Summary
מאמר זה מפרט את שיטות האבחון של מחלת לב מולדת (CHD) באמצעות אקוקרדיוגרפיה עוברית, נקרופסיה, ולכידת תמונה פלואורסצנטית אפיסקופית (EFIC) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM) ואחריו שחזור תלת ממדי (3D).
Abstract
מחלות לב מולדות (CHDs) הן הגורמים העיקריים למוות תינוקות בארצות הברית. בשנות השמונים ולפני כן, רוב החולים עם CHD בינוני או חמור מתו לפני הבגרות, עם התמותה המקסימלית בשבוע הראשון לחיים. התקדמות יוצאת דופן בטכניקות כירורגיות, גישות אבחון וניהול רפואי הובילו לשיפור ניכר בתוצאות. כדי לענות על הצרכים המחקריים הקריטיים של הבנת מומי לב מולדים, מודלים של מורין סיפקו פלטפורמת מחקר אידיאלית, מכיוון שיש להם אנטומיה דומה מאוד לבני אדם ושיעורי הריון קצרים. השילוב של הנדסה גנטית עם כלי פנוטיפ בעלי תפוקה גבוהה איפשר שכפול ואבחון של מומי לב מבניים כדי להבהיר עוד יותר את המסלולים המולקולריים שמאחורי CHDs. השימוש באקוקרדיוגרפיה עוברית לא פולשנית כדי לסנן את הפנוטיפים הלבביים במודלים של עכברים יחד עם הנאמנות הגבוהה של לכידת תמונה פלואורסצנטית אפיסקופית (EFIC) באמצעות היסטופתולוגיה של מיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM) עם שחזורים תלת ממדיים (3D) מאפשרים מבט מפורט על האנטומיה של מומי לב מולדים שונים. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מלאה של שיטות אלה כדי לקבל אבחנה מדויקת של מומי לב מולדים. יישום פרוטוקול פנוטיפ זה על אורגניזמים מודל יאפשר אבחון מדויק של CHD, ויניב תובנות לגבי המנגנונים של CHD. זיהוי המנגנונים הבסיסיים של CHD מספק הזדמנויות לטיפולים והתערבויות פוטנציאליים.
Introduction
מחלות לב מולדות (CHDs) הן המומים המולדים הנפוצים ביותר בילוד 1,2, המשפיעות על כ-0.8%-1.7% מהיילודים וגורמות לתמותה ותחלואה משמעותית בילוד3. אטיולוגיה גנטית מסומנת בחוזקה עם CHDs 4,5. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית שימשו באופן נרחב כדי להבין את המורכבות של CHDs ואת המנגנונים הגורמים להם עקב עכברים בעלי לבבות בעלי ארבעה חדרים ורצפי DNA התפתחותיים לבביים דומים בעכברים ובעוברים אנושיים6. זיהוי הפנוטיפ של מוטציות העכבר הוא הצעד הראשון הבסיסי באפיון תפקודו של גן היעד. מודלים עכבריים המבטאים השפעות מינון גנים, שבהם מוטציה גנטית אחת יכולה לגרום לספקטרום של פגמים לבביים המחקים CHDs אנושיים, חשובים להבנת המורכבות של CHDs והמנגנונים הגורמים להם.
מאמר זה מתאר צינור לאפיון פנוטיפים לבביים במודלים של עכברים. השיטות המיושמות משתמשות באקו לב עוברי 7, ואחריו נקרופסי והיסטופתולוגיה ECM7,8, שיכולים להציג את האנטומיה המפורטת של התפתחות פנוטיפים לבביים. אקו לב עוברי הוא שיטה לא פולשנית המאפשרת הדמיה ישירה של עוברים מרובים ברזולוציית הדמיה סבירה. בנוסף, אקו לב עוברי מספק קביעה מהירה של המספר הכולל של עוברים בהמלטה, שלבי התפתחותם, ואת הכיוון והמיקום היחסי בקרן הרחם. באמצעות זרימת דופלר/צבע ספקטרלית, ניתן לזהות עוברים חריגים על סמך המבנה, ההפרעה ההמודינמית, הגבלת הגדילה או התפתחות ההידרופים. מכיוון שמחקר אקו לב עוברי הוא טכניקה לא פולשנית, ניתן להשתמש בו כדי לסרוק מספר ימים ולצפות בשינויים בהמודינמיקה או במורפולוגיה של הלב. השגת הדמיה איכותית של אקו לב עוברי דורשת תרגול ומיומנות, שכן מומי לב ספציפיים עלולים להחמיץ בשל חוסר ניסיון וידע. בגלל זה, ניתוח סופי יותר של מורפולוגיה הלב ניתן להשיג באמצעות שילוב של נקרופסי היסטופתולוגיה ECM. נקרופסי מספק הדמיה ישירה של מבנה הקשת, היחסים היחסיים של אבי העורקים ועורק הריאה, גודל החדרים והאטריה, מיקום הלב ביחס לחזה והמבנים הברונכופולמונריים. עם זאת, תכונות פנים כגון שסתומי הלב ועובי הדופן עשויים להיות קשים להערכה באמצעות נקרופסי בלבד. לכן, היסטופתולוגיה ECM מומלץ לאבחנה חד משמעית. היסטופתולוגיה ECM היא טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרת שחזור דו-ממדי ותלת-ממדי של