Summary
Dieser Artikel beschreibt die diagnostischen Methoden der angeborenen Herzfehler (KHK) der Maus unter Verwendung der fetalen Echokardiographie, der Nekropsie und der episkopischen Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) unter Verwendung der episkopischen konfokalen Mikroskopie (ECM), gefolgt von einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion.
Abstract
Angeborene Herzfehler (KHK) sind die Hauptursachen für den Tod von Säuglingen in den Vereinigten Staaten. In den 1980er Jahren und früher starben die meisten Patienten mit mittelschwerer oder schwerer KHK vor dem Erwachsenenalter, wobei die maximale Mortalität in der ersten Lebenswoche lag. Bemerkenswerte Fortschritte bei chirurgischen Techniken, diagnostischen Ansätzen und medizinischem Management haben zu deutlichen Verbesserungen der Ergebnisse geführt. Um den kritischen Forschungsbedarf des Verständnisses von angeborenen Herzfehlern zu decken, haben Mausmodelle eine ideale Forschungsplattform geschaffen, da sie eine sehr ähnliche Herzanatomie wie der Mensch und kurze Schwangerschaftsraten aufweisen. Die Kombination von Gentechnik mit Hochdurchsatz-Phänotypisierungswerkzeugen hat die Replikation und Diagnose von strukturellen Herzfehlern ermöglicht, um die molekularen Signalwege hinter KHK weiter aufzuklären. Der Einsatz der nicht-invasiven fetalen Echokardiographie zum Screening der kardialen Phänotypen in Mausmodellen in Verbindung mit der hohen Genauigkeit der episkopischen Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) mittels episkopischer konfokaler Mikroskopie (ECM) Histopathologie mit dreidimensionalen (3D) Rekonstruktionen ermöglicht einen detaillierten Einblick in die Anatomie verschiedener angeborener Herzfehler. Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen Arbeitsablauf dieser Methoden, um eine genaue Diagnose von angeborenen Herzfehlern der Maus zu erhalten. Die Anwendung dieses Phänotypisierungsprotokolls auf Modellorganismen ermöglicht eine genaue KHK-Diagnose und liefert Einblicke in die Mechanismen der KHK. Die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen der KHK bietet Möglichkeiten für mögliche Therapien und Interventionen.
Introduction
Angeborene Herzfehler (KHK) sind die häufigsten neonatalen Geburtsfehler 1,2, von denen etwa 0,8 % bis 1,7 % der Neugeborenen betroffen sind und die zu einer signifikanten Mortalität und Morbidität bei Neugeborenen führen3. Eine genetische Ätiologie ist bei KHK 4,5 stark indiziert. Genetisch veränderte Mausmodelle wurden in großem Umfang verwendet, um die Komplexität von KHK und die Mechanismen zu verstehen, die sie verursachen, da die Mäuse Vierkammerherzen und vergleichbare kardiale Entwicklungs-DNA-Sequenzen bei Maus- und menschlichen Föten haben6. Die Identifizierung des Phänotyps der Mausmutanten ist der grundlegende erste Schritt, um die Funktion des Zielgens zu charakterisieren. Mausmodelle, die Gendosiseffekte ausdrücken, bei denen eine einzige genetische Mutation zu einem Spektrum von Herzfehlern führen kann, die menschliche KHK nachahmen, sind wichtig, um die Komplexität von KHK und die Mechanismen, die sie verursachen, zu verstehen.
Dieser Artikel skizziert eine Pipeline zur Charakterisierung kardialer Phänotypen in Mausmodellen. Die angewandten Methoden verwenden das fetale Echokardiogramm 7, gefolgt von der Nekropsie und der EZM-Histopathologie 7,8, die die detaillierte Anatomie der sich entwickelnden murinen Herzphänotypen darstellen können. Ein fetales Echokardiogramm ist eine nichtinvasive Methode, die eine direkte Visualisierung mehrerer Embryonen mit angemessener Bildauflösung ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht ein fetales Echokardiogramm eine schnelle Bestimmung der Gesamtzahl der Embryonen in einem Wurf, ihrer Entwicklungsstadien sowie der relativen Orientierung und Lage im Gebärmutterhorn. Mit einem spektralen Doppler/Farbfluss können abnorme Embryonen anhand der Struktur, der hämodynamischen Störung, der Wachstumseinschränkung oder der Entwicklung von Hydrops identifiziert werden. Da es sich bei einer fetalen Echokardiogramm-Studie um eine nichtinvasive Technik handelt, kann sie verwendet werden, um an mehreren Tagen zu scannen und die Veränderungen der Hämodynamik oder der Herzmorphologie zu beobachten. Die Erstellung einer qualitativ hochwertigen Bildgebung von fetalen Echokardiogrammen erfordert Übung und Geschicklichkeit, da bestimmte Herzfehler