tilstand. - Skift skæremetoden til Auto, indstil tykkelsen til omkring 50 μm, og kør diasene. Stop med at skære, når lungerne og luftvejene er synlige.
- Vælg en skæretykkelse mellem 8-10 μm, og stop Live View. Åbn Microtome Communicator for at starte billeddannelsen. Sørg for, at den midlertidige lagermappe er tom, før du indsamler billeder.
- Stop med at skære, når der ikke visualiseres yderligere hjertestruktur. Luk Microtome Communicator-programmet , og eksporter den midlertidige fil til en .tiff billedserie via billedbehandlingssoftwaren til senere 3D-rekonstruktioner.
5. Tredimensionel (3D) rekonstruktion
BEMÆRK: Formålet med 3D-rekonstruktion er at behandle en 2D-billedstak fra ECM-billeddannelse til 3D-videoer i koronal, sagittal og tværgående orientering og at bruge 3D-videoerne til diagnose af de strukturelle og anatomiske abnormiteter i prøverne.
- Åbn ECM-billedstakken i billedbehandlingssoftwaren.
- Træk og slip billedet filerne i billedbehandlingssoftwaren. Spejlvend ECM-billederne vandret ved at vælge Billede > Transformér > Spejlvend vandret på menulinjen.
- Gem det spejlvendte billede, og luk billedbehandlingssoftwaren.
- Importer ECM-billedstakken i DICOM-visningssoftwaren.
- Træk og slip de vandret vendte ECM-billeder i DICOM-visningssoftwaren. Sørg for, at der er en lyseblå kant omkring eksempellisten, ellers kan der føjes billeder til en eksisterende eksempelmappe.
- Vælg de links eller filer, der skal kopieres til databasen, når pop op-vinduet vises. Der vises et nyt eksempel på eksempellisten med samme navn som den fil, der kopieres til DICOM-visningssoftwaren.
- Klik på den nyligt tilføjede fil for at åbne den.
- Udfør 3D-rekonstruktion.
- Når filen er åbnet, skal du klikke på menuen 2D / 3D Reconstruction Tools fra værktøjslinjen og vælge 3D MPR.
- For Pixel X-opløsning og Pixel Y-opløsning skal du indtaste billedopløsningen ved at angive den zoom, der bruges under ECM-billeddannelse. For udsnitsintervallet skal du indtaste den udsnitstykkelse, der bruges til at skære under ECM-billeddannelse.
BEMÆRK: Kameraopløsningen ændres afhængigt af kameraets zoom og kan variere fra kamera til kamera.
- Brug de forskellige værktøjer fra fanen Værktøjer i venstre side til at justere billedstakke efter ønske.
- Brug WW/WL-værktøjet til at justere vinduesbredde og vinduesniveau. Klik og træk værktøjet på billedet opad for at reducere billedets lysstyrke og nedad for at øge det. Klik og træk værktøjet på billedet til højre for at mindske billedkontrasten og til venstre for at øge den.
BEMÆRK: De optimale WW/WL-indstillinger for én struktur kan være suboptimale for en anden. Af denne grund anbefales det at oprette separate videoer for at se forskellige strukturer. - Brug panoreringsværktøjet til at trække billederne til de ønskede positioner. Brug zoomværktøjet til at forstørre eller formindske billedet efter behov og rotationsværktøjet til at rotere billedet efter behov.
BEMÆRK: Forstørrelse af billeder kan medføre nedsat billedkvalitet. Vær forsigtig, når du roterer billeder, da det kan få akserne til at vende.
- Brug WW/WL-værktøjet til at justere vinduesbredde og vinduesniveau. Klik og træk værktøjet på billedet opad for at reducere billedets lysstyrke og nedad for at øge det. Klik og træk værktøjet på billedet til højre for at mindske billedkontrasten og til venstre for at øge den.
- Klik og træk den farvede akse i det første panel. Bemærk, hvordan rotation af denne akse ændrer retningen af de to andre paneler. Drej de tre panelers akser, indtil de tre paneler repræsenterer koronale, sagittale og tværgående visninger af prøven.
BEMÆRK: Mens prøverne orienteres, skal du opretholde korrekt anterior/posterior orientering. - Generer videoer.
- Når alle tre paneler er korrekt placeret, orienteret og lysere, skal du klikke på panelet, der repræsenterer koronalvisningen.
- Klik på Filmeksport i højre side af menulinjen. Klik på Batch , og træk skyderne Fra og Til for at omfatte hele interesseområdet. For Interval skal du vælge indstillingen Samme som tykkelse . Gem videoen, der angiver visningens retning.