מחסנית התמונות9. תמונות אלה מתקבלות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית אפיסקופית סדרתית של דגימה משובצת פרפין כפי שהיא חתך דק במרווח קבוע על ידי מיקרוטום אוטומטי. שלא כמו היסטולוגיה קלאסית, תמונות נלכדות כמקטע לפני שהוא נחתך מהבלוק כך שכל התמונות נלכדות באותה מסגרת התייחסות. מסיבה זו, מחסנית התמונות הדו-ממדית המיוצרת על ידי היסטופתולוגיה ECM עשויה להיות משוחזרת בקלות ובאמינות בשלושה ממדים. הדבר נעשה באמצעות מציג DICOM, המאפשר הדמיה תלת ממדית של התמונות בשלושת המישורים האנטומיים: קורונלי, קשת ורוחבי. משחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה אלה, ניתן לבצע אבחנה לבבית סופית. היישום של שלוש שיטות הדמיה שונות אלה, בנפרד או בשילוב, יכול לספק אפיון מדויק של מומי לב מבניים בעוברי עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש בעכברים למחקרים אלה הכרחי מכיוון שלעכברים יש לבבות בעלי ארבעה חדרים שיכולים לחקות CHD אנושיים. עכברים קיבלו טיפול וטרינרי ושוכנו במתקן לטיפול בבעלי חיים של האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AAALAC) של המוסד. פרוטוקולים קפדניים נשמרו כדי למזער את אי הנוחות, הלחץ, הכאב והפציעה של העכברים. עכברים הומתו באמצעות גזCO2 , המקובל על מכרסמים קטנים על פי הנחיות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית בנושא המתת חסד. המחקרים על עכברים בכתב יד זה בוצעו עם פרוטוקול IACUC מאושר באוניברסיטת פיטסבורג.
1. אקו לב עוברי
הערה: אקו לב הוא כלי רב עוצמה לזיהוי מום קרדיווסקולרי ומומים חוץ-לבביים בעכברים. בשל גודלם הקטן של עוברי העכבר (כ 1-2 מ"מ באמצע ההריון, 3.5 מ"מ בלידה), ציוד אקו לב בתדר גבוה במיוחד עם ביומיקרוסקופיה אולטרסאונד (UBM) נדרש. UBM מספק בדיקות שונות בתדר גבוה (30-50 MHz) עם חלון הדמיה קטן (15 מ"מ x 14 מ"מ) המספק את הרזולוציה (30 מיקרומטר אקסיאלי x 68 מיקרומטר לרוחב) כדי לדמיין עובר עכבר אחד בכל פעם. מתמר 40 MHz מספק תמונות ברזולוציה גבוהה לזיהוי פנוטיפים קרדיווסקולריים7.
- הפעל את מכשיר האקו לב ובחר את התוכנית קרדיולוגיה.
הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול הבא עבור כל רקע עכבר מהיום העוברי (E) 14.5 עד 19.5. - מרדימים את העכבר הרצוי בתא אינדוקציה הרדמה. יש להשרות הרדמה באמצעות ריכוז של 4% איזופלורן וחמצן רפואי בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה ולהפחית אותו ל-2%-3% לצורך תחזוקה.
- הנח את העכבר על פלטפורמת ההדמיה במהירות. פלטפורמת ההדמיה כוללת פלדה מחוממת כדי לשמור על חום העכבר במהלך ההליך. שים את הפה והאף של העכבר לתוך חרוט האף הרדמה. אבטח את הגפיים עם סרט כדי למנוע תנועה. נטרו את הדופק כדי לוודא שהוא נשאר בין 400-450 פעימות לדקה.
- עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות בדיקת מדחום רקטלי וודא שהיא נחה ב 37 ° C ± 0.5 ° C. לפקח על הנשימה כדי למנוע היפוקסיה. שמור על כוח עדין על הבדיקה כדי למנוע נזק.
הערה: ניתן להציב מנורת חום מעל העכבר כדי למנוע היפותרמיה מתחת וכדי להתאושש מהרדמה. משחה אופתלמית פטרולטום יכולה לשמש כחומר סיכה כדי למנוע עיניים יבשות. - הסר את הפרווה מבית החזה והבטן באמצעות קרם depilatory. יש למרוח את הקרם ולהמתין 3 דקות לפני ההסרה. נקו את האזור עם 70% אתנול. אתנול עובד טוב יותר ממים כחומר סיכה לגילוח.
- יש לחמם את ג'ל האולטרסאונד לטמפרטורת גוף רגילה. מרחו את ג'ל האולטרסאונד בנדיבות והניחו את המתמר על הבטן כדי לכוון אותו במישור אופקי ולזהות את שלפוחית השתן על המסך. לאחר זיהוי שלפוחית השתן, יש לסרוק גולגולת משלפוחית השתן ולחפש את העובר. מדדו את אורך הכתר עד העכוז כדי לקבוע את גילההיריון 10 (איור 1 וטבלה 1).
הערה: שנו את מיקומי המתמרים כדי להמחיש מישורים שונים, כולל מישורי הדימות הרוחביים בעלי ארבעת החדרים, הקשת ומישורי ההדמיה הקדמית/קורונלית7 (איור 1). - השתמש בצבע דופלר כדי לנתח את זרימת הדם מהלב.