aufgrund mangelnder Erfahrung und mangelnden Wissens übersehen werden können. Aus diesem Grund kann eine definitivere Analyse der Herzmorphologie durch eine Kombination von Nekropsie und EZM-Histopathologie erhalten werden. Die Nekropsie ermöglicht die direkte Visualisierung der Bogenstruktur, der relativen Beziehungen der Aorta und der Lungenarterie, der Größe der Ventrikel und Vorhöfe, der Position des Herzens relativ zur Brust und der bronchopulmonalen Strukturen. Innere Merkmale wie die Herzklappen und die Wandstärke können jedoch durch Obduktion allein schwer zu beurteilen sein. Daher wird die EZM-Histopathologie für eine schlüssige Diagnose empfohlen. Die ECM-Histopathologie ist eine hochauflösende Visualisierungstechnik, die sowohl eine 2D- als auch eine 3D-Rekonstruktion des Bildstapelsermöglicht 9. Diese Bilder werden durch serielle episkopische Fluoreszenzbildgebung einer in Paraffin eingebetteten Probe erhalten, während sie in einem konsistenten Intervall durch ein automatisches Mikrotom dünn geschnitten wird. Im Gegensatz zur klassischen Histologie werden Bilder als Ausschnitt erfasst, bevor sie aus dem Block herausgeschnitten werden, so dass alle Bilder innerhalb desselben Bezugssystems erfasst werden. Dadurch kann der von der ECM-Histopathologie erzeugte 2D-Bildstapel einfach und zuverlässig dreidimensional rekonstruiert werden. Dies geschieht mit einem DICOM-Viewer, der eine 3D-Visualisierung der Bilder in den drei anatomischen Ebenen ermöglicht: koronale, sagittal und transversal. Aus diesen hochauflösenden 3D-Rekonstruktionen kann eine definitive Herzdiagnose gestellt werden. Die Anwendung dieser drei verschiedenen Visualisierungsmodalitäten, entweder einzeln oder in Kombination, kann genaue Charakterisierungen von strukturellen Herzfehlern in Mausembryonen liefern.
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Protocol
Die Verwendung von Mäusen für diese Studien ist notwendig, da Mäuse vierkammerige Herzen haben, die menschliche KHK nachahmen können. Mäuse wurden tierärztlich versorgt und in der von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Tierpflegeeinrichtung der Institution untergebracht. Strenge Protokolle wurden befolgt, um die Beschwerden, den Stress, die Schmerzen und die Verletzungen der Mäuse zu minimieren. Mäuse wurden mit CO2 -Gas eingeschläfert, was für kleine Nagetiere nach den Richtlinien der American Veterinary Medical Association zur Sterbehilfe akzeptabel ist. Die Studien an Mäusen in diesem Manuskript wurden mit einem genehmigten IACUC-Protokoll an der Universität von Pittsburgh durchgeführt.
1. Fetales Echokardiogramm
HINWEIS: Ein Echokardiogramm ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von kardiovaskulären Fehlbildungen und extrakardialen Defekten bei Mäusen. Aufgrund der geringen Größe der Mausembryonen (ca. 1-2 mm bei der Geburt, 3,5 mm bei der Geburt) ist ein ultrahochfrequentes echokardiographisches Gerät mit Ultraschall-Biomikroskopie (UBM) erforderlich. UBM bietet verschiedene Hochfrequenz-Sonden (30-50 MHz) mit einem kleinen Bildgebungsfenster (15 mm x 14 mm), das die Auflösung (30 μm axial x 68 μm lateral) bietet, um jeweils einen Mausfötus zu visualisieren. Ein 40-MHz-Schallkopf liefert hochauflösende Bilder zur Identifizierung kardiovaskulärer Phänotypen7.
- Schalten Sie das Echokardiogrammgerät ein und wählen Sie das Programm Kardiologie.
ANMERKUNG: Das folgende Protokoll kann für jeden Maushintergrund vom Embryonaltag (E) 14.5 bis 19.5. verwendet werden. - Betäuben Sie die gewünschte Maus in einer Anästhesie-Induktionskammer. Induzieren Sie eine Anästhesie mit einer Konzentration von 4% Isofluran und medizinischem Sauerstoff bei einer Flussrate von 1 l / min und reduzieren Sie sie auf 2% -3% für die Erhaltung.
- Platzieren Sie die Maus schnell auf der Imaging-Plattform. Die Bildgebungsplattform verfügt über beheizten Stahl, um die Maus während des Eingriffs warm zu halten. Legen Sie den Mund und die Nase der Maus in den Narkose-Nasenkegel. Sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband, um Bewegungen zu vermeiden. Überwachen Sie die Herzfrequenz, um sicherzustellen, dass sie zwischen 400 und 450 Schlägen pro Minute bleibt.
- Überwachen Sie die Temperatur mit einem Rektalthermometer und stellen Sie sicher, dass sie bei 37 °C ± 0,5 °C liegt. Überwachen Sie die Atmung, um Hypoxie zu vermeiden. Halten Sie eine sanfte Kraft auf die Sonde, um Schäden zu vermeiden.
