Summary
Cet article détaille les méthodes de diagnostic des cardiopathies congénitales (CHD) murines utilisant l’échocardiographie fœtale, la nécropsie et la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de la microscopie confocale épiscopique (ECM) suivie d’une reconstruction tridimensionnelle (3D).
Abstract
Les cardiopathies congénitales (CHD) sont les principales causes de mortalité infantile aux États-Unis. Dans les années 1980 et plus tôt, la plupart des patients atteints de coronaropathie modérée ou sévère mouraient avant l’âge adulte, avec la mortalité maximale au cours de la première semaine de vie. Des progrès remarquables dans les techniques chirurgicales, les approches diagnostiques et la prise en charge médicale ont conduit à des améliorations marquées des résultats. Pour répondre aux besoins de recherche critiques de la compréhension des malformations cardiaques congénitales, les modèles murins ont fourni une plate-forme de recherche idéale, car ils ont une anatomie cardiaque très similaire à celle des humains et des taux de gestation courts. La combinaison du génie génétique avec des outils de phénotypage à haut débit a permis la réplication et le diagnostic des malformations cardiaques structurelles afin d’élucider davantage les voies moléculaires derrière les maladies coronariennes. L’utilisation de l’échocardiographie fœtale non invasive pour dépister les phénotypes cardiaques dans des modèles murins, associée à la haute fidélité de la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de l’histopathologie de microscopie confocale épiscopique (ECM) avec reconstructions tridimensionnelles (3D) permet une vue détaillée de l’anatomie de diverses malformations cardiaques congénitales. Ce protocole décrit un flux de travail complet de ces méthodes pour obtenir un diagnostic précis des malformations cardiaques congénitales murines. L’application de ce protocole de phénotypage à des organismes modèles permettra un diagnostic précis de coronaropathie, ce qui permettra de mieux comprendre les mécanismes de la coronaropathie. L’identification des mécanismes sous-jacents de la coronaropathie offre des possibilités de thérapies et d’interventions potentielles.
Introduction
Les cardiopathies congénitales (cardiopathies) sont l’anomalie congénitale néonatale la plus courante 1,2, touchant environ 0,8 % à 1,7 % des nouveau-nés et entraînant une mortalité et une morbidité néonatales importantes3. Une étiologie génétique est fortement indiquée avec les cardiopathies congénitales 4,5. Les modèles murins génétiquement modifiés ont été largement utilisés pour comprendre la complexité des maladies coronariennes et les mécanismes qui les provoquent en raison du fait que les souris ont des cœurs à quatre chambres et des séquences d’ADN de développement cardiaque comparables chez les fœtus de souris et humains6. L’identification du phénotype des mutants de souris est la première étape fondamentale dans la caractérisation de la fonction du gène ciblé. Les modèles murins exprimant les effets de dosage des gènes, dans lesquels une seule mutation génétique peut entraîner un spectre de malformations cardiaques qui imitent les maladies coronariennes humaines, sont importants pour comprendre la complexité des maladies coronariennes et les mécanismes qui les provoquent.
Cet article décrit un pipeline pour caractériser les phénotypes cardiaques dans des modèles murins. Les méthodes appliquées utilisent l’échocardiogramme fœtal 7, suivi de la nécropsie et de l’histopathologie ECM 7,8, qui peut afficher l’anatomie détaillée des phénotypes cardiaques murins en développement. Un échocardiogramme fœtal est une modalité non invasive qui permet la visualisation directe de plusieurs embryons avec une résolution d’imagerie raisonnable. En outre, un échocardiogramme fœtal permet de déterminer rapidement le nombre total d’embryons dans une portée, leurs stades de développement, ainsi que l’orientation et l’emplacement relatifs dans la corne utérine. À l’aide d’un Doppler spectral / flux de couleur, les embryons anormaux peuvent être identifiés en fonction de la structure, de la perturbation hémodynamique, du restriction de croissance ou du développement de l’hydrops. Étant donné qu’une étude d’échocardiogramme fœtal est une technique non invasive, elle peut être utilisée pour scanner sur plusieurs jours et pour observer les changements dans l’hémodynamique ou la morphologie cardiaque. L’obtention d’une imagerie de haute qualité des échocardiogrammes fœtaux nécessite de la pratique et des compétences, car des malformations cardiaques spécifiques peuvent être manquées en raison d’un manque d’expérience et de connaissances. Pour cette raison, une analyse plus définitive de la morphologie cardiaque peut être obtenue par une combinaison de nécropsie et d’histopathologie ECM. L’autopsie permet de visualiser directement la structure de l’arcade, les relations relatives de l’aorte et de l’artère pulmonaire, la taille des ventricules et des oreillettes, la position du cœur par rapport à la poitrine et les structures bronchopulmonaires. Cependant, les caractéristiques intérieures telles que les valves cardiaques et l’épaisseur de la paroi peuvent être difficiles à évaluer par nécropsie seule. Ainsi, l’histopathologie ECM est recommandée pour un diagnostic concluant. L’histopathologie ECM est une technique de visualisation haute résolution qui permet à la fois la reconstruction 2D et 3D de la pile d’images9. Ces images sont obtenues par imagerie fluorescente épiscopique en série d’un échantillon incorporé dans de la paraffine lorsqu’il est sectionné finement à intervalle constant par un microtome automatique. Contrairement à l’histologie classique, les images sont capturées sous forme de section avant d’être découpées du bloc de sorte que toutes les images sont capturées dans le même cadre de référence. Pour cette raison, la pile d’images 2D produite par l’histopathologie ECM peut être facilement et de manière fiable reconstruite en trois dimensions. Cela se fait à l’aide d’une visionneuse DICOM, qui permet la visualisation 3D des images dans les trois plans anatomiques: coronal, sagittal et transversal. À partir de ces reconstructions 3D haute résolution, un diagnostic cardiaque définitif peut être posé. L’application de ces trois différentes modalités de visualisation, individuellement ou en combinaison, peut fournir des caractérisations précises des malformations cardiaques structurelles chez les embryons de souris.