- החזירו את העכבר לכלוב אם העוברים לא הגיעו לשלב המיועד. אחרת, להכין את העכבר לקציר.
הערה: ודא שהעכבר כבר ער ומתאושש היטב מההרדמה לפני החזרתו לכלוב. - כבו איזופלורן וחמצן, נקו את אזור העבודה וכבו את המכונה.
הערה: חשוב להסיר את הג'ל מהמתמר.
2. נקרופסי
הערה: ברגע שיש חשד לפנוטיפים לבביים חריגים באמצעות אקוקרדיוגרפיה עוברית, העוברים נאספים ומקובעים באמצעות טבילה של כל הגוף בתמיסה המקבעת: 10% פורמלין פוספט חוצץ או 4% פרפורמלדהיד (PFA). בדוק את המורפולוגיה החיצונית והפנימית של הדגימה, וחפש חריגות אנטומיות מקרוסקופיות או מומים מקרוסקופיים.
- הכן את העכבר.
- אם העכבר הוא מבוגר, להרדים את העכבר באמצעות פרוטוקול CO2 סטנדרטי. השתמש במלקחיים או מספריים לנתח כדי לבצע חתכים (כ -3 ס"מ) בבית החזה והבטן לרוחב כדי לאפשר חדירה של הקיבוע לתוך האיברים הפנימיים.
הערה: הדגימה צריכה להיות קבועה לפחות 24 שעות לפני נקרופסי אם העובר הוא מעל E14.5.
- אם העכבר הוא מבוגר, להרדים את העכבר באמצעות פרוטוקול CO2 סטנדרטי. השתמש במלקחיים או מספריים לנתח כדי לבצע חתכים (כ -3 ס"מ) בבית החזה והבטן לרוחב כדי לאפשר חדירה של הקיבוע לתוך האיברים הפנימיים.
- לנתח את החלק החיצוני של הגוף.
- הגדר את התוכנה לשמירת התמונות עם שם, כולל זיהוי הדגימה, הגדלת המיקרוסקופ ותוכן התמונה.
הערה: הגדלה של פי 1.0 עד פי 3.2 צריכה להתאים להדמיה של רוב המבנים בעכברי E14.5 ומעלה. - הניחו את העכבר על הצלחת מתחת לעדשת המיקרוסקופ. מלא את הצלחת במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי לכסות לחלוטין את הדגימה כדי למנוע התייבשות והשתקפות בתמונות. כוונן את ההגדלה כך שהמסך יכלול את כל העובר, ולאחר מכן צלם תמונה של הצד השמאלי והימני של העובר.
הערה: תחתית הצלחת צריכה להיות מצופה בפרפין, סיליקון או מצע אחר כזה כדי להקל על ההצמדה. - נעצו את הדגימה בגרונו, כשפניו כלפי מעלה, וצלמו תמונה נוספת.
הערה: כוון את הסיכה מעט כלפי מעלה כדי להבטיח שלא ינוקבו מבנים חשובים של חלל בית החזה.
- הגדר את התוכנה לשמירת התמונות עם שם, כולל זיהוי הדגימה, הגדלת המיקרוסקופ ותוכן התמונה.
- לנתח את החזה.
- תוך כדי הרמת העור באמצע הצוואר עם מלקחיים, חותכים את העור לכיוון שני בתי השחי עם המספריים לפני חיתוך העור לאורך הציר החציוני לכיוון הזנב. לאחר מכן, לחתוך את העור מן הטבור אל הרגליים. הצמידו את הדגימה דרך פרקי הידיים והקרסוליים.
הערה: יש להקפיד לחתוך רק את העור. מומלץ להחזיק את להבי המספריים אופקית או בזווית כלפי מעלה. - כדי לנתק את רקמת החיבור, הרימו את העור עם זוג מלקחיים אחד תוך החזקת הרקמה הבסיסית במקומה עם הזוג השני. נעצו את הדגימה דרך העור כדי לעזור לחשוף את החזה והבטן (איור 2).
הערה: מתיחה רבה מדי בזמן הצמדה, חיתוך או גירוד עלולה לגרום נזק לרקמות. - צלם תמונה של השרירים החשופים, ולאחר מכן לגרד בעדינות את השרירים כדי לחשוף את הצלעות.
- צלמו את הצלעות החשופות. מפרידים את הצלעות מהסרעפת וחותכים את הצלעות משני הצדדים ככל האפשר על הציר הצידי לכיוון הצוואר.
- לחשוף את הלב על ידי הסרת צלעות לחתוך. צלם תמונה של הלב.
- הוציאו את בלוטת התימוס על-ידי קילוף עם זוג מלקחיים אחד. השתמשו בזוג המלקחיים השני כדי לייצב את בסיס בלוטת התימוס כדי למנוע קריעת כלי הדם שמתחתיו. צלמו את הלב ואת הכלים הגדולים.
הערה: שימוש בפינים כדי למתוח מבנים סמוכים עשוי לסייע בקבלת תצוגות הדמיה טובות יותר. בנוסף, צלמו תמונות נפרדות המתמקדות בעורקים הגדולים, בלב ובמבנים מעניינים אחרים מכיוון שהם עשויים שלא להיות בפוקוס יחד.