- Gennemgå videoen for at se, om de interessante strukturer kan identificeres tilstrækkeligt. Hvis ikke, skal du bruge værktøjerne (trin 5.4) til at justere videoerne efter behov og gemme videoen igen.
- Gentag trin 5.6 for tværgående og sagittale visninger. Diagnostiser prøverne ved hjælp af rekonstruerede videoer.
BEMÆRK: Se omhyggeligt videoerne i hver retning for at foretage en fuldstændig vurdering af, om prøven udviser anatomiske abnormiteter eller sygdomsfænotyper (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Museembryonerne med signifikante hæmodynamiske defekter blev bemærket at være embryonale dødelige. En bred vifte af CHD'er kan identificeres gennem det højtydende, ikke-invasive føtale ekkokardiogram ved hjælp af forskellige synspunkter (figur 1).
Septale defekter: De mest almindelige CHD'er er septumdefekter såsom en ventrikulær septumdefekt (VSD), en atrioventrikulær septaldefekt (AVSD) og en atriel septumdefekt (ASD)1. VSD eller AVSD kan nemt visualiseres ved hjælp af 2D-billeder og farveflowbilleder. Blodgennemstrømning over ventriklerne eller mellem atrierne og ventriklerne kan let identificeres (figur 3). ASD er svært at skelne med patent foramen ovale i et foster.
Anomalier i udstrømningskanalen: Som vist i figur 3 er strømmen i hovedlungearterien over den stigende aorta-strøm i normale embryoner. I embryoner med et dobbelt udløb af højre ventrikel (DORV) kan begge store arterier ses som følge af højre ventrikel. DORV er også forbundet med VSD (figur 3D) og kan identificeres ved hjælp af farveflow. På grund af embryonernes lille størrelse kan DORV undertiden ikke pålideligt skelnes fra tilsidesættelse af aorta, lungeatresi eller vedvarende truncus arteriosus (PTA). I PTA kan kun en udstrømningskanalstrøm ses i føtal ekkokardiogram (figur 3E). Den detaljerede buestruktur og hovedlungearterien kan observeres ved hjælp af obduktion (figur 2E, F).
Obduktion kan hurtigt diagnosticere situs status i brystet og maven og hjertepositionen i forhold til brystet (enten levocardia (figur 2C-E) eller dextrokardi). Udstrømningskanalstrukturer og den relative størrelse af både atrier og ventrikler kan let visualiseres (figur 2E, F).
ECM histopatologi er guldstandardteknikken til vurdering af enhver strukturel hjerteanomali 8,11,12. Det giver en uovertruffen opløsning og detaljer til embryonernes strukturer. Tredimensionel rekonstruktion ved hjælp af forskellige planer og synspunkter kan let identificere forholdet mellem de store arterier og ventrikler (figur 3) og defekten mellem ventriklerne og atrierne.
Figur 1: Placeringerne til måling af krone-rumpelængden i 2D-ekkokardiogrambilleder af embryoner for at bestemme svangerskabsalderen. 2D-ekkokardiogrambilleder af embryoner ved (A) E11.5, (B) E12.5, (C,D) E13.5-E14.5. (D) Det syge embryo er mindre end dets (C) søskende og er noteret for at have et "grødet" udseende med hydrops (pil). (A-C) Levende embryoner udviser forskellige organer. Repræsentativ VB-tilstand med farvebilleder af E14.5-hjertet i et koronalt 4-kammerbillede vippet anteriort for at afbilde (E) udstrømningskanalerne viser intakt ventrikulær septum med det normale forhold mellem store arterier, hvilket bekræftes med ECM i (E') koronal visning. (F) Repræsentativt sagittalbillede af E14.5-hjertet demonstrerer venstre ventrikulære og højre ventrikulære udstrømningskanaler med den stigende aorta (AO) spids kranialt og lungearterien pegende bagud (mod rygsøjlen), hvilket bekræftes med ECM i (F') sagittal visning. (G) Repræsentativt tværbillede af venstre ventrikel (LV) og højre ventrikel (RV), hvilket bekræftes med ECM i (G') tværbillede. (H) Et tværbillede i bunden af hjertet i ECM viser en tydelig og adskilt aortaklapp (AV) og lungeklap (PV). PV er anterior til AV. (H') Repræsentativt ECM tværgående billede af vedvarende truncus arteriosus (PTA) viser venstre lungearterie og højre