HINWEIS: Eine Wärmelampe kann über der Maus angebracht werden, um Unterkühlung zu verhindern und sich von der Narkose zu erholen. Vaseline ophthalmologische Salbe kann als Gleitmittel verwendet werden, um trockene Augen zu vermeiden. - Entfernen Sie das Fell von Brustkorb und Bauch mit Enthaarungscreme. Tragen Sie die Creme auf und warten Sie 3 Minuten, bevor Sie sie entfernen. Reinigen Sie den Bereich mit 70% Ethanol. Ethanol wirkt besser als Wasser als Rasierschmiermittel.
- Erwärmen Sie das Ultraschallgel auf eine normale Körpertemperatur. Tragen Sie das Ultraschallgel großzügig auf und legen Sie den Schallkopf auf den Bauch, um ihn in einer horizontalen Ebene auszurichten und die Blase auf dem Bildschirm zu identifizieren. Sobald die Blase identifiziert ist, scannen Sie kranial von der Blase und suchen Sie nach dem Fötus. Messen Sie die Länge von Krone zu Gesäß, um das Gestationsaltervon 10 Jahren zu bestimmen (Abbildung 1 und Tabelle 1).
HINWEIS: Ändern Sie die Positionen des Wandlers, um verschiedene Ebenen zu visualisieren, einschließlich der transversalen Vierkammer-, sagittalen und frontalen/koronalen Bildgebungsebenen7 (Abbildung 1). - Verwenden Sie den Farbdoppler, um den Blutfluss vom Herzen zu analysieren.
- Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig, wenn die Embryonen nicht das vorgesehene Stadium erreicht haben. Andernfalls bereiten Sie die Maus für die Ernte vor.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Maus bereits wach ist und sich gut von der Narkose erholt hat, bevor Sie sie wieder in den Käfig legen. - Schalten Sie Isofluran und Sauerstoff aus, reinigen Sie den Arbeitsbereich und schalten Sie das Gerät aus.
HINWEIS: Es ist wichtig, das Gel aus dem Schallkopf zu entfernen.
2. Obduktion
HINWEIS: Bei Verdacht auf abnorme kardiale Phänotypen mittels fetaler Echokardiographie werden die Föten gesammelt und durch Ganzkörpertauchen in der Fixierlösung fixiert: entweder 10% gepuffertes Formalinphosphat oder 4% Paraformaldehyd (PFA). Untersuchen Sie die äußere und innere Morphologie der Probe und suchen Sie nach makroskopischen anatomischen Anomalien oder Fehlbildungen.
- Bereiten Sie die Maus vor.
- Wenn es sich bei der Maus um einen Erwachsenen handelt, wird die Maus mit einem Standard-CO2 -Protokoll eingeschläfert. Verwenden Sie eine Pinzette oder eine Sezierschere, um Schnitte (ca. 3 cm) im seitlichen Brustkorb und Bauch zu machen, um das Eindringen des Fixiermittels in die inneren Organe zu ermöglichen.
ANMERKUNG: Die Probe sollte mindestens 24 Stunden vor der Obduktion fixiert werden, wenn der Embryo älter als E14,5 ist.
- Wenn es sich bei der Maus um einen Erwachsenen handelt, wird die Maus mit einem Standard-CO2 -Protokoll eingeschläfert. Verwenden Sie eine Pinzette oder eine Sezierschere, um Schnitte (ca. 3 cm) im seitlichen Brustkorb und Bauch zu machen, um das Eindringen des Fixiermittels in die inneren Organe zu ermöglichen.
- Analysieren Sie das Äußere des Körpers.
- Richten Sie die Software so ein, dass die Bilder mit einem Namen gespeichert werden, der die Identifizierung der Probe, die Vergrößerung des Mikroskops und den Inhalt des Bildes enthält.
HINWEIS: Eine Vergrößerung von 1,0x bis 3,2x sollte für die Abbildung der meisten Strukturen in E14,5-Mäusen oder älter ausreichend sein. - Legen Sie die Maus auf die Platte unter der Stereomikroskoplinse. Füllen Sie die Platte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die Probe vollständig abzudecken, um Austrocknung und Reflexion in den Bildern zu verhindern. Passen Sie die Vergrößerung so an, dass der Bildschirm den gesamten Embryo enthält, und machen Sie dann ein Bild von der linken und rechten Seite des Embryos.
HINWEIS: Die Unterseite der Platte sollte mit Paraffin, Silikon oder einem anderen Substrat beschichtet sein, um das Anheften zu erleichtern. - Stecken Sie die Probe mit dem Gesicht nach oben durch den Hals und machen Sie ein weiteres Bild.
HINWEIS: Richten Sie den Stift leicht nach oben aus, um sicherzustellen, dass keine wichtigen Strukturen der Brusthöhle durchstochen werden.
- Richten Sie die Software so ein, dass die Bilder mit einem Namen gespeichert werden, der die Identifizierung der Probe, die Vergrößerung des Mikroskops und den Inhalt des Bildes enthält.
- Analysiere die Brust.