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Protocol
L’utilisation de souris pour ces études est nécessaire car les souris ont des cœurs à quatre chambres qui peuvent imiter les cardiopathies congénitales humaines. Les souris ont reçu des soins vétérinaires et ont été hébergées dans l’établissement de soins aux animaux accrédité par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) de l’établissement. Des protocoles stricts ont été suivis pour minimiser l’inconfort, le stress, la douleur et les blessures des souris. Des souris ont été euthanasiées à l’aide de gaz CO2 , ce qui est acceptable pour les petits rongeurs selon les directives de l’American Veterinary Medical Association sur l’euthanasie. Les études sur les souris de ce manuscrit ont été réalisées avec un protocole IACUC approuvé à l’Université de Pittsburgh.
1. Échocardiogramme fœtal
REMARQUE: Un échocardiogramme est un outil puissant pour identifier les malformations cardiovasculaires et les anomalies extracardiaques chez la souris. En raison de la petite taille des embryons de souris (environ 1-2 mm à mi-gestation, 3,5 mm à la naissance), un équipement échocardiographique à ultra-haute fréquence avec biomicroscopie par ultrasons (UBM) est nécessaire. UBM fournit différentes sondes haute fréquence (30-50 MHz) avec une petite fenêtre d’imagerie (15 mm x 14 mm) qui fournit la résolution (30 μm axiale x 68 μm latéral) pour visualiser un fœtus de souris à la fois. Un transducteur de 40 MHz fournit des images haute résolution pour identifier les phénotypes cardiovasculaires7.
- Allumez l’appareil d’échocardiogramme et sélectionnez le programme Cardiologie.
REMARQUE: Le protocole suivant peut être utilisé pour n’importe quel fond de souris du jour embryonnaire (E) 14.5 à 19.5. - Anesthésiez la souris désirée dans une chambre d’induction anesthésique. Induire l’anesthésie en utilisant une concentration de 4% d’isoflurane et d’oxygène médical à un débit de 1 L / min et la réduire à 2%-3% pour l’entretien.
- Placez rapidement la souris sur la plate-forme d’imagerie. La plate-forme d’imagerie a chauffé de l’acier pour garder la souris au chaud pendant la procédure. Mettez la bouche et le nez de la souris dans le cône nasal anesthésique. Fixez les membres avec du ruban adhésif pour éviter les mouvements. Surveillez la fréquence cardiaque pour vous assurer qu’elle reste entre 400 et 450 bpm.
- Surveillez la température à l’aide d’une sonde de thermomètre rectal et assurez-vous qu’elle repose à 37 °C ± 0,5 °C. Surveillez la respiration pour éviter l’hypoxie. Gardez une légère force sur la sonde pour éviter les dommages.
REMARQUE: Une lampe chauffante peut être placée au-dessus de la souris pour prévenir l’hypothermie et pour récupérer de l’anesthésie. La pommade ophtalmique Petrolatum peut être utilisée comme lubrifiant pour éviter les yeux secs. - Retirez la fourrure du thorax et de l’abdomen à l’aide d’une crème dépilatoire. Appliquez la crème et attendez 3 min avant de la retirer. Nettoyez la zone avec de l’éthanol à 70%. L’éthanol fonctionne mieux que l’eau comme lubrifiant de rasage.
- Réchauffez le gel à ultrasons à une température corporelle normale. Appliquez généreusement le gel à ultrasons et placez le transducteur sur l’abdomen pour l’orienter dans un plan horizontal et identifier la vessie sur l’écran. Une fois la vessie identifiée, balayez crânienne de la vessie et recherchez le fœtus. Mesurer la longueur de la couronne à la croupe pour déterminer l’âge gestationnel10 (figure 1 et tableau 1).