lungearterie, der opstår posteriort fra den udelte vedvarende truncal arterie, med venstre halspulsåre, der opstår anteriort og kranielt fra den vedvarende truncal arterie. Forkortelser: A: anterior, AO: aorta, AV: aortaklappen, Cd: kaudal, Cr: kranial, DAO: faldende aorta, L: venstre, LA: venstre atrium, LCA: venstre halspulsåre, LPA: venstre lungearterie, LV: venstre ventrikel, P: posterior, PA: lungearterie, PTA: vedvarende truncus arteriosus, R: højre, RA: højre atrium, RPA: højre lungearterie, RV: højre ventrikel. Vægtstang: 0,5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative billeder af en obduktion for at observere kardiovaskulære abnormiteter . (A) Et embryo fastgjort til en dissekerskål med sort baggrund uden åbenlyse fænotyper. Billedet viser hovedets grove anatomi, digitaler, brysthule og mave. (B) Dermis fjernes fra hvalpen og afslører submandibulære kirtler, brystkasse og mave. (C) Brystkassen løftes og afslører brysthulenes grove anatomi, herunder thymus, hjerte, lunger og membran. (D) Et zoomet billede af brystet med brystkassen fjernet. (E) Thymus fjernes og afslører store kar og luftrør. (F) En zoomet visning af store fartøjer. Forkortelser: AAO: stigende aorta, D: membran, LA: venstre atrium, LCA: venstre halspulsåre, LSVC: venstre overlegen vena cava, LV: venstre ventrikel, P: perikardium, RA: højre atrium, Rb: ribben, RCA: højre halspulsåre, RL: højre lunge, RSVC: højre overlegen vena cava, RV: højre ventrikel, S: brystben, SCA: højre subklaviske arterie, SMG: submandibulære kirtler, T: luftrør, Th: thymus. Vægtstang: 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativt føtalt ekkokardiogram (ekko) og billeder fra biskoppeligt konfokalmikroskop (ECM). (A) Ekko demonstrerer en intakt ventrikulær septum uden en interventrikulær shunt og normalt relaterede store arterier i den normale kontrol, bekræftet af (A') ECM på E14,5-15,5 stadiet. (B) Ultralydspåvisning af en atrioventrikulær septumdefekt (AVSD). Ekkobilleder i 4-kammerbilledet viser kommunikationen mellem LA, RA, LV og RV, bekræftet af (B') ECM på E14.5-stadiet. (C) Ultralyddiagnose af ventrikulær septumdefekt (VSD) med farveflow demonstrerer strømmen over LV og RV, bekræftet af (C') ECM på E16.5-stadiet. (D) Echo og (D') ECM demonstrerer DORV med en VSD mellem LV og RV med side-by-side store arterier (aorta er lige til lungearterien) på E14.5-stadiet. (E) Ultralyddiagnose af vedvarende truncus arteriosus (PTA) demonstrerer kommunikation mellem LV og RV med en enkelt udstrømningskanal, der tilsidesætter begge ventrikler (PTA). (E') Denne patologi bekræftes af ECM på E14.5-trinnet. Skalastang: 0,5 mm. AO: aorta, AVSD: atrioventrikulær septal defekt, Cd: kaudal, Cr: kranial, L: venstre, LA: venstre atrium, LV: venstre ventrikel, PA: lungearterie, PTA: vedvarende truncus arteriosus, R: højre, RA: højre atrium, RV: højre ventrikel, VSD: ventrikulær septumdefekt. Vægtstang: 0,5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Stadie | Krone-til-rumpe længde (mm) | Fostrets areal (mm2) | Hjerteområde (mm2) | Hjerteområde/fosterområde |
| E12.5 | 7,9 ± 0,8 (n = 77) | 23,2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13.5 | 10,5 ± 0,9 (n = 92) | 40,9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14.5 | 12,5 ± 0,9 (n = 101) | 57,6 ± 8 (n = 101) | 2,9 ± 0,5 (n = 70) | 0,050 ± 0,004 (n = 70) |
| E15.5 | 14,1 ± 0,5 (n = 134) | 71,4 ± 6 (n = 134) | 3,8 ± 0,4 (n = 87) | 0,053 ± 0,004 (n = 87) |
| E16.5 | 15,4 ± 0,6 (n = 112) | 82,7 ± 6 (n = 112) | 4,9 ± 0,5 (n = 87) | 0,058 ± 0,007 (n = 87) |
| E17.5 | 16,6 ± 0,4 (n = 211) | 96,9 ± 7 (n = 211) | 6,1 ± 0,6 (n = 146) | 0,063 ± 0,004 (n = 146) |
| E18.5 | 17,7 ± 0,6 (n = 139) | 112,1 ± 8 (n = 139) | 7,1 ± 0,8 (n = 93) | 0,063 ± 0,005 (n = 93) |
| E19.5 | 18,7 ± 0,7 (n = 57) | 126,7 ± 8 (n = 57) | 7,7 ± 0,7 (n = 36) | 0,062 ± 0,005 (n = 36) |
Tabel 1: Udviklingsprofil for fostervækst.