- Während Sie die Haut in der Mitte des Halses mit einer Pinzette anheben, schneiden Sie die Haut mit der Schere in Richtung der beiden Achselhöhlen, bevor Sie die Haut entlang der Mittelachse in Richtung Schwanz schneiden. Dann schneiden Sie die Haut vom Nabel bis zu den Beinen. Stecken Sie die Probe durch ihre Handgelenke und Knöchel.
HINWEIS: Achten Sie darauf, nur die Haut zu schneiden. Es wird empfohlen, die Klingen der Schere horizontal oder schräg nach oben zu halten. - Um das Bindegewebe zu lösen, heben Sie die Haut mit einer Pinzette an, während Sie das darunter liegende Gewebe mit dem anderen Paar an Ort und Stelle halten. Stecken Sie die Probe durch die Haut, um die Brust und den Bauch freizulegen (Abbildung 2).
HINWEIS: Zu starkes Dehnen beim Fixieren, Schneiden oder Schaben kann zu Gewebeschäden führen. - Machen Sie ein Foto von den freiliegenden Muskeln und kratzen Sie dann vorsichtig die Muskeln ab, um die Rippen freizulegen.
- Machen Sie ein Foto von den freiliegenden Rippen. Trennen Sie die Rippen vom Zwerchfell und schneiden Sie die Rippen beidseitig so weit wie möglich auf der Seitenachse zum Hals hin ab.
- Entblößen Sie das Herz, indem Sie die abgeschnittenen Rippen entfernen. Machen Sie ein Foto vom Herzen.
- Entfernen Sie die Thymusdrüse, indem Sie sie mit einer Pinzette schälen. Verwenden Sie die andere Pinzette, um die Basis des Thymus zu stabilisieren, um zu vermeiden, dass darunter liegende Gefäße gerissen werden. Machen Sie Fotos vom Herzen und den großen Gefäßen.
HINWEIS: Die Verwendung von Pins zum Dehnen einiger benachbarter Strukturen kann dazu beitragen, bessere Bildaufnahmen zu erhalten. Machen Sie außerdem separate Fotos, die sich auf die großen Arterien, das Herz und andere interessante Strukturen konzentrieren, da sie möglicherweise nicht zusammen scharf sind.
- Während Sie die Haut in der Mitte des Halses mit einer Pinzette anheben, schneiden Sie die Haut mit der Schere in Richtung der beiden Achselhöhlen, bevor Sie die Haut entlang der Mittelachse in Richtung Schwanz schneiden. Dann schneiden Sie die Haut vom Nabel bis zu den Beinen. Stecken Sie die Probe durch ihre Handgelenke und Knöchel.
- Analysiere den Bauch.
- Ziehen Sie das Zwerchfell, um es zu entfernen und die Leber freizulegen. Machen Sie ein Foto.
- Stecken Sie die Leber zurück, um den Magen und die Bauchspeicheldrüse freizulegen. Machen Sie ein Foto.
- Schneiden Sie die Speiseröhre. Entfernen Sie den Dickdarm und den Darm, indem Sie sie mit einer Pinzette herausziehen. Schneiden Sie knapp über der Leber und entfernen Sie es, um die Nieren und Nebennieren freizulegen. Machen Sie ein Foto.
HINWEIS: Die entnommenen Organe sollten in der Fixierlösung aufbewahrt werden.
- Isolieren Sie den Thorax für die ECM-Analyse.
- Schneiden Sie den unteren Thorax entlang einer geraden Linie zwischen Leber und Lunge. Schneiden Sie den Kopf hoch genug ab, um die Verzweigungen der Halsschlagadern nicht zu schneiden.
- Entfernen Sie vorsichtig die seitlichen Rippen, während Sie die Rückenrippen und die Wirbelsäule beibehalten. Schälen Sie das Rückenfett und kratzen Sie es weg.
- Lösen Sie den Thorax vom Rest des Körpers und legen Sie ihn in eine 10% gepufferte Formalinphosphatlösung.
3. Einbettung
- Dekantieren Sie das Fixiermittel in eine geeignete Sondermüllflasche. Waschen Sie die Proben dreimal mit 1x PBS für 15 min.
- Verwenden Sie steigende Konzentrationen von Ethanol und Xylol, um die Proben zu dehydrieren. Die Dauer aller folgenden Schritte hängt vom Stadium der Embryonen ab. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2 .
HINWEIS: Beim Wechseln der Lösungen ist Vorsicht geboten, um eine Beschädigung der Proben zu vermeiden. Die optimalen Parameter für die Probenbearbeitung können empirisch eingestellt werden. Xylol löst bestimmte Kunststoffe auf; Es sollten Instrumente und Behälter aus Glas verwendet werden. - Ersetzen Sie Xylol für die gewünschte Dauer durch Paraffin. Die Flaschen werden für die entsprechende Dauer in einem Inkubator bei 65 °C gelagert (Tabelle 2).