REMARQUE : Modifiez la position du transducteur pour visualiser différents plans, y compris les plans d’imagerie transversaux à quatre chambres, sagittal et frontal/coronal7 (Figure 1). - Utilisez la couleur Doppler pour analyser le flux sanguin du cœur.
- Remettez la souris dans la cage si les embryons n’ont pas atteint le stade prévu. Sinon, préparez la souris pour la récolte.
REMARQUE: Assurez-vous que la souris est déjà éveillée et se remet bien de l’anesthésie avant de la remettre dans la cage. - Éteignez l’isoflurane et l’oxygène, nettoyez la zone de travail et éteignez la machine.
REMARQUE: Il est important de retirer le gel du transducteur.
2. Nécropsie
REMARQUE: Une fois que des phénotypes cardiaques anormaux sont suspectés par échocardiographie fœtale, les fœtus sont recueillis et fixés par immersion du corps entier dans la solution fixatrice: soit 10% de phosphate de formol tamponné ou 4% de paraformaldéhyde (PFA). Inspecter la morphologie externe et interne de l’échantillon, à la recherche d’anomalies anatomiques macroscopiques ou de malformations.
- Préparez la souris.
- Si la souris est adulte, euthanasiez-la à l’aide d’un protocole standard de CO2 . Utilisez des pinces ou des ciseaux à dissection pour faire des incisions (environ 3 cm) dans le thorax latéral et l’abdomen afin de permettre la pénétration du fixateur dans les organes internes.
REMARQUE : L’échantillon doit être fixé pendant au moins 24 heures avant l’autopsie si l’embryon est plus âgé que E14.5.
- Si la souris est adulte, euthanasiez-la à l’aide d’un protocole standard de CO2 . Utilisez des pinces ou des ciseaux à dissection pour faire des incisions (environ 3 cm) dans le thorax latéral et l’abdomen afin de permettre la pénétration du fixateur dans les organes internes.
- Analysez l’extérieur du corps.
- Configurez le logiciel pour enregistrer les images avec un nom, y compris l’identification de l’échantillon, l’agrandissement du microscope et le contenu de l’image.
REMARQUE: Un grossissement de 1,0x à 3,2x devrait être suffisant pour l’imagerie de la plupart des structures chez les souris E14.5 ou plus anciennes. - Placez la souris sur la plaque sous la lentille du stéréomicroscope. Remplissez la plaque avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour couvrir complètement l’échantillon afin d’éviter la déshydratation et la réflexion sur les images. Ajustez le grossissement de sorte que l’écran comprenne l’embryon entier, puis prenez une photo des côtés gauche et droit de l’embryon.
REMARQUE: Le fond de la plaque doit être recouvert de paraffine, de silicium ou d’un autre substrat pour faciliter l’épinglage. - Épinglez l’échantillon dans sa gorge, face vers le haut, et prenez une autre photo.
REMARQUE: Orientez la broche légèrement vers le haut pour vous assurer qu’aucune structure importante de la cavité thoracique n’est percée.
- Configurez le logiciel pour enregistrer les images avec un nom, y compris l’identification de l’échantillon, l’agrandissement du microscope et le contenu de l’image.
- Analysez la poitrine.
- Tout en soulevant la peau au milieu du cou avec une pince, coupez la peau vers les deux aisselles avec les ciseaux avant de couper la peau le long de l’axe médian vers la queue. Ensuite, coupez la peau de l’ombilic aux jambes. Épinglez l’échantillon à travers ses poignets et ses chevilles.
REMARQUE: Veillez à ne couper que la peau. Il est recommandé de tenir les lames des ciseaux horizontalement ou inclinées vers le haut. - Pour détacher le tissu conjonctif, soulevez la peau avec une paire de forceps tout en maintenant le tissu sous-jacent en place avec l’autre paire. Épinglez l’échantillon à travers la peau pour aider à exposer la poitrine et l’abdomen (Figure 2).
REMARQUE: Trop d’étirement lors de l’épinglage, de la coupe ou du grattage peut entraîner des lésions tissulaires. - Prenez une photo des muscles exposés, puis grattez doucement les muscles pour exposer les côtes.
- Prenez une photo des côtes exposées. Séparez les côtes du diaphragme et coupez les côtes des deux côtés aussi loin que possible sur l’axe latéral vers le cou.
- Exposez le cœur en enlevant les côtes coupées. Prenez une photo du cœur.
- Retirez le thymus en le pelant avec une paire de pinces. Utilisez l’autre paire de pinces pour stabiliser la base du thymus afin d’éviter de déchirer les vaisseaux sous-jacents. Prenez des photos du cœur et des grands vaisseaux.