- תוך כדי הרמת העור באמצע הצוואר עם מלקחיים, חותכים את העור לכיוון שני בתי השחי עם המספריים לפני חיתוך העור לאורך הציר החציוני לכיוון הזנב. לאחר מכן, לחתוך את העור מן הטבור אל הרגליים. הצמידו את הדגימה דרך פרקי הידיים והקרסוליים.
- לנתח את הבטן.
- משוך את הסרעפת כדי להסיר אותה ולחשוף את הכבד. צלמו תמונה.
- הצמידו לאחור את הכבד כדי לחשוף את הקיבה והלבלב. צלמו תמונה.
- חותכים את הוושט. הסר את המעי הגס ואת המעיים על ידי משיכתם החוצה עם מלקחיים. לחתוך ממש מעל הכבד ולהסיר אותו כדי לחשוף את הכליות ואת בלוטות יותרת הכליה. צלמו תמונה.
הערה: יש לשמור את האיברים שהוסרו בתמיסה המקבעת.
- בודד את בית החזה עבור ניתוח ECM.
- חותכים את בית החזה התחתון לאורך קו ישר בין הכבד לריאות. חותכים את הראש גבוה מספיק כדי לא לחתוך את ההסתעפויות של עורקי התרדמה.
- הסירו בעדינות את הצלעות הצידיות תוך שמירה על הצלעות הגביות ועמוד השדרה. מקלפים ומגרדים את השומן הגבי.
- נתקו את בית החזה משאר הגוף והניחו אותו בתמיסת פורמלין פוספט חוצצת 10%.
3. הטבעה
- דקקו את הקיבוע לבקבוק פסולת מסוכנת מתאים. שטפו את הדגימות עם 1x PBS במשך 15 דקות שלוש פעמים.
- השתמש בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול, וקסילן כדי לייבש את הדגימות. משך כל השלבים הבאים תלוי בשלב העוברים. עיין בטבלה 2 לקבלת פרטים.
הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת שינוי פתרונות כדי למנוע נזק לדגימות. הפרמטרים האופטימליים לעיבוד מדגם ניתנים להתאמה אמפירית. קסילן ימיס פלסטיק מסוים; יש להשתמש בכלי זכוכית ומיכלים. - החלף קסילן עם פרפין למשך הזמן הרצוי. השאירו את הבקבוקים באינקובטור של 65°C למשך הזמן המתאים (טבלה 2).
- השתמש פרפין טרי להטביע את הדגימות במיקום הרצוי.
הערה: מומלץ לכוון את הדגימה לאמצע גוש הפרפין, כאשר הצד הגבי שלה פונה למעלה והצד האחורי פונה לקדמת הבלוק. בעת כיוון הדגימה, זכור כי הדגימה מוטבעת כאשר הבלוק פונה הפוך.
4. מיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM)
הערה: לאחר הטבעה מתאימה, עוברים עוברים איסוף תמונות סדרתי באמצעות ECM לצורך ניתוח היסטופתולוגי. ניתן לשחזר שקופיות בודדות מהמיקרוטום למחקרים נוספים.
- מוציאים את גוש הפרפין מהמקפיא בטמפרטורה של -20°C ומסירים את תבניות המתכת.
- השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את השעווה בקצוות ובגב הקלטת. חותכים את השעווה המקיפה את הדגימה עד שהיא עטופה בריבוע שעווה קטן המחובר לקלטת.
הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול בלהבים. - השתמש בידית המתכת כדי להדק את בלוק הפרפין לשלב החיתוך של המיקרוטום. בחר את פונקציית MAN (ידנית) במצב הפעלה, הרם את פני השטח של הפרפין קרוב ללהב והפעל כמה שקופיות כדי לוודא שהלהב בא במגע עם בלוק הפרפין.
- פתח את יישום LAS AF ובחר MatrixScreener. בחר מטריצה רגילה יחידה וטען את התבנית המתאימה שנשמרה בעבר. לחץ על כפתור Quick LUT כדי לעבור לאומברה לבנה וכתומה.
- בחר Set Up Jobs וגרור את מדפסת הלייזר הגלויה של 405 ננומטר למקסימום. התאם את הקצה השמאלי של גוש הספקטרום לקו 405 ננומטר וגרור את הקצה הימני לקו 800 ננומטר. סמן את האפשרות Pinhole והפעל את תצוגת Live .
- התאם את מיקום הקרנת הלייזר כדי למרכז את הדגימה על המסך וכוונן את ידית הזום ל~20x. כדי למטב את הרזולוציה, הגדר את הרווח ל- 1,250 V והגדל את האזור הכחול באמצעות ידית המיקוד; לאחר מכן, אפס את הרווח ל- 750 V בקירוב לצורך הדמיה.
הערה: ערכים ספציפיים עשויים להשתנות בהתאם למצב העובר. - העבר את שיטת החיתוך לאוטומטי, הגדר את העובי לסביבות 50 מיקרומטר, והפעל את השקפים. הפסיקו לחתוך כאשר הריאות ודרכי הנשימה גלויות.
- בחר עובי חיתוך בין 8-10 מיקרומטר ועצור את תצוגת Live . פתח את Microtome Communicator כדי להתחיל בהדמיה. ודא שתיקיית האחסון הזמני ריקה לפני איסוף תמונות.
