Summary
Questo articolo descrive in dettaglio i metodi diagnostici di cardiopatia congenita murina (CHD) utilizzando l'ecocardiografia fetale, la necroscopia e l'acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando la microscopia confocale episcopica (ECM) seguita da ricostruzione tridimensionale (3D).
Abstract
Le malattie cardiache congenite (CHD) sono le principali cause di morte infantile negli Stati Uniti. Nel 1980 e prima, la maggior parte dei pazienti con CHD moderata o grave è morta prima dell'età adulta, con la massima mortalità durante la prima settimana di vita. Notevoli progressi nelle tecniche chirurgiche, negli approcci diagnostici e nella gestione medica hanno portato a notevoli miglioramenti nei risultati. Per affrontare le esigenze di ricerca critiche per comprendere i difetti cardiaci congeniti, i modelli murini hanno fornito una piattaforma di ricerca ideale, in quanto hanno un'anatomia cardiaca molto simile agli esseri umani e brevi tassi di gestazione. La combinazione di ingegneria genetica con strumenti di fenotipizzazione ad alto rendimento ha permesso la replicazione e la diagnosi di difetti cardiaci strutturali per chiarire ulteriormente i percorsi molecolari alla base delle malattie coronariche di CHD. L'uso dell'ecocardiografia fetale non invasiva per lo screening dei fenotipi cardiaci nei modelli murini insieme all'alta fedeltà dell'acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando l'istopatologia della microscopia confocale episcopica (ECM) con ricostruzioni tridimensionali (3D) consente una visione dettagliata dell'anatomia di vari difetti cardiaci congeniti. Questo protocollo delinea un flusso di lavoro completo di questi metodi per ottenere una diagnosi accurata dei difetti cardiaci congeniti murini. L'applicazione di questo protocollo di fenotipizzazione agli organismi modello consentirà una diagnosi accurata di CHD, fornendo informazioni sui meccanismi della CHD. Identificare i meccanismi alla base della CHD offre opportunità per potenziali terapie e interventi.
Introduction
Le cardiopatie congenite (CHD) sono il difetto alla nascita neonatale più comune 1,2, che colpisce circa lo 0,8%-1,7% dei neonati e provoca una significativa mortalità e morbilità neonatale3. Un'eziologia genetica è fortemente indicata con CHDs 4,5. I modelli murini geneticamente modificati sono stati ampiamente utilizzati per comprendere la complessità delle malattie coronariche e i meccanismi che le causano a causa dei topi con cuori a quattro camere e sequenze di DNA dello sviluppo cardiaco comparabili nei feti di topo e umani6. L'identificazione del fenotipo dei mutanti murini è il primo passo fondamentale per caratterizzare la funzione del gene bersaglio. I modelli murini che esprimono effetti di dosaggio genico, in cui una singola mutazione genetica può provocare uno spettro di difetti cardiaci che imitano i CHD umani, sono importanti per comprendere la complessità dei CHD e i meccanismi che li causano.