REMARQUE: L’utilisation de broches pour étirer certaines structures adjacentes peut aider à obtenir de meilleures vues d’imagerie. De plus, prenez des photos séparées axées sur les grandes artères, le cœur et d’autres structures d’intérêt, car elles peuvent ne pas être nettes ensemble.
- Tout en soulevant la peau au milieu du cou avec une pince, coupez la peau vers les deux aisselles avec les ciseaux avant de couper la peau le long de l’axe médian vers la queue. Ensuite, coupez la peau de l’ombilic aux jambes. Épinglez l’échantillon à travers ses poignets et ses chevilles.
- Analysez l’abdomen.
- Tirez sur le diaphragme pour l’enlever et exposer le foie. Prenez une photo.
- Épinglez le foie pour exposer l’estomac et le pancréas. Prenez une photo.
- Coupez l’œsophage. Enlevez le côlon et les intestins en les tirant avec une pince. Coupez juste au-dessus du foie et retirez-le pour révéler les reins et les glandes surrénales. Prenez une photo.
NOTE: Les organes prélevés doivent être conservés dans la solution fixatrice.
- Isolez le thorax pour l’analyse ECM.
- Coupez le thorax inférieur le long d’une ligne droite entre le foie et les poumons. Coupez la tête assez haut pour ne pas couper les ramifications des artères carotides.
- Retirez délicatement les côtes latérales tout en maintenant les côtes dorsales et la colonne vertébrale. Pelez et grattez la graisse dorsale.
- Détachez le thorax du reste du corps et placez-le dans une solution tamponnée au formol à 10%.
3. Intégration
- Décanter le fixateur dans une bouteille de déchets dangereux appropriée. Lavez les échantillons avec 1x PBS pendant 15 min trois fois.
- Utilisez des concentrations croissantes d’éthanol et de xylène pour déshydrater les échantillons. La durée de toutes les étapes suivantes dépend du stade des embryons. Veuillez consulter le tableau 2 pour plus de détails.
NOTE: Des précautions doivent être prises lors du changement de solutions pour éviter d’endommager les échantillons. Les paramètres optimaux pour le traitement des échantillons peuvent être ajustés empiriquement. Le xylène dissout certains plastiques; Des instruments et des récipients en verre doivent être utilisés. - Remplacer le xylène par de la paraffine pendant la durée souhaitée. Laisser les bouteilles dans un incubateur à 65 °C pendant la durée appropriée (tableau 2).
- Utilisez de la paraffine fraîche pour incorporer les échantillons dans la position souhaitée.
NOTE: Il est recommandé d’orienter l’échantillon au milieu du bloc de paraffine, avec sa face dorsale vers le haut et la face postérieure vers l’avant du bloc. Lorsque vous orientez l’échantillon, n’oubliez pas que l’échantillon est incorporé avec le bloc à l’envers.
4. Microscopie confocale épiscopique (ECM)
REMARQUE: Après une intégration appropriée, les embryons subissent une collecte d’images en série via ECM pour l’analyse histopathologique. Des lames individuelles peuvent être récupérées à partir du microtome pour des études plus approfondies.
- Sortez le bloc de paraffine du congélateur à -20 °C et retirez les moules métalliques.
- Utilisez une lame de rasoir pour couper la cire sur les bords et à l’arrière de la cassette. Couper la cire entourant l’échantillon jusqu’à ce qu’elle soit enfermée dans un petit carré de cire attaché à la cassette.
REMARQUE: Faites preuve d’une extrême prudence lorsque vous manipulez des lames. - Utilisez le levier métallique pour serrer le bloc de paraffine contre l’étape de tranchage du microtome. Sélectionnez la fonction MAN (manuelle) en mode Exécution, relevez la surface de la paraffine près de la lame et exécutez quelques diapositives pour vous assurer que la lame entre en contact avec le bloc de paraffine.
- Ouvrez l’application LAS AF et sélectionnez MatrixScreener. Sélectionnez Single Regular Matrix et chargez le modèle approprié précédemment enregistré. Cliquez sur le bouton Quick LUT pour passer à l’ombre blanche et orange.
- Sélectionnez Configurer les tâches et faites glisser le laser visible de 405 nm au maximum. Faites correspondre le bord gauche du bloc de spectre à la ligne de 405 nm et faites glisser le bord droit vers la ligne de 800 nm. Cochez l’option Sténopé et démarrez la vue En direct .
- Ajustez la position de la projection laser pour centrer l’échantillon sur l’écran et réglez le bouton de zoom à ~20x. Pour optimiser la résolution, réglez le gain sur 1 250 V et maximisez la zone bleue à l’aide du bouton de mise au point ; Ensuite, réinitialisez le gain à environ 750 V pour l’imagerie.
REMARQUE: Les valeurs spécifiques peuvent varier en fonction de l’état de l’embryon. - Basculez la méthode de coupe sur Auto, définissez l’épaisseur à environ 50 μm et exécutez les glissières. Arrêtez de couper lorsque les poumons et les voies respiratoires sont en vue.