- Verwenden Sie frisches Paraffin, um die Proben in die gewünschte Position einzubetten.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Probe in der Mitte des Paraffinblocks auszurichten, wobei die dorsale Seite nach oben und die hintere Seite nach vorne zeigt. Denken Sie beim Ausrichten der Probe daran, dass die Probe mit dem auf den Kopf stehenden Block eingebettet ist.
4. Episkopische konfokale Mikroskopie (ECM)
HINWEIS: Nach entsprechender Einbettung werden die Embryonen zur histopathologischen Analyse seriell mittels ECM aufgenommen. Einzelne Objektträger können für weitere Studien aus dem Mikrotom gewonnen werden.
- Nehmen Sie den Paraffinblock aus dem -20 °C Gefrierschrank und entfernen Sie die Metallformen.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Wachs an den Rändern und der Rückseite der Kassette zu trimmen. Schneiden Sie das Wachs, das die Probe umgibt, bis es von einem kleinen Wachsquadrat umhüllt ist, das an der Kassette befestigt ist.
HINWEIS: Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Handhabung von Messern. - Verwenden Sie den Metallhebel, um den Paraffinblock gegen die Schneidephase des Mikrotoms zu klemmen. Wählen Sie im Run-Modus die MAN-Funktion (manuell), heben Sie die Oberfläche des Paraffins in die Nähe der Klinge und führen Sie einige Schlitten aus, um sicherzustellen, dass die Klinge den Paraffinblock berührt.
- Öffnen Sie die LAS AF-Anwendung und wählen Sie MatrixScreener aus. Wählen Sie Einzelne reguläre Matrix aus, und laden Sie die entsprechende zuvor gespeicherte Vorlage. Klicken Sie auf die Quick LUT-Taste , um zu weißem und orangefarbenem Ombre zu wechseln.
- Wählen Sie "Aufträge einrichten " und ziehen Sie den sichtbaren 405-nm-Laser auf das Maximum. Passen Sie den linken Rand des Spektrumblocks an die 405-nm-Linie an und ziehen Sie den rechten Rand auf die 800-nm-Linie. Markieren Sie die Option Lochblende und starten Sie die Live-Ansicht .
- Passen Sie die Position der Laserprojektion an, um die Probe auf dem Bildschirm zu zentrieren, und stellen Sie den Zoomknopf auf ~20x ein. Um die Auflösung zu optimieren, stellen Sie die Verstärkung auf 1.250 V ein und maximieren Sie den blauen Bereich mit dem Fokusknopf. Setzen Sie dann die Verstärkung für die Bildgebung auf ca. 750 V zurück.
HINWEIS: Spezifische Werte können je nach Zustand des Embryos variieren. - Schalten Sie die Schneidemethode auf Auto um, stellen Sie die Dicke auf etwa 50 μm ein und lassen Sie die Schlitten laufen. Hören Sie auf zu schneiden, wenn die Lunge und die Atemwege in Sicht sind.
- Wählen Sie eine Schnittstärke zwischen 8-10 μm und stoppen Sie die Live-Ansicht . Öffnen Sie Microtome Communicator , um die Bildgebung zu starten. Stellen Sie sicher, dass der temporäre Speicherordner leer ist, bevor Sie Bilder sammeln.
- Stoppen Sie das Schneiden, wenn keine zusätzliche Herzstruktur sichtbar ist. Schließen Sie die Anwendung Microtome Communicator und exportieren Sie die temporäre Datei über die Bildverarbeitungssoftware in eine .tiff Bildserien für spätere 3D-Rekonstruktionen.
5. Dreidimensionale (3D) Rekonstruktion
HINWEIS: Der Zweck der 3D-Rekonstruktion besteht darin, einen 2D-Bildstapel aus der ECM-Bildgebung in 3D-Videos in koronaler, sagittaler und transversaler Ausrichtung zu verarbeiten und die 3D-Videos für die Diagnose der strukturellen und anatomischen Anomalien in den Proben zu verwenden.
- Öffnen Sie den ECM-Bildstapel in der Bildverarbeitungssoftware.
- Ziehen Sie die Bilder per Drag & Drop in die Bildbearbeitungssoftware. Kippen Sie die ECM-Bilder horizontal, indem Sie in der Menüleiste Bild >
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Representative Results
Die Mausembryonen mit signifikanten hämodynamischen Defekten erwiesen sich als embryonal tödlich. Eine Vielzahl von KHK kann durch das nichtinvasive fetale Echokardiogramm mit hoher Leistung unter Verwendung verschiedener Ansichten identifiziert werden (Abbildung 1).
Septumdefekte: Die häufigsten KHK sind Septumdefekte wie ein Ventrikelseptumdefekt (VSD), ein atrioventrikulärer Septumdefekt (AVSD) und ein Vorhofseptumdefekt (ASD)1. VSD oder AVSD können einfach mit 2D-Bildern und Farbflussbildern visualisiert werden. Der Blutfluss über die Ventrikel oder zwischen den Vorhöfen und den Ventrikeln kann leicht identifiziert werden (Abbildung 3). ASD ist schwer zu unterscheiden mit offenem Foramen ovale in einem Fötus.
Anomalien des Abflusstrakts: Wie in Abbildung 3 dargestellt, verläuft der Fluss in der Hauptpulmonalarterie bei normalen Embryonen über den aufsteigenden Aortenfluss. Bei Embryonen mit einem doppelten Ausgang des rechten Ventrikels (DORV) können beide großen Arterien aus dem rechten Ventrikel hervorgehen. DORV ist auch mit VSD assoziiert (Abbildung 3D) und kann anhand des Farbflusses identifiziert werden. Aufgrund der geringen Größe der Embryonen kann die DORV jedoch manchmal nicht zuverlässig von der Übersteuerung der Aorta, der Lungenatresie oder des persistierenden Truncus arteriosus (PTA) unterschieden werden. Bei der PTA ist im fetalen Echokardiogramm nur ein Abflusstrakt zu sehen (Abbildung 3E). Die detaillierte Struktur des Bogens und die Hauptpulmonalarterie können mittels Obduktion beobachtet werden (Abbildung 2E,F).
Die Obduktion kann schnell den Situs-Status in Brust und Bauch und die Herzposition relativ zur Brust (entweder Levokardie (Abbildung 2C-E) oder Dextrokardie) diagnostizieren. Die Strukturen des Abflusstraktes und die relative Größe von Vorhöfen und Ventrikeln können leicht visualisiert werden (Abbildung 2E, F).
Die EZM-Histopathologie ist die Goldstandardtechnik zur Beurteilung struktureller kardialer Anomalien 8,11,12. Es bietet eine beispiellose Auflösung und Detailgenauigkeit der Strukturen von Embryonen. Durch die dreidimensionale Rekonstruktion mit verschiedenen Ebenen und Ansichten kann die Beziehung zwischen den großen Arterien und Ventrikeln (Abbildung 3) und der Defekt zwischen den Ventrikeln und Vorhöfen leicht identifiziert werden.
Abbildung 1: Die Orte für die Messung der Kronen-Steiß-Länge in 2D-Echokardiogramm-Bildern von Embryonen zur Bestimmung des Gestationsalters. 2D-Echokardiogramm-Bilder von Embryonen bei (A) E11.5, (B) E12.5, (C,D) E13.5-E14.5. (D) Der erkrankte Embryo ist kleiner als sein (C) Geschwister und hat ein "matschiges" Aussehen mit Hydrops (Pfeil). (A-C) Lebende Embryonen zeigen unterschiedliche Organe. Repräsentativer VB-Modus mit Farbbildern des E14.5-Herzens in einer koronalen 4-Kammer-Ansicht, die nach vorne geneigt ist, um die (E) Abflussbahnen abzubilden, zeigt ein intaktes Ventrikelseptum mit der normalen Beziehung der großen Arterien, was mit ECM in der (E') koronalen Ansicht bestätigt wird. (F) Die repräsentative sagittale Ansicht des E14.5-Herzens zeigt die linksventrikulären und rechtsventrikulären Abflussbahnen mit der aufsteigenden Aorta (AO) kraniell und der Lungenarterie nach hinten (in Richtung Wirbelsäule), was mit der EZM in der (F') sagittalen Ansicht bestätigt wird. (G) Repräsentative Queransicht des linken Ventrikels (LV) und des rechten Ventrikels (RV), die mit der EZM in der (G') Queransicht bestätigt wird. (H) Eine Queransicht an der Basis des Herzens bei EZM zeigt eine deutliche und getrennte Aortenklappe (AV) und Pulmonalklappe (PV). PV ist anterior zu AV. (H') Repräsentatives ECM-Queransichtsbild des persistierenden Truncus arteriosus (PTA) zeigt die linke Lungenarterie und die rechte Lungenarterie, die posterior aus der ungeteilten persistierenden Stammarterie hervorgehen, wobei die linke Halsschlagader anterior und kranial aus der persistierenden Stammarterie hervorgeht. Abkürzungen: A: anterior, AO: Aorta, AV: Aortenklappe, Cd: kaudal, Cr: kranial, DAO: absteigende Aorta, L: links, LA: linker Vorhof, LCA: linke Halsschlagader, LPA: linke Lungenarterie, LV: linker Ventrikel, P: posterior, PA: Lungenarterie, PTA: persistierender Truncus arteriosus, R: rechts, RA: rechter Vorhof, RPA: rechte Lungenarterie, RV: rechter Ventrikel. Maßstabsleiste: 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder einer Obduktion zur Beobachtung kardiovaskulärer Anomalien . (A) Ein Embryo, der an eine Sezierschale mit schwarzem Hintergrund gepinnt ist, ohne offensichtliche Phänotypen. Das Bild zeigt die grobe Anatomie des Kopfes, der Digitalen, der Brusthöhle und des