Questo articolo delinea una pipeline per caratterizzare i fenotipi cardiaci nei modelli murini. I metodi applicati utilizzano l'ecocardiogramma fetale 7, seguito da necroscopia e istopatologia ECM 7,8, che può visualizzare l'anatomia dettagliata dello sviluppo di fenotipi cardiaci murini. Un ecocardiogramma fetale è una modalità non invasiva che consente la visualizzazione diretta di più embrioni con una risoluzione di imaging ragionevole. Inoltre, un ecocardiogramma fetale fornisce una rapida determinazione del numero totale di embrioni in una cucciolata, delle loro fasi di sviluppo e del relativo orientamento e posizione nel corno uterino. Utilizzando un Doppler spettrale / flusso di colore, gli embrioni anomali possono essere identificati in base alla struttura, al disturbo emodinamico, alla restrizione della crescita o allo sviluppo di idrope. Poiché uno studio ecocardiogramma fetale è una tecnica non invasiva, può essere utilizzato per eseguire scansioni su più giorni e per osservare i cambiamenti nell'emodinamica o nella morfologia cardiaca. Ottenere immagini di alta qualità degli ecocardiogrammi fetali richiede pratica e abilità, poiché specifici difetti cardiaci possono essere persi a causa della mancanza di esperienza e conoscenza. Per questo motivo, un'analisi più definitiva della morfologia cardiaca può essere ottenuta attraverso una combinazione di necroscopia e istopatologia ECM. La necroscopia fornisce la visualizzazione diretta della struttura dell'arco, delle relazioni relative dell'aorta e dell'arteria polmonare, della dimensione dei ventricoli e degli atri, della posizione del cuore rispetto al torace e delle strutture broncopolmonari. Tuttavia, le caratteristiche interne come le valvole cardiache e lo spessore della parete possono essere difficili da valutare attraverso la sola necroscopia. Pertanto, l'istopatologia ECM è raccomandata per una diagnosi conclusiva. L'istopatologia ECM è una tecnica di visualizzazione ad alta risoluzione che consente la ricostruzione sia 2D che 3D dello stack di immagini9. Queste immagini sono ottenute attraverso l'imaging fluorescente episcopico seriale di un campione incorporato in paraffina poiché è sezionato sottilmente ad un intervallo costante da un microtomo automatico. A differenza dell'istologia classica, le immagini vengono catturate come una sezione prima di essere tagliate dal blocco in modo tale che tutte le immagini siano catturate all'interno dello stesso sistema di riferimento. Per questo motivo, lo stack di immagini 2D prodotto dall'istopatologia ECM può essere facilmente e in modo affidabile ricostruito in tre dimensioni. Questo viene fatto utilizzando un visualizzatore DICOM, che consente la visualizzazione 3D delle immagini nei tre piani anatomici: coronale, sagittale e trasversale. Da queste ricostruzioni 3D ad alta risoluzione, può essere fatta una diagnosi cardiaca definitiva. L'applicazione di queste tre diverse modalità di visualizzazione, singolarmente o in combinazione, può fornire caratterizzazioni accurate dei difetti cardiaci strutturali negli embrioni di topo.
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Protocol
L'uso di topi per questi studi è necessario in quanto i topi hanno cuori a quattro camere che possono imitare i CHD umani. I topi sono stati forniti di cure veterinarie e ospitati nella struttura accreditata per la cura degli animali da laboratorio dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC). Sono stati seguiti protocolli rigorosi per ridurre al minimo il disagio, lo stress, il dolore e le lesioni dei topi. I topi sono stati eutanizzati usando gas CO2 , che è accettabile per i piccoli roditori secondo le linee guida dell'American Veterinary Medical Association sull'eutanasia. Gli studi sui topi in questo manoscritto sono stati condotti con un protocollo IACUC approvato presso l'Università di Pittsburgh.
1. Ecocardiogramma fetale
NOTA: Un ecocardiogramma è un potente strumento per identificare malformazioni cardiovascolari e difetti extracardiaci nei topi. A causa delle piccole dimensioni degli embrioni di topo (circa 1-2 mm a metà gestazione, 3,5 mm alla nascita), è necessaria un'apparecchiatura ecocardiografica ad altissima frequenza con biomicroscopia ad ultrasuoni (UBM). UBM fornisce diverse sonde ad alta frequenza (30-50 MHz) con una piccola finestra di imaging (15 mm x 14 mm) che fornisce la risoluzione (30 μm assiale x 68 μm laterale) per visualizzare un feto di topo alla volta. Un trasduttore a 40 MHz fornisce immagini ad alta risoluzione per identificare i fenotipi cardiovascolari7.
- Accendere la macchina per ecocardiogramma e selezionare il programma Cardiologia.
NOTA: Il seguente protocollo può essere utilizzato per qualsiasi background murino dal giorno embrionale (E) 14,5 al 19,5. - Anestetizzare il topo desiderato in una camera di induzione anestetica. Indurre l'anestesia utilizzando una concentrazione di isoflurano al 4% e ossigeno medicale ad una portata di 1 L/min e ridurla al 2%-3% per il mantenimento.
- Posizionare rapidamente il mouse sulla piattaforma di imaging. La piattaforma di imaging ha acciaio riscaldato per mantenere il mouse caldo durante la procedura. Metti la bocca e il naso del topo nel cono del naso anestetico. Fissare gli arti con del nastro adesivo per evitare il movimento. Monitorare la frequenza cardiaca per assicurarsi che rimanga tra 400-450 bpm.