| E14.5 | E16.5 | E18.5 | Nyfødt | |
| 70% ethanol | 1 time | 1,5 timer | 3 timer | 4 timer |
| 95% ethanol | 35 minutter | 45 minutter | 1 time | 1 time |
| 95% ethanol | 35 minutter | 45 minutter | 1 time | 1 time |
| 100% ethanol | 15 minutter | 15 minutter | 30 minutter | 6 minutter |
| Xylen 1 | 20 minutter | 30 minutter | 40 minutter | 30 minutter |
| Xylen 2 | 20 minutter | 30 minutter | 40 minutter | 30 minutter |
| Voks 1 | 20 minutter | 20 minutter | 20 minutter | 30 minutter |
| Voks 2 | 20 minutter | 20 minutter | 20 minutter | 30 minutter |
| Voks 3 | Natten over | Natten over | Natten over | Natten over |
Tabel 2: Protokol for embryoindlejring baseret på embryonale dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisk modificerede mus er blevet brugt til at forstå patomekanismerne ved medfødte hjertefejl. De protokoller, vi leverer i denne undersøgelse, forsøger at strømline og standardisere processen med vurdering af murine føtale hjertefejl. Der er dog kritiske trin at bemærke under protokollen. Musembryoner vokser betydeligt i løbet af hver svangerskabsdag, og det korrekte tidspunkt at høste en mus kan bestemmes ved at udføre et føtalt ekkokardiogram nøjagtigt. Fostrets ekkokardiogram kan bruges til at screene fostrets kardiovaskulære patologi. Et 2D-billede gør det muligt at identificere unormal anatomi og hjertefunktion ved hjælp af farve Doppler til at undersøge blodgennemstrømningen og detektere enhver kommunikation mellem hjertets kamre eller unormale udstrømnings- og tilstrømningskanaler. For at bestemme CHD-diagnosen scannes fostre fra embryonal dag E14.5, når udstrømningskanalseptationen og hjertekammerdannelsen er afsluttet. Scanning på tidligere stadier kan afspejle udviklingsforsinkelsen.
Histopatologi er standarden til at karakterisere CHD'er8 ved hjælp af et mikrotomt efterfulgt af optisk mikroskopvisualisering. Den største ulempe ved standardmetoden er manglen på en intuitiv 3D-visning af de kardiovaskulære strukturer til diagnose og begrænsningen i manglen på at give forskellige visninger af prøverne. En ECM-histologi er den mest tidseffektive metode til at karakterisere hjertefejl. Hvis ECM ikke er tilgængelig, kan et mikrotomt bruges til at sektionere embryoet og bestemme hjertefænotyper. Andre muligheder for at opnå hjertebilleddannelse udfører høj gennemstrømning, magnetisk resonansbilleddannelse med høj opløsning (MRI) eller computertomografi (CT). Et centralt aspekt af MR eller CT er, at flere embryoner kan afbildes samtidigt; Men selv efter en ultralyd, CT eller MR-fænotypning er histopatologi nødvendig for at bekræfte enhver CHD-diagnose.
Ved hjælp af ECM-billeddannelse til histopatologi afbildes embryoet serielt efter hvert snit ved hjælp af et laserscanningskonfokalmikroskop monteret over det automatiske glidende mikrotom. De individuelle billeder indsamlet fra ECM giver mulighed for efterfølgende 3D-rekonstruktioner og gør det muligt at skære prøverne digitalt i ethvert billedplan uden at tage billederne 8,11 igen. En sådan operation muliggør en omfattende vurdering af hjerteanatomien, som kan anvendes i forskellige udviklingsstadier. Desuden kunne individuelle dias gendannes fra mikrotomet, mens dataene fra ECM-udstyret blev indsamlet. Selvom ECM-histopatologi er guldstandarden til vurdering af enhver strukturel hjerteanomali, er der begrænsninger med tilgængeligheden af udstyr, software og driftstid pr. Embryo. Køretiden for at sektionere et embryonalt hjerte kan variere fra 1-3 timer pr. Prøve afhængigt af dens størrelse. På grund af udstyrets kompleksitet skal forskere regelmæssigt kontrollere computeren for at sikre, at interesseområdet inden for feltet registreres. Forskere skal også kontrollere prøven for at sikre, at ingen paraffinvoksspåner forhindrer prøven fra laserscanneren.
ECM og efterfølgende 3D-rekonstruktion giver en komplet højopløsningsvurdering af enhver strukturel hjertefejl uanset prøvens indlejringsplan. Disse protokoller har bidraget til med succes at diagnosticere en række CHD'er og gjort det muligt for os at forstå hjerteembryogenesen i murinmodeller og patologier relateret til genetiske mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter i dette manuskript.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