Bauches. (B) Die Dermis wird vom Welpen entfernt und enthüllt submandibuläre Drüsen, Brustkorb und Bauch. (C) Der Brustkorb wird angehoben und enthüllt die grobe Anatomie der Brusthöhle, einschließlich der Thymusdrüse, des Herzens, der Lunge und des Zwerchfells. (D) Eine vergrößerte Ansicht der Brust mit entferntem Brustkorb. (E) Der Thymus wird entfernt, große Gefäße und Luftröhre werden freigelegt. (F) Eine vergrößerte Ansicht großer Schiffe. Abkürzungen: AAO: aufsteigende Aorta, D: Zwerchfell, LA: linker Vorhof, LCA: linke Halsschlagader, LSVC: linke obere Hohlvene, LV: linke Herzkammer, P: Perikard, RA: rechter Vorhof, Rb: Rippen, RCA: rechte Halsschlagader, RL: rechte Lunge, RSVC: rechte obere Hohlvene, RV: rechter Ventrikel, S: Brustbein, SCA: rechte Arteria subclavia, SMG: submandibuläre Drüsen, T: Luftröhre, Th: Thymusdrüse. Maßstabsleiste: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentatives fetales Echokardiogramm (Echo) und Bilder des episkopischen konfokalen Mikroskops (ECM). (A) Echo zeigt ein intaktes Ventrikelseptum ohne interventrikulären Shunt und normal verwandte große Arterien in der normalen Kontrolle, bestätigt durch (A') ECM im Stadium E14,5-15,5. (B) Ultraschallnachweis eines atrioventrikulären Septumdefekts (AVSD). Die Echobildgebung in der 4-Kammer-Ansicht zeigt die Kommunikation zwischen LA, RA, LV und RV, bestätigt durch (B') ECM im E14.5-Stadium. (C) Die Ultraschalldiagnostik des Ventrikelseptumdefekts (VSD) mit Farbfluss zeigt den Fluss über LV und RV, bestätigt durch (C') ECM im Stadium E16.5. (D) Echo und (D') ECM zeigen DORV mit einem VSD zwischen LV und RV mit nebeneinander liegenden großen Arterien (Aorta befindet sich direkt zur Lungenarterie) im Stadium E14.5. (E) Die Ultraschalldiagnostik des persistierenden Truncus arteriosus (PTA) zeigt die Kommunikation zwischen LV und RV mit einem einzigen Abflusstrakt, der beide Ventrikel (PTA) außer Kraft setzt. (E') Diese Pathologie wird durch ECM im Stadium E14.5 bestätigt. Maßstabsbalken: 0,5 mm. AO: Aorta, AVSD: atrioventrikulärer Septumdefekt, Cd: kaudal, Cr: kranial, L: links, LA: linker Vorhof, LV: linker Ventrikel, PA: Lungenarterie, PTA: persistierender Truncus arteriosus, R: rechts, RA: rechter Vorhof, RV: rechter Ventrikel, VSD: Ventrikelseptumdefekt. Maßstabsleiste: 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Bühne | Kronen-Steiß-Länge (mm) | Fötusfläche (mm2) | Herzbereich (mm2) | Herzbereich/Fötusbereich |
| E12,5 | 7,9 ± 0,8 (n = 77) | 23,2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13,5 | 10,5 ± 0,9 (n = 92) | 40,9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14,5 | 12,5 ± 0,9 (n = 101) | 57,6 ± 8 (n = 101) | 2,9 ± 0,5 (n = 70) | 0,050 ± 0,004 (n = 70) |
| E15,5 | 14,1 ± 0,5 (n = 134) | 71,4 ± 6 (n = 134) | 3,8 ± 0,4 (n = 87) | 0,053 ± 0,004 (n = 87) |
| E16.5 | 15,4 ± 0,6 (n = 112) | 82,7 ± 6 (n = 112) | 4,9 ± 0,5 (n = 87) | 0,058 ± 0,007 (n = 87) |
| E17,5 | 16,6 ± 0,4 (n = 211) | 96,9 ± 7 (n = 211) | 6,1 ± 0,6 (n = 146) | 0,063 ± 0,004 (n = 146) |
| E18,5 | 17,7 ± 0,6 (n = 139) | 112,1 ± 8 (n = 139) | 7,1 ± 0,8 (n = 93) | 0,063 ± 0,005 (n = 93) |
| E19,5 | 18,7 ± 0,7 (n = 57) | 126,7 ± 8 (n = 57) | 7,7 ± 0,7 (n = 36) | 0,062 ± 0,005 (n = 36) |
Tabelle 1: Entwicklungsprofil des fetalen Wachstums.
| E14,5 | E16.5 | E18,5 | Neugeborene | |
| 70% Ethanol | 1 Std. | 1,5 Std. | 3 Std. | 4 Std. |
| 95% Ethanol | 35 Min. | 45 Min. | 1 Std. | 1 Std. |
| 95% Ethanol | 35 Min. | 45 Min. | 1 Std. | 1 Std. |
| 100% Ethanol | 15 Min. | 15 Min. | 30 Min. | 6 Min. |
| Xylol 1 | 20 Min. | 30 Min. | 40 Min. | 30 Min. |
| Xylol 2 | 20 Min. | 30 Min. | 40 Min. | 30 Min. |
| Wachs 1 | 20 Min. | 20 Min. | 20 Min. | 30 Min. |
| Wachs 2 | 20 Min. | 20 Min. | 20 Min. | 30 Min. |
| Wachs 3 | Übernacht | Übernacht | Übernacht | Übernacht |
Tabelle 2: Protokoll für die Einbettung von Embryonen auf der Grundlage von Embryonaltagen.