- יש להפסיק לחתוך כאשר לא מדמיינים מבנה לב נוסף. סגור את היישום Microtome Communicator וייצא את הקובץ הזמני לסדרת תמונות אחת .tiff באמצעות תוכנת עיבוד התמונה לשחזורים תלת-ממדיים מאוחר יותר.
5. שחזור תלת מימדי (3D)
הערה: מטרת השחזור התלת-ממדי היא לעבד מחסנית תמונות דו-ממדית מהדמיית ECM לסרטוני תלת-ממד בכיווני העטרה, הקשת והרוחב ולהשתמש בסרטוני התלת-ממד לאבחון הפרעות מבניות ואנטומיות בדגימות.
- פתח את אוסף התמונות ECM בתוכנת עיבוד התמונה.
- גרור ושחרר את הקבצים לתוך תוכנת עיבוד התמונה. הפוך אופקית את תמונות ECM באמצעות בחירה באפשרות Image > Transform > Flip Horizontally בשורת התפריטים.
- שמור את התמונה ההפוכה וסגור את תוכנת עיבוד התמונה.
- ייבא את אוסף התמונות ECM בתוכנת התצוגה DICOM.
- גרור ושחרר את תמונות ECM הפוכות אופקית בתוכנת התצוגה DICOM. ודא שיש גבול כחול בהיר מסביב לרשימה לדוגמה, או שתמונות עשויות להתווסף לתיקיית דוגמאות קיימת.
- בחר את הקישורים או הקבצים שברצונך להעתיק למסד הנתונים כשהחלון הנפתח מופיע. דוגמה חדשה תופיע ברשימה לדוגמה בשם זהה לשם הקובץ שהועתק לתוכנת התצוגה DICOM.
- לחץ על הקובץ החדש שנוסף כדי לפתוח אותו.
- בצע שחזור תלת מימד.
- לאחר פתיחת הקובץ, לחץ על תפריט כלי שחזור 2D/ 3D מסרגל הכלים ובחר 3D MPR.
- עבור רזולוציית Pixel X ורזולוציית Pixel Y, הזן את רזולוציית התמונה על-ידי מתן הזום המשמש במהלך הדמיית ECM. עבור מרווח הפרוסה, הזן את עובי הפרוסה המשמש לחיתוך במהלך הדמיית ECM.
הערה: רזולוציית המצלמה משתנה בהתאם לזום המצלמה ועשויה להיות שונה ממצלמה למצלמה.
- השתמש בכלים השונים מהכרטיסייה כלים בצד שמאל כדי להתאים אוספי תמונות כרצונך.
- השתמש בכלי WW/WL כדי להתאים את רוחב החלון ואת רמת החלון. לחצו וגררו את הכלי בתמונה כלפי מעלה כדי להקטין את בהירות התמונה וכלפי מטה כדי להגדיל אותה. לחצו וגררו את הכלי בתמונה ימינה כדי להקטין את ניגודיות התמונה ושמאלה כדי להגדיל אותה.
הערה: הגדרות WW/WL האופטימליות עבור מבנה אחד עשויות להיות לא אופטימליות עבור מבנה אחר. מסיבה זו, מומלץ ליצור סרטונים נפרדים לצפייה במבנים שונים. - השתמשו בכלי פנורמה לגרירת התמונות למיקומים הרצויים. השתמשו בכלי זום להגדלה או כיווץ של התמונה כרצונכם, ובכלי סיבוב כדי לסובב את התמונה כרצונכם.
הערה: הגדלת תמונות עלולה לגרום לירידה באיכות התמונה. היזהר בעת סיבוב תמונות, שכן הדבר עלול לגרום לצירים להתהפך.
- השתמש בכלי WW/WL כדי להתאים את רוחב החלון ואת רמת החלון. לחצו וגררו את הכלי בתמונה כלפי מעלה כדי להקטין את בהירות התמונה וכלפי מטה כדי להגדיל אותה. לחצו וגררו את הכלי בתמונה ימינה כדי להקטין את ניגודיות התמונה ושמאלה כדי להגדיל אותה.
- לחצו וגררו את הציר הצבעוני של החלונית הראשונה. שימו לב כיצד סיבוב ציר זה משנה את הכיוון של שתי החלוניות האחרות. סובבו את צירי שלושת הלוחות עד ששלושת הלוחות ייצגו תצוגות קורונליות, קשתות ורוחביות של הדגימה.
הערה: בעת כיוון מחדש של הדגימות, שמור על כיוון קדמי/אחורי נכון. - צור סרטונים.
- לאחר שכל שלושת הלוחות ממוקמים, מכוונים ומובהרים כראוי, לחץ על החלונית המייצגת את תצוגת העטרה.
- לחץ על ייצוא סרטים בצד ימין של שורת התפריטים. לחץ על אצווה וגרור את המחוונים From ו - To כדי להקיף את כל אזור העניין. בתיבה ' מרווחי זמן', בחר באפשרות 'זהה לעובי '. שמור את הסרטון המציין את כיוון התצוגה.
- עיין בסרטון כדי לראות אם ניתן לזהות כראוי את מבני העניין. אם לא, השתמש בכלים (שלב 5.4) כדי להתאים מחדש את הסרטונים לפי הצורך ולשמור מחדש את הסרטון.
- חזור על שלב 5.6 עבור תצוגות רוחביות ותצוגות קשת. אבחן את הדגימות באמצעות סרטונים משוחזרים.
הערה: צפו בקפידה בסרטוני הווידיאו בכל כיוון כדי לבצע הערכה מלאה אם הדגימה מציגה הפרעות אנטומיות או פנוטיפים של מחלות (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עוברי עכברים עם פגמים המודינמיים משמעותיים נמצאו קטלניים עובריים. ניתן לזהות מגוון רחב של CHDs באמצעות אקו לב עוברי בעל תפוקה גבוהה ולא פולשנית באמצעות תצוגות שונות (איור 1).
מומים מחיצתיים: ה- CHDs הנפוצים ביותר הם פגמים מחיצתיים כגון פגם מחיצה חדרית (VSD), פגם מחיצה אטריובנטריקולרי (AVSD), ופגם מחיצה פרוזדורי (ASD)1. ניתן להמחיש בקלות VSD או AVSD באמצעות תמונות דו-ממדיות ותמונות זרימת צבע. ניתן לזהות בקלות זרימת דם דרך החדרים או בין האטריה לחדרים (איור 3). ASD קשה להבדיל עם פטנט foramen ovale בעובר.
חריגות בדרכי היציאה: כפי שניתן לראות באיור 3, הזרימה בעורק הריאה הראשי היא על פני זרימת אבי העורקים העולה בעוברים רגילים. בעוברים עם מוצא כפול של החדר הימני (DORV), ניתן לראות את שני העורקים הגדולים הנובעים מהחדר הימני. DORV קשור גם ל-VSD (איור 3D) וניתן לזהות אותו באמצעות זרימת צבע. עם זאת, בהתחשב בגודל הקטן של העוברים, לעתים לא ניתן להבדיל באופן מהימן בין DORV לבין דריסת אבי העורקים, אטרזיה ריאתית או truncus arteriosus מתמשך (PTA). ב-PTA, ניתן לראות רק זרימה אחת של דרכי הזרימה החוצה באקו לב עוברי (איור 3E). ניתן לראות את מבנה הקשת המפורט ואת עורק הריאה הראשי באמצעות נקרופסי (איור 2E,F).
נקרופסי יכול לאבחן במהירות את מצב הסיטוס בחזה ובבטן ואת מיקום הלב ביחס לחזה (לבוקרדיה (איור 2C-E) או דקסטרוקרדיה). ניתן לדמיין בקלות את מבני דרכי הזרימה החוצה ואת הגודל היחסי של האטריה והחדרים (איור 2E,F).
היסטופתולוגיה ECM היא טכניקת תקן הזהב להערכת כל אנומליה לבבית מבנית 8,11,12. הוא מספק רזולוציה ופירוט שאין שני לו למבנים של עוברים. שחזור תלת-ממדי באמצעות מישורים ותצוגות שונות יכול לזהות בקלות את הקשר בין העורקים והחדרים הגדולים (איור 3) לבין הפגם בין החדרים לאטריה.
איור 1: המיקומים למדידת אורך עכוז הכתר בתמונות אקו לב דו-ממדיות של עוברים כדי לקבוע את גיל ההריון. תמונות אקו לב דו-ממדיות של עוברים ב-(A) E11.5, (B) E12.5, (C,D) E13.5-E14.5. (D) העובר החולה קטן יותר מאחיו (C) ומצוין שיש לו מראה "עבש" עם הידרופים (חץ). (א-ג) עוברים חיים מדגימים איברים נפרדים. מצב VB מייצג עם תמונות צבע של לב E14.5 בתצוגה קורונלית בעלת 4 חדרים המוטה קדימה כדי לצלם את דרכי הזרימה (E) מדגימות מחיצת חדר שלמה עם הקשר הנורמלי של עורקים גדולים, אשר מאושר עם ECM בתצוגת העטרה (E). (F) מבט סגיטלי מייצג של לב E14.5 מדגים את דרכי היציאה של החדר השמאלי והחדר הימני כאשר אבי העורקים העולה (AO) מכוון גולגולתית ועורק הריאה מופנה אחורית (לכיוון עמוד השדרה), אשר מאושר עם ECM במבט (F') sagittal. (G) מבט רוחבי מייצג של החדר השמאלי (LV) והחדר הימני (RV), אשר מאושר עם ECM בתצוגה הרוחבית (G'). (H) מבט רוחבי בבסיס הלב ב-ECM מדגים מסתם אבי העורקים (AV) ומסתם ריאתי (PV) מובחנים ומופרדים. PV הוא קדמי ל- AV. (H') ECM מייצג תמונת מבט רוחבית של truncus arteriosus מתמשך (PTA) מדגימה את עורק הריאה השמאלי ועורק הריאה הימני הנובעים אחורית מעורק הגזע המתמשך הבלתי מחולק, כאשר עורק התרדמה השמאלי נובע קדמית וגולגולתית מעורק הגזע המתמיד. קיצורים: A: קדמי, AO: אבי העורקים, AV: שסתום אבי העורקים, Cd: קאודלי, Cr: גולגולתי, DAO: אבי העורקים היורד, L: שמאל, LA: אטריום שמאלי, LCA: עורק התרדמה