- Monitorare la temperatura utilizzando una sonda termometro rettale e assicurarsi che sia a 37 °C ± 0,5 °C. Monitorare la respirazione per evitare l'ipossia. Mantenere una forza delicata sulla sonda per prevenire danni.
NOTA: Una lampada di calore può essere impostata sopra il mouse per prevenire l'ipotermia mentre si è sotto e per recuperare dall'anestesia. L'unguento oftalmico Petrolatum può essere usato come lubrificante per evitare la secchezza oculare. - Rimuovere la pelliccia dal torace e dall'addome usando la crema depilatoria. Applicare la crema e attendere 3 minuti prima di rimuoverla. Pulire l'area con etanolo al 70%. L'etanolo funziona meglio dell'acqua come lubrificante da barba.
- Riscaldare il gel ad ultrasuoni a una temperatura corporea normale. Applicare generosamente il gel ad ultrasuoni e posizionare il trasduttore sull'addome per orientarlo su un piano orizzontale e identificare la vescica sullo schermo. Una volta identificata la vescica, eseguire la scansione cranica dalla vescica e cercare il feto. Misurare la lunghezza dalla corona alla groppa per determinare l'età gestazionaledi 10 anni (Figura 1 e Tabella 1).
NOTA: modificare le posizioni dei trasduttori per visualizzare piani diversi, inclusi i piani trasversali a quattro camere, sagittali e frontali/coronali7 (Figura 1). - Utilizzare il color Doppler per analizzare il flusso di sangue dal cuore.
- Rimetti il topo nella gabbia se gli embrioni non hanno raggiunto lo stadio previsto. Altrimenti, prepara il mouse per il raccolto.
NOTA: Assicurarsi che il topo sia già sveglio e si stia riprendendo bene dall'anestesia prima di rimetterlo nella gabbia. - Spegnere l'isoflurano e l'ossigeno, pulire l'area di lavoro e spegnere la macchina.
NOTA: È importante rimuovere il gel dal trasduttore.
2. Necroscopia
NOTA: Una volta sospettati fenotipi cardiaci anomali utilizzando l'ecocardiografia fetale, i feti vengono raccolti e fissati tramite immersione in tutto il corpo nella soluzione fissativa: fosfato di formalina tamponato al 10% o paraformaldeide al 4% (PFA). Ispezionare la morfologia esterna ed interna del campione, alla ricerca di anomalie anatomiche macroscopiche o malformazioni.
- Preparare il mouse.
- Se il topo è un adulto, eutanasia il mouse utilizzando un protocollo standard CO2 . Utilizzare una pinza o forbici da dissezione per praticare incisioni (circa 3 cm) nel torace laterale e nell'addome per consentire la penetrazione del fissativo negli organi interni.
NOTA: Il campione deve essere fissato per almeno 24 ore prima della necroscopia se l'embrione è più vecchio di E14.5.
- Se il topo è un adulto, eutanasia il mouse utilizzando un protocollo standard CO2 . Utilizzare una pinza o forbici da dissezione per praticare incisioni (circa 3 cm) nel torace laterale e nell'addome per consentire la penetrazione del fissativo negli organi interni.
- Analizza l'esterno del corpo.
- Impostare il software per salvare le immagini con un nome, inclusa l'identificazione del campione, l'ingrandimento del microscopio e il contenuto dell'immagine.
NOTA: L'ingrandimento da 1,0x a 3,2x dovrebbe essere adeguato per l'imaging della maggior parte delle strutture nei topi E14.5 o più anziani. - Posizionare il mouse sulla piastra sotto la lente dello stereomicroscopio. Riempire la piastra con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per coprire completamente il campione per prevenire la disidratazione e il riflesso nelle immagini. Regolare l'ingrandimento in modo che lo schermo includa l'intero embrione, quindi scattare una foto di entrambi i lati sinistro e destro dell'embrione.
NOTA: Il fondo della piastra deve essere rivestito in paraffina, silicio o un altro substrato simile per facilitare il fissaggio. - Appuntare il campione attraverso la gola, rivolto verso l'alto, e scattare un'altra foto.