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Discussion
Genetisch veränderte Mäuse wurden verwendet, um die Pathomechanismen von angeborenen Herzfehlern zu verstehen. Die Protokolle, die wir in dieser Studie zur Verfügung stellen, versuchen, den Prozess der Beurteilung von fetalen Herzfehlern der Maus zu rationalisieren und zu standardisieren. Es gibt jedoch kritische Schritte, die während des Protokolls zu beachten sind. Mausembryonen wachsen an jedem Tag der Schwangerschaft signifikant, und der richtige Zeitpunkt für die Ernte einer Maus kann durch ein fetales Echokardiogramm genau bestimmt werden. Das fetale Echokardiogramm kann verwendet werden, um die fetale kardiovaskuläre Pathologie zu untersuchen. Ein 2D-Bild ermöglicht die Identifizierung von abnormaler Anatomie und Herzfunktion mit Hilfe von Farbdoppler, um den Blutfluss zu untersuchen und die Kommunikation zwischen den Herzkammern oder abnormalen Abfluss- und Zuflusstrakten zu erkennen. Um die KHK-Diagnose zu stellen, werden die Föten ab dem embryonalen Tag E14.5 gescannt, wenn die Septation des Abflusstraktes und die Herzkammerbildung abgeschlossen sind. Das Scannen in früheren Stadien könnte die Entwicklungsverzögerung widerspiegeln.
Die Histopathologie ist der Standard zur Charakterisierung von KHK8 unter Verwendung eines Mikrotoms, gefolgt von einer lichtmikroskopischen Visualisierung. Der große Nachteil der Standardmethode ist das Fehlen einer intuitiven 3D-Darstellung der kardiovaskulären Strukturen für die Diagnose und die Einschränkung in der fehlenden Bereitstellung unterschiedlicher Ansichten der Proben. Eine ECM-Histologie ist die zeiteffizienteste Methode zur Charakterisierung von Herzfehlern. Wenn keine EZM verfügbar ist, kann ein Mikrotom verwendet werden, um den Embryo zu schneiden und kardiale Phänotypen zu bestimmen. Weitere Möglichkeiten für die kardiale Bildgebung sind die Durchführung von hochauflösenden Magnetresonanztomographen (MRT) oder Computertomografien (CT). Ein wichtiger Aspekt der MRT oder CT ist, dass mehrere Embryonen gleichzeitig abgebildet werden können. Aber auch nach einer Ultraschall-, CT- oder MRT-Phänotypisierung ist eine Histopathologie erforderlich, um eine KHK-Diagnose zu bestätigen.
Unter Verwendung der ECM-Bildgebung für die Histopathologie wird der Embryo nach jedem Schnitt mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop, das über dem automatischen gleitenden Mikrotom montiert ist, seriell abgebildet. Die Einzelbilder, die von ECM gesammelt wurden, ermöglichen nachfolgende 3D-Rekonstruktionen und ermöglichen es, die Proben in jeder Bildgebungsebene digital zu schneiden, ohne dass die Bilder erneut aufgenommen werdenmüssen 8,11. Eine solche Operation ermöglicht eine umfassende Beurteilung der Herzanatomie, die in verschiedenen Entwicklungsstadien eingesetzt werden kann. Darüber hinaus konnten einzelne Objektträger aus dem Mikrotom wiederhergestellt werden, während die Daten von den ECM-Geräten gesammelt wurden. Obwohl die ECM-Histopathologie der Goldstandard für die Beurteilung struktureller Herzanomalien ist, gibt es Einschränkungen bei der Verfügbarkeit von Geräten, Software und Laufzeit pro Embryo. Die Laufzeit bis zum Schneiden eines embryonalen Herzens kann je nach Größe zwischen 1 und 3 Stunden pro Probe variieren. Aufgrund der Komplexität der Ausrüstung müssen die Forscher regelmäßig am Computer überprüfen, ob die Region von Interesse innerhalb des Feldes aufgezeichnet wird. Die Forscher müssen die Probe auch überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Paraffinwachsspäne die Probe vom Laserscanner blockieren.
ECM und anschließende 3D-Rekonstruktion bieten eine vollständige, hochauflösende Beurteilung jedes strukturellen Herzfehlers, unabhängig vom Einbettungsplan der Probe. Diese Protokolle haben dazu beigetragen, eine Reihe von KHK erfolgreich zu diagnostizieren und es uns ermöglicht, die kardiale Embryogenese in murinen Modellen und Pathologien im Zusammenhang mit genetischen Mutationen zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass in diesem Manuskript keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Nichts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
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