- Choisissez une épaisseur de coupe comprise entre 8 et 10 μm et arrêtez la vue En direct . Ouvrez Microtome Communicator pour démarrer l’imagerie. Assurez-vous que le dossier de stockage temporaire est vide avant de collecter des images.
- Arrêtez de couper lorsqu’aucune structure cardiaque supplémentaire n’est visualisée. Fermez l’application Microtome Communicator et exportez le fichier temporaire dans une série d’images .tiff via le logiciel de traitement d’image pour des reconstructions 3D ultérieures.
5. Reconstruction tridimensionnelle (3D)
REMARQUE: Le but de la reconstruction 3D est de traiter une pile d’images 2D de l’imagerie ECM en vidéos 3D dans les orientations coronale, sagittale et transversale et d’utiliser les vidéos 3D pour le diagnostic des anomalies structurelles et anatomiques dans les échantillons.
- Ouvrez la pile d’images ECM dans le logiciel de traitement d’image.
- Faites glisser et déposez l’image des fichiers dans le logiciel de traitement d’image. Retournez les images ECM horizontalement en sélectionnant Image > Transformer > Retourner horizontalement dans la barre de menus.
- Enregistrez l’image retournée et fermez le logiciel de traitement d’image.
- Importez la pile d’images ECM dans le logiciel de visualisation DICOM.
- Faites glisser et déposez les images ECM retournées horizontalement dans le logiciel de visualisation DICOM. Assurez-vous qu’il y a une bordure bleu clair autour de la liste d’exemples, sinon des images peuvent être ajoutées à un dossier d’exemple existant.
- Sélectionnez les liens ou les fichiers à copier dans la base de données lorsque la fenêtre contextuelle apparaît. Un nouvel exemple apparaîtra dans la liste d’exemples avec le même nom que le fichier copié dans le logiciel de visualisation DICOM.
- Cliquez sur le fichier nouvellement ajouté pour l’ouvrir.
- Effectuez une reconstruction 3D.
- Une fois le fichier ouvert, cliquez sur le menu Outils de reconstruction 2D/ 3D de la barre d’outils et sélectionnez 3D MPR.
- Pour la résolution Pixel X et la résolution Pixel Y, entrez la résolution de l’image en donnant le zoom utilisé lors de l’imagerie ECM. Pour l’intervalle de tranche, entrez l’épaisseur de tranche utilisée pour couper pendant l’imagerie ECM.
REMARQUE: La résolution de la caméra change en fonction du zoom de l’appareil photo et peut différer d’un appareil photo à l’autre.
- Utilisez les différents outils de l’onglet Outils sur le côté gauche pour ajuster les piles d’images comme vous le souhaitez.
- Utilisez l’outil WW/WL pour ajuster la largeur et le niveau de la fenêtre. Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers le haut pour diminuer la luminosité de l’image et vers le bas pour l’augmenter. Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers la droite pour réduire le contraste de l’image et vers la gauche pour l’augmenter.
Remarque : Les paramètres WW/WL optimaux pour une structure peuvent être sous-optimaux pour une autre. Pour cette raison, il est recommandé de créer des vidéos séparées pour afficher différentes structures. - Utilisez l’outil Panoramique pour faire glisser les images dans les positions souhaitées. Utilisez l’outil Zoom pour agrandir ou réduire l’image comme vous le souhaitez et l’outil Faire pivoter pour faire pivoter l’image comme vous le souhaitez.
REMARQUE: L’agrandissement des images peut entraîner une diminution de la qualité de l’image. Soyez prudent lorsque vous faites pivoter des images, car cela pourrait faire basculer les axes.
- Utilisez l’outil WW/WL pour ajuster la largeur et le niveau de la fenêtre. Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers le haut pour diminuer la luminosité de l’image et vers le bas pour l’augmenter. Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers la droite pour réduire le contraste de l’image et vers la gauche pour l’augmenter.
- Cliquez sur l’axe coloré du premier panneau et faites-le glisser. Remarquez comment la rotation de cet axe modifie l’orientation des deux autres panneaux. Faites pivoter les axes des trois panneaux jusqu’à ce que les trois panneaux représentent des vues coronales, sagittales et transversales de l’échantillon.
REMARQUE: Lors de la réorientation des échantillons, maintenez une orientation antérieure / postérieure correcte. - Générez des vidéos.
- Une fois que les trois panneaux sont correctement positionnés, orientés et éclairés, cliquez sur le panneau représentant la vue coronale.
- Cliquez sur Exportation de film sur le côté droit de la barre de menus. Cliquez sur Batch et faites glisser les curseurs From et To pour englober toute la région d’intérêt. Pour Intervalle, sélectionnez l’option Identique à Épaisseur . Enregistrez la vidéo en indiquant l’orientation de la vue.