NOTA: Orientare leggermente il perno verso l'alto per assicurarsi che non vengano perforate strutture importanti della cavità toracica.
- Impostare il software per salvare le immagini con un nome, inclusa l'identificazione del campione, l'ingrandimento del microscopio e il contenuto dell'immagine.
- Analizza il torace.
- Mentre si solleva la pelle al centro del collo con una pinza, tagliare la pelle verso entrambe le ascelle con le forbici prima di tagliare la pelle lungo l'asse mediano verso la coda. Quindi, tagliare la pelle dall'ombelico alle gambe. Appuntare il campione attraverso i polsi e le caviglie.
NOTA: Fare attenzione a tagliare solo la pelle. Si consiglia di tenere le lame della forbice orizzontalmente o angolate verso l'alto. - Per rompere il tessuto connettivo, sollevare la pelle con un paio di pinze mantenendo il tessuto sottostante in posizione con l'altra coppia. Appuntare il campione attraverso la pelle per aiutare a esporre il torace e l'addome (Figura 2).
NOTA: troppo stretching durante il bloccaggio, il taglio o la raschiatura può causare danni ai tessuti. - Scatta una foto dei muscoli esposti, quindi raschia delicatamente via i muscoli per esporre le costole.
- Scatta una foto delle costole esposte. Separare le costole dal diaframma e tagliare le costole su entrambi i lati il più lontano possibile sull'asse laterale verso il collo.
- Esporre il cuore rimuovendo le costole tagliate. Scatta una foto del cuore.
- Rimuovere il timo sbucciandolo con un paio di pinze. Utilizzare l'altro paio di pinze per stabilizzare la base del timo per evitare di strappare eventuali vasi sottostanti. Scatta foto del cuore e dei grandi vasi.
NOTA: l'utilizzo di perni per allungare alcune strutture adiacenti può aiutare a ottenere migliori visualizzazioni di immagini. Inoltre, scatta foto separate focalizzate sulle grandi arterie, sul cuore e su altre strutture di interesse in quanto potrebbero non essere a fuoco insieme.
- Mentre si solleva la pelle al centro del collo con una pinza, tagliare la pelle verso entrambe le ascelle con le forbici prima di tagliare la pelle lungo l'asse mediano verso la coda. Quindi, tagliare la pelle dall'ombelico alle gambe. Appuntare il campione attraverso i polsi e le caviglie.
- Analizza l'addome.
- Tirare il diaframma per rimuoverlo ed esporre il fegato. Scatta una foto.
- Tamponare il fegato per esporre lo stomaco e il pancreas. Scatta una foto.
- Tagliare l'esofago. Rimuovere il colon e l'intestino estraendoli con una pinza. Tagliare appena sopra il fegato e rimuoverlo per rivelare i reni e le ghiandole surrenali. Scatta una foto.
NOTA: Gli organi rimossi devono essere conservati nella soluzione fissativa.
- Isolare il torace per l'analisi ECM.
- Tagliare il torace inferiore lungo una linea retta tra il fegato e i polmoni. Tagliare la testa abbastanza in alto da non tagliare le ramificazioni delle arterie carotidi.
- Rimuovere delicatamente le costole laterali mantenendo le costole dorsali e la colonna vertebrale. Sbucciare e raschiare via il grasso dorsale.
- Staccare il torace dal resto del corpo e metterlo in una soluzione tamponata di fosfato di formalina al 10%.
3. Incorporamento
- Decantare il fissativo in un'apposita bottiglia di rifiuti pericolosi. Lavare i campioni con 1x PBS per 15 minuti tre volte.
- Utilizzare concentrazioni crescenti di etanolo e xilene per disidratare i campioni. La durata di tutti i seguenti passaggi dipende dallo stadio degli embrioni. Si prega di fare riferimento alla Tabella 2 per i dettagli.
NOTA: si deve prestare attenzione quando si cambiano le soluzioni per evitare di danneggiare i campioni. I parametri ottimali per l'elaborazione dei campioni possono essere regolati empiricamente. Lo xilene dissolverà alcune materie plastiche; Devono essere utilizzati strumenti e contenitori di vetro. - Sostituire lo xilene con la paraffina per la durata desiderata. Lasciare i flaconi in un'incubatrice a 65 °C per la durata appropriata (tabella 2).