השמאלי, LPA: עורק ריאתי שמאלי, LV: חדר שמאלי, P: אחורי, PA: עורק ריאתי, PTA: truncus arteriosus מתמשך, R: ימין, RA: אטריום ימני, RPA: עורק ריאתי ימני, RV: חדר ימין. סרגל קנה מידה: 0.5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של נקרופסי כדי לצפות בהפרעות לב וכלי דם . (A) עובר המוצמד לצלחת ניתוח בעלת רקע שחור ללא פנוטיפים ברורים. התמונה מציגה את האנטומיה הגסה של הראש, הדיגיטלים, חלל החזה והבטן. (B) הדרמיס מוסר מהגור וחושף בלוטות תת-לסתות, כלוב צלעות ובטן. (C) כלוב הצלעות מורם, וחושף את האנטומיה הגסה של חלל החזה, כולל בלוטת התימוס, הלב, הריאות והסרעפת. (D) מבט מוגדל על החזה עם הסרת כלוב הצלעות. (E) בלוטת התימוס מוסרת, וחושפת כלי דם גדולים וקנה הנשימה. (F) מבט מוגדל על כלי שיט גדולים. קיצורים: AAO: אבי העורקים העולה, D: דיאפרגמה, LA: אטריום שמאלי, LCA: עורק התרדמה השמאלי, LSVC: וריד נבוב עליון שמאלי, LV: חדר שמאל, P: קרום הלב, RA: אטריום ימני, Rb: צלעות, RCA: עורק התרדמה הימני, RL: ריאה ימנית, RSVC: ורידי נבוב עליון ימני, RV: חדר ימין, S: עצם החזה, SCA: עורק סובקלאבי ימני, SMG: בלוטות תת-לסתות, T: קנה הנשימה, Th: בלוטת התימוס. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אקו לב עוברי מייצג (Echo) ותמונות ממיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM). (A) אקו מדגים מחיצת חדר שלמה ללא שאנט בין-חדרי ועורקים גדולים קשורים תקינים בבקרה הרגילה, שאושרה על-ידי (A') ECM בשלב E14.5-15.5. (B) זיהוי אולטרסאונד של פגם מחיצה אטריובנטריקולרי (AVSD). הדמיה של הד בתצוגת 4 החדרים מדגימה את התקשורת בין LA, RA, LV ו-RV, שאושרה על ידי (B') ECM בשלב E14.5. (C) אבחון אולטרסאונד של פגם מחיצה חדרית (VSD) עם זרימת צבע מדגים את הזרימה על פני LV ו- RV, שאושר על ידי (C') ECM בשלב E16.5. (D) Echo ו-(D') ECM מדגימים DORV עם VSD בין LV ל-RV עם עורקים גדולים זה לצד זה (אבי העורקים נמצא ממש לעורק הריאה) בשלב E14.5. (E) אבחון אולטרסאונד של truncus arteriosus מתמשך (PTA) מדגים תקשורת בין LV ו- RV עם מערכת זרימה אחת העוקפת את שני החדרים (PTA). (ה') פתולוגיה זו מאושרת על ידי ECM בשלב E14.5. סרגל קנה מידה: 0.5 מ"מ. AO: אבי העורקים, AVSD: פגם מחיצה אטריובנטריקולרי, Cd: קאודלי, Cr: גולגולתי, L: שמאל, LA: אטריום שמאלי, LV: חדר שמאל, PA: עורק ריאתי, PTA: truncus arteriosus מתמשך, R: ימין, RA: אטריום ימני, RV: חדר ימין, VSD: פגם מחיצה חדרי. סרגל קנה מידה: 0.5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| במה | אורך כתר לראמפ (מ"מ) | אזור העובר (מ"מ2) | אזור הלב (מ"מ2) | אזור הלב/אזור העובר |
| E12.5 | 7.9 ± 0.8 (n = 77) | 23.2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13.5 | 10.5 ± 0.9 (n = 92) | 40.9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14.5 | 12.5 ± 0.9 (n = 101) | 57.6 ± 8 (n = 101) | 2.9 ± 0.5 (n = 70) | 0.050 ± 0.004 (n = 70) |
| E15.5 | 14.1 ± 0.5 (n = 134) | 71.4 ± 6 (n = 134) | 3.8 ± 0.4 (n = 87) | 0.053 ± 0.004 (n = 87) |
| E16.5 | 15.4 ± 0.6 (n = 112) | 82.7 ± 6 (n = 112) | 4.9 ± 0.5 (n = 87) | 0.058 ± 0.007 (n = 87) |
| E17.5 | 16.6 ± 0.4 (n = 211) | 96.9 ± 7 (n = 211) | 6.1 ± 0.6 (n = 146) | 0.063 ± 0.004 (n = 146) |
| E18.5 | 17.7 ± 0.6 (n = 139) | 112.1 ± 8 (n = 139) | 7.1 ± 0.8 (n = 93) | 0.063 ± 0.005 (n = 93) |
| E19.5 | 18.7 ± 0.7 (n = 57) | 126.7 ± 8 (n = 57) | 7.7 ± 0.7 (n = 36) | 0.062 ± 0.005 (n = 36) |
טבלה 1: פרופיל התפתחותי של גדילת עובר.
| E14.5 | E16.5 | E18.5 | היילוד | |
| 70% אתנול | 1 שעות | 1.5 שעות | 3 שעות | 4 שעות |
| 95% אתנול | 35 דק' | 45 דק' | 1 שעות | 1 שעות |
| 95% אתנול | 35 דק' | 45 דק' | 1 שעות | 1 שעות |
| 100% אתנול | 15 דק' | 15 דק' | 30 דק' | 6 דק' |
| קסילן 1 | 20 דק' | 30 דק' | 40 דק' | 30 דק' |
| קסילן 2 | 20 דק' | 30 דק' | 40 דק' | 30 דק' |
| שעווה 1 | 20 דק' | 20 דק' | 20 דק' | 30 דק' |
| שעווה 2 | 20 דק' | 20 דק' | 20 דק' | 30 דק' |
| שעווה 3 | לילה | לילה | לילה | לילה |
טבלה 2: פרוטוקול להטמעת עוברים בהתבסס על ימי עובר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עכברים מהונדסים גנטית שימשו להבנת הפתומנגנונים של מומי לב מולדים. הפרוטוקולים שאנו מספקים במחקר זה מנסים לייעל ולתקנן את תהליך הערכת מומי הלב של העובר. עם זאת, ישנם שלבים קריטיים שיש לציין במהלך הפרוטוקול. עוברי עכבר גדלים באופן משמעותי במהלך כל יום של הריון, ואת הזמן הנכון לקצור עכבר ניתן לקבוע על ידי ביצוע אקו לב עוברי במדויק. ניתן להשתמש באקו לב עוברי כדי לסנן את הפתולוגיה הקרדיווסקולרית של העובר. תמונה דו-ממדית מאפשרת זיהוי אנטומיה ותפקוד לב לא תקינים, בעזרת דופלר צבע לבדיקת זרימת הדם ואיתור תקשורת בין חדרי הלב או יציאות ודרכי זרימה חריגות. כדי לקבוע את אבחנת CHD, עוברים נסרקים מהיום העוברי E14.5 כאשר מחיצת דרכי הזרימה והיווצרות תאי הלב הושלמו. סריקה בשלבים מוקדמים יותר עשויה לשקף את העיכוב ההתפתחותי.
היסטופתולוגיה היא התקן לאפיון CHDs8 באמצעות מיקרוטום ואחריו הדמיה של מיקרוסקופ אופטי. החיסרון העיקרי של השיטה הסטנדרטית הוא היעדר תצוגה תלת ממדית אינטואיטיבית של מבנים קרדיווסקולריים לאבחון והמגבלה בהיעדר מתן תצוגות שונות של הדגימות. היסטולוגיה ECM היא השיטה היעילה ביותר בזמן לאפיון מומים לבביים. אם ECM אינו זמין, ניתן להשתמש במיקרוטום כדי לחתוך את העובר ולקבוע פנוטיפים לבביים. אפשרויות אחרות לקבלת הדמיית לב הן ביצוע דימות תהודה מגנטית ברזולוציה גבוהה (MRI) או טומוגרפיה ממוחשבת (CT). היבט מרכזי אחד של MRI או CT הוא שניתן לצלם עוברים מרובים בו זמנית; עם זאת, גם לאחר פנוטיפ אולטרסאונד, CT או MRI, היסטופתולוגיה נדרשת כדי לאשר כל אבחנה CHD.
באמצעות הדמיית ECM להיסטופתולוגיה, העובר מצולם באופן סדרתי לאחר כל חתך באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המורכב מעל מיקרוטום הזזה אוטומטי. התמונות הבודדות שנאספו מ- ECM מאפשרות שחזורים תלת-ממדיים עוקבים ומאפשרות לשזור את הדגימות באופן דיגיטלי בכל מישור הדמיה מבלי לצלם מחדש את התמונות 8,11. ניתוח כזה מאפשר הערכה מקיפה של אנטומיה לבבית, אשר ניתן להשתמש בה בשלבים התפתחותיים שונים. יתר על כן, שקופיות בודדות ניתן לשחזר מן microtome תוך איסוף הנתונים מציוד ECM. למרות שהיסטופתולוגיה של ECM היא תקן הזהב להערכת כל אנומליה לבבית מבנית, ישנן מגבלות בזמינות הציוד, התוכנה וזמן הריצה לכל עובר. זמן הריצה לחתך לב עוברי יכול לנוע בין 1-3 שעות לדגימה, בהתאם לגודלו. בשל מורכבות הציוד, החוקרים חייבים לבדוק באופן קבוע במחשב כדי לוודא שאזור העניין בתחום נרשם. החוקרים חייבים גם לבדוק את הדגימה כדי לוודא שאף שבבי שעווה פרפין לא חוסמים את הדגימה מסורק הלייזר.
ECM והשחזור התלת-ממדי שלאחר מכן מספקים הערכה מלאה ברזולוציה גבוהה של כל פגם לבבי מבני ללא קשר לתוכנית ההטבעה של הדגימה. פרוטוקולים אלה סייעו לאבחן בהצלחה מגוון של CHDs ואפשרו לנו להבין את האמבריוגנזה הלבבית במודלים מורינים ופתולוגיות הקשורות למוטציות גנטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים בכתב יד זה.
Acknowledgments
ללא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