- Regardez la vidéo pour voir si les structures d’intérêt peuvent être identifiées adéquatement. Si ce n’est pas le cas, utilisez les outils (étape 5.4) pour réajuster les vidéos si nécessaire et réenregistrer la vidéo.
- Répétez l’étape 5.6 pour les vues transversales et sagittales. Diagnostiquez les échantillons à l’aide de vidéos reconstruites.
REMARQUE : Regardez attentivement les vidéos dans chaque orientation pour évaluer complètement si l’échantillon présente des anomalies anatomiques ou des phénotypes de maladie (Figure 3).
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Representative Results
Les embryons de souris présentant des défauts hémodynamiques importants ont été notés comme étant létaux embryonnaire. Une grande variété de maladies coronariennes peut être identifiée grâce à l’échocardiogramme fœtal non invasif à haut rendement en utilisant différentes vues (Figure 1).
Anomalies septales : Les cardiopathies congénitales les plus courantes sont les anomalies septales telles qu’une communication interventriculaire (VSD), une communication interau-ventriculaire (AVSD) et une communication interauriculaire (TSA)1. VSD ou AVSD peut être facilement visualisé à l’aide d’images 2D et d’images de flux de couleurs. Le flux sanguin à travers les ventricules ou entre les oreillettes et les ventricules peut être facilement identifié (Figure 3). Le TSA est difficile à distinguer du foramen ovale persistant chez le fœtus.
Anomalies des voies d’écoulement : Comme le montre la figure 3, le flux dans l’artère pulmonaire principale traverse le flux ascendant de l’aorte chez les embryons normaux. Chez les embryons avec une double sortie du ventricule droit (DORV), les deux grandes artères peuvent être vues surgissant du ventricule droit. DORV est également associé à VSD (Figure 3D) et peut être identifié à l’aide du flux de couleurs. Cependant, étant donné la petite taille des embryons, le DORV ne peut parfois pas être distingué de manière fiable du remplacement de l’aorte, de l’atrésie pulmonaire ou du tronc artériel persistant (PTA). Dans l’APT, un seul écoulement des voies d’écoulement peut être observé dans l’échocardiogramme fœtal (figure 3E). La structure détaillée de l’arc et l’artère pulmonaire principale peuvent être observées par nécropsie (figure 2E,F).
L’autopsie permet de diagnostiquer rapidement l’état du situs dans le thorax et l’abdomen et la position cardiaque par rapport au thorax (lévocardie (figure 2C-E) ou dextrocardie). Les structures des voies d’écoulement et la taille relative des oreillettes et des ventricules peuvent être facilement visualisées (figure 2E,F).
L’histopathologie ECM est la technique de référence pour évaluer toute anomalie cardiaque structurelle 8,11,12. Il fournit une résolution et des détails inégalés aux structures des embryons. La reconstruction tridimensionnelle utilisant différents plans et vues permet d’identifier facilement la relation entre les grandes artères et ventricules (Figure 3) et le défaut entre les ventricules et les oreillettes.
Figure 1 : Les emplacements pour mesurer la longueur couronne-croupe dans les images d’échocardiogramme 2D d’embryons pour déterminer l’âge gestationnel. Images d’échocardiogramme 2D d’embryons à (A) E11.5, (B) E12.5, (C, D) E13.5-E14.5. (D) L’embryon malade est plus petit que son frère (C) et on note qu’il a un aspect « pâteux » avec hydrops (flèche). (A-C) Les embryons vivants présentent des organes distincts. Mode VB représentatif avec des images couleur du cœur E14.5 dans une vue coronale à 4 chambres inclinée antérieurement pour imager les voies d’écoulement (E) montrent un septum ventriculaire intact avec la relation normale des grandes artères, ce qui est confirmé par ECM dans la vue coronale (E'). (F) Une vue sagittale représentative du cœur E14.5 montre les voies d’écoulement ventriculaire gauche et ventriculaire droite avec l’aorte ascendante (AO) pointée crânienne et l’artère pulmonaire pointée vers l’arrière (vers la colonne vertébrale), ce qui est confirmé par ECM dans la vue sagittale (F'). (G) Vue transversale représentative du ventricule gauche (VG) et du ventricule droit (RV), qui est confirmée par ECM dans la vue transversale (G'). (H) Une vue transversale à la base du cœur dans l’ECM montre une valve aortique (AV) et une valve pulmonaire (PV) distinctes et séparées. PV est antérieure à AV. (H') L’image transversale représentative ECM du tronc artériel persistant (PTA) montre l’artère pulmonaire gauche et l’artère pulmonaire droite survenant postérieurement de l’artère troncale persistante indivise, l’artère carotide gauche émergeant antérieurement et crânienne de l’artère troncale persistante. Abréviations : A : antérieure, AO : aorte, AV : valve aortique, Cd : caudale, Cr : crânienne, DAO : aorte descendante, L : gauche, LA : oreillette gauche, ACL : artère carotide gauche, LPA : artère pulmonaire gauche, VG : ventricule gauche, P : postérieure, PA : artère pulmonaire, PTA : tronc artériel persistant, R : droite, RA : oreillette droite, RPA : artère pulmonaire droite, RV : ventricule droit. Barre d’échelle: 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images représentatives d’une nécropsie pour observer des anomalies cardiovasculaires. (A) Un embryon épinglé à un plat de dissection à fond noir sans phénotypes évidents. L’image montre l’anatomie générale de la tête, des doigts, de la cavité thoracique et de l’abdomen. (B) Le derme est retiré du chiot, révélant les glandes sous-maxillaires, la cage thoracique et l’abdomen. (C) La cage thoracique est soulevée, révélant l’anatomie grossière de la cavité thoracique, y compris le thymus, le cœur, les poumons et le diaphragme. (D) Une vue agrandie de la poitrine avec la cage thoracique enlevée. (E) Le thymus est enlevé, révélant de grands vaisseaux et la trachée. (F) Une vue agrandie des grands navires. Abréviations : AAO : aorte ascendante, D : diaphragme, LA : oreillette gauche, ACL : artère carotide gauche, LSVC : veine cave supérieure gauche, LV : ventricule gauche, P : péricarde, RA : oreillette droite, Rb : côtes, RCA : artère carotide droite, RL : poumon droit, RSVC : veine cave supérieure droite, RV : ventricule droit, S : sternum, SCA : artère sous-clavière droite, SMG : glandes sous-maxillaires, T : trachée, Th : thymus. Barre d’échelle: 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Échocardiogramme fœtal représentatif (Echo) et images du microscope confocal épiscopique (ECM). (A) L’écho présente un septum ventriculaire intact sans shunt interventriculaire et de grandes artères normales apparentées dans le témoin normal, confirmé par la MEC (A') au stade E14.5-15.5. (B) Détection échographique d’une communication interau-ventriculaire (AVSD). L’imagerie par écho dans la vue à 4 chambres montre la communication entre LA, RA, LV et RV, confirmée par (B') ECM au stade E14.5. (C) Le diagnostic échographique de la communication interventriculaire (VSD) avec flux de couleur démontre le flux à travers le BT et le RV, confirmé par (C') ECM au stade E16.5. (D) Echo et (D') ECM démontrent DORV avec un VSD entre LV et RV avec de grandes artères côte à côte (l’aorte est droite à l’artère pulmonaire) au stade E14.5. (E) Le diagnostic échographique du tronc artériel persistant (PTA) démontre une communication entre le VG et le RV avec un seul appareil de sortie l’emportant sur les deux ventricules (PTA). (E') Cette pathologie est confirmée par ECM au stade E14.5. Barre d’échelle: 0,5 mm. AO: aorte, AVSD: communication interau-ventriculaire, Cd: caudale, Cr: crânien, L: gauche, LA: oreillette gauche, LV: ventricule gauche, PA: artère pulmonaire, PTA: tronc artériel persistant, R: droite, RA: oreillette droite, RV: ventricule droit, VSD: communication interventriculaire. Barre d’échelle: 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Étape | Longueur de la couronne à la croupe (mm) | Surface du fœtus (mm2) | Région du cœur (mm2) | Zone du cœur/Région du fœtus |
| E12.5 | 7,9 ± 0,8 (n = 77) | 23,2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13.5 | 10,5 ± 0,9 (n = 92) | 40,9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14.5 | 12,5 ± 0,9 (n = 101) | 57,6 ± 8 (n = 101) | 2,9 ± 0,5 (n = 70) | 0,050 ± 0,004 (n = 70) |
| E15.5 | 14,1 ± 0,5 (n = 134) | 71,4 ± 6 (n = 134) | 3,8 ± 0,4 (n = 87) | 0,053 ± 0,004 (n = 87) |
| E16.5 | 15,4 ± 0,6 (n = 112) | 82,7 ± 6 (n = 112) | 4,9 ± 0,5 (n = 87) | 0,058 ± 0,007 (n = 87) |
| E17.5 | 16,6 ± 0,4 (n = 211) | 96,9 ± 7 (n = 211) | 6,1 ± 0,6 (n = 146) | 0,063 ± 0,004 (n = 146) |
| E18.5 | 17,7 ± 0,6 (n = 139) | 112,1 ± 8 (n = 139) | 7,1 ± 0,8 (n = 93) | 0,063 ± 0,005 (n = 93) |
| E19.5 | 18,7 ± 0,7 (n = 57) | 126,7 ± 8 (n = 57) | 7,7 ± 0,7 (n = 36) | 0,062 ± 0,005 (n = 36) |
Tableau 1 : Profil de développement de la croissance fœtale.
| E14.5 | E16.5 | E18.5 | Nouveau-né | |
| 70% d’éthanol | 1 h | 1,5 h | 3 h | 4 h |
| 95% d’éthanol | 35 min | 45 min | 1 h | 1 h |
| 95% d’éthanol | 35 min | 45 min | 1 h | 1 h |
| 100% éthanol | 15 min | 15 min | 30 min | 6 min |
| Xylène 1 | 20 min | 30 min | 40 min | 30 min |
| Xylène 2 | 20 min | 30 min | 40 min | 30 min |
| Cire 1 | 20 min | 20 min | 20 min | 30 min |
| Cire 2 | 20 min | 20 min | 20 min | 30 min |
| Cire 3 | Du jour au lendemain | Du jour au lendemain | Du jour au lendemain | Du jour au lendemain |
Tableau 2 : Protocole d’incorporation embryonnaire basé sur les jours embryonnaires.
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Discussion
Des souris génétiquement modifiées ont été utilisées pour comprendre les mécanismes pathologiques des malformations cardiaques congénitales. Les protocoles que nous fournissons dans cette étude tentent de rationaliser et de normaliser le processus d’évaluation des malformations cardiaques fœtales murines. Cependant, il y a des étapes critiques à noter pendant le protocole. Les embryons de souris se développent de manière significative au cours de chaque jour de gestation, et le moment correct pour récolter une souris peut être déterminé en effectuant un échocardiogramme fœtal avec précision. L’échocardiogramme fœtal peut être utilisé pour dépister la pathologie cardiovasculaire fœtale. Une image 2D permet d’identifier l’anatomie et la fonction cardiaque anormales, à l’aide de Doppler couleur pour examiner le flux sanguin et détecter toute communication entre les cavités du cœur ou les voies d’écoulement et d’entrée anormales. Pour déterminer le diagnostic de coronaropathie, les fœtus sont scannés à partir du jour embryonnaire E14.5 lorsque la septation des voies d’écoulement et la formation de la chambre cardiaque sont terminées. L’analyse à des stades plus précoces pourrait refléter le retard de développement.
L’histopathologie est la norme pour caractériser les maladies coronariennes8 à l’aide d’un microtome suivi d’une visualisation au microscope optique. L’inconvénient majeur de la méthode standard est l’absence d’un affichage 3D intuitif des structures cardiovasculaires pour le diagnostic et la limitation de l’absence de vues différentes des échantillons. Une histologie ECM est la méthode la plus rapide pour caractériser les anomalies cardiaques. Si la MEC n’est pas disponible, un microtome peut être utilisé pour sectionner l’embryon et déterminer les phénotypes cardiaques. D’autres options pour obtenir une imagerie cardiaque sont la réalisation d’une imagerie par résonance magnétique (IRM) à haut débit et haute résolution ou d’une tomodensitométrie (TDM). Un aspect clé de l’IRM ou de la tomodensitométrie est que plusieurs embryons peuvent être imagés simultanément; Cependant, même après une échographie, une tomodensitométrie ou une IRM, une histopathologie est nécessaire pour confirmer tout diagnostic de coronaropathie.
En utilisant l’imagerie ECM pour l’histopathologie, l’embryon est imagé en série après chaque coupe à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser monté sur le microtome à glissement automatique. Les images individuelles collectées à partir de l’ECM permettent des reconstructions 3D ultérieures et permettent aux échantillons d’être découpés numériquement dans n’importe quel plan d’imagerie sans reprendre les images 8,11. Une telle opération permet une évaluation complète de l’anatomie cardiaque, qui peut être utilisée à différents stades de développement. De plus, des lames individuelles pourraient être récupérées à partir du microtome tout en collectant les données de l’équipement ECM. Bien que l’histopathologie ECM soit l’étalon-or pour évaluer toute anomalie cardiaque structurelle, il existe des limites quant à la disponibilité de l’équipement, du logiciel et du temps de fonctionnement par embryon. Le temps de passage pour sectionner un cœur embryonnaire peut varier de 1 à 3 h par échantillon, en fonction de sa taille. En raison de la complexité de l’équipement, les chercheurs doivent vérifier régulièrement sur l’ordinateur pour s’assurer que la région d’intérêt à l’intérieur du champ est enregistrée. Les chercheurs doivent également vérifier l’échantillon pour s’assurer qu’aucun copeaux de paraffine n’obstrue l’échantillon du scanner laser.
L’ECM et la reconstruction 3D subséquente fournissent une évaluation complète à haute résolution de toute anomalie cardiaque structurelle, quel que soit le plan d’incorporation de l’échantillon. Ces protocoles ont permis de diagnostiquer avec succès une gamme de maladies coronariennes et nous ont permis de comprendre l’embryogenèse cardiaque dans des modèles murins et des pathologies liées aux mutations génétiques.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts dans ce manuscrit.
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
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