- Utilizzare paraffina fresca per incorporare i campioni nella posizione desiderata.
NOTA: Si raccomanda di orientare il campione al centro del blocco di paraffina, con il lato dorsale rivolto verso l'alto e il lato posteriore rivolto verso la parte anteriore del blocco. Quando orientate il campione, ricordate che il campione è incorporato con il blocco rivolto verso il basso.
4. Microscopia confocale episcopica (ECM)
NOTA: Dopo un'appropriata incorporazione, gli embrioni vengono sottoposti a raccolta di immagini in serie tramite ECM per l'analisi istopatologica. I singoli vetrini possono essere recuperati dal microtomo per ulteriori studi.
- Estrarre il blocco di paraffina dal congelatore a -20 °C e rimuovere gli stampi metallici.
- Utilizzare una lametta per tagliare la cera sui bordi e sul retro della cassetta. Tagliare la cera che circonda il campione fino a quando non è racchiusa in un piccolo quadrato di cera attaccato alla cassetta.
NOTA: Prestare estrema attenzione durante la manipolazione delle lame. - Utilizzare la leva metallica per bloccare il blocco di paraffina contro la fase di affettatura del microtomo. Selezionare la funzione MAN (manuale) in modalità Run, sollevare la superficie della paraffina vicino alla lama ed eseguire alcune diapositive per assicurarsi che la lama entri in contatto con il blocco di paraffina.
- Aprire l'applicazione LAS AF e selezionare MatrixScreener. Selezionare Matrice regolare singola e caricare il modello salvato in precedenza appropriato. Fare clic sul pulsante LUT rapida per passare all'ombre bianco e arancione.
- Selezionare Set Up Jobs (Imposta processi ) e trascinare il laser visibile a 405 nm fino al massimo. Abbinate il bordo sinistro del blocco spettro alla linea a 405 nm e trascinate il bordo destro sulla linea a 800 nm. Contrassegnate l'opzione Pinhole e avviate la vista Dal vivo .
- Regolare la posizione della proiezione laser per centrare il campione sullo schermo e regolare la manopola Zoom su ~20x. Per ottimizzare la risoluzione, impostare il guadagno a 1.250 V e massimizzare l'area blu utilizzando la manopola di messa a fuoco; quindi, ripristinare il guadagno a circa 750 V per l'imaging.
NOTA: I valori specifici possono variare a seconda delle condizioni dell'embrione. - Impostare il metodo di taglio su Auto, impostare lo spessore su circa 50 μm ed eseguire le diapositive. Smettere di tagliare quando i polmoni e le vie aeree sono in vista.
- Scegli uno spessore di taglio compreso tra 8-10 μm e interrompi la vista Live . Aprire Microtome Communicator per avviare l'imaging. Assicurarsi che la cartella di archiviazione temporanea sia vuota prima di raccogliere le immagini.
- Smettere di tagliare quando non viene visualizzata alcuna struttura cardiaca aggiuntiva. Chiudere l'applicazione Microtome Communicator ed esportare il file temporaneo in una .tiff serie di immagini tramite il software di elaborazione delle immagini per ricostruzioni 3D in un secondo momento.
5. Ricostruzione tridimensionale (3D)
NOTA: Lo scopo della ricostruzione 3D è quello di elaborare una pila di immagini 2D dall'imaging ECM in video 3D negli orientamenti coronale, sagittale e trasversale e di utilizzare i video 3D per la diagnosi delle anomalie strutturali e anatomiche nei campioni.
- Aprire lo stack di immagini ECM nel software di elaborazione delle immagini.
- Trascina e rilascia i file dell'immagine nel software di elaborazione delle immagini. Capovolgere orizzontalmente le immagini ECM selezionando Immagine > Trasforma > Capovolgi orizzontalmente nella barra dei menu.
- Salvare l'immagine capovolta e chiudere il software di elaborazione delle immagini.
- Importare lo stack di immagini ECM nel software di visualizzazione DICOM.
- Trascina e rilascia le immagini ECM capovolte orizzontalmente nel software di visualizzazione DICOM. Assicurati che sia presente un bordo azzurro intorno all'elenco di esempio, altrimenti le immagini potrebbero essere aggiunte a una cartella di esempio esistente.
- Selezionare i collegamenti o i file da copiare nel database quando viene visualizzata la finestra popup. Un nuovo campione apparirà nell'elenco dei campioni con lo stesso nome del file copiato nel software di visualizzazione DICOM.
- Fare clic sul file appena aggiunto per aprirlo.
- Eseguire la ricostruzione 3D.
- Una volta aperto il file, fare clic sul menu Strumenti di ricostruzione 2D/ 3D dalla barra degli strumenti e selezionare 3D MPR.
- Per Risoluzione pixel X e Risoluzione pixel Y, immettere la risoluzione dell'immagine fornendo lo zoom utilizzato durante l'imaging ECM. Per l'intervallo di sezione, immettere lo spessore della fetta utilizzato per tagliare durante l'imaging ECM.
NOTA: la risoluzione della fotocamera cambia a seconda dello zoom della fotocamera e può variare da fotocamera a fotocamera.
- Utilizzare i diversi strumenti dalla scheda Strumenti sul lato sinistro per regolare le pile di immagini come desiderato.
- Utilizzate lo strumento WW/WL per regolare la larghezza e il livello della finestra. Fare clic e trascinare lo strumento sull'immagine verso l'alto per ridurre la luminosità dell'immagine e verso il basso per aumentarla. Fai clic e trascina lo strumento sull'immagine verso destra per ridurre il contrasto dell'immagine e verso sinistra per aumentarlo.
NOTA: le impostazioni WW/WL ottimali per una struttura potrebbero non essere ottimali per un'altra. Per questo motivo, si consiglia di creare video separati per visualizzare strutture diverse. - Usate lo strumento Panoramica per trascinare le immagini nelle posizioni desiderate. Usate lo strumento zoom per ingrandire o ridurre l'immagine come desiderato e lo strumento ruota per ruotare l'immagine come desiderato.
NOTA: l'ingrandimento delle immagini può causare una riduzione della qualità dell'immagine. Prestare attenzione quando si ruotano le immagini, poiché ciò potrebbe causare l'inversione degli assi.
- Utilizzate lo strumento WW/WL per regolare la larghezza e il livello della finestra. Fare clic e trascinare lo strumento sull'immagine verso l'alto per ridurre la luminosità dell'immagine e verso il basso per aumentarla. Fai clic e trascina lo strumento sull'immagine verso destra per ridurre il contrasto dell'immagine e verso sinistra per aumentarlo.
- Fate clic e trascinate l'asse colorato del primo pannello. Notate come ruotando questo asse cambia l'orientamento degli altri due pannelli. Ruotare gli assi dei tre pannelli fino a quando i tre pannelli non rappresentano le viste coronale, sagittale e trasversale del campione.
NOTA: durante il riorientamento dei campioni, mantenere il corretto orientamento anteriore/posteriore. - Genera video.
- Una volta che tutti e tre i pannelli sono correttamente posizionati, orientati e illuminati, fare clic sul pannello che rappresenta la vista coronale.
- Fai clic su Esportazione film sul lato destro della barra dei menu. Fare clic su Batch e trascinare i cursori Da e A per comprendere l'intera regione di interesse. Per Intervallo, selezionate l'opzione Uguale a spessore (Same as Thickness ). Salvate il video indicando l'orientamento della vista.
- Rivedi il video per vedere se le strutture di interesse possono essere adeguatamente identificate. In caso contrario, utilizzare gli strumenti (passaggio 5.4) per regolare nuovamente i video in base alle esigenze e salvare nuovamente il video.
- Ripetere il passaggio 5.6 per le viste trasversali e sagittali. Diagnostica i campioni utilizzando video ricostruiti.
NOTA: Guardare attentamente i video in ciascun orientamento per valutare completamente se il campione presenta anomalie anatomiche o fenotipi di malattia (Figura 3).
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Representative Results
Gli embrioni di topo con difetti emodinamici significativi sono stati notati per essere letali embrionali. Un'ampia varietà di CHD può essere identificata attraverso l'ecocardiogramma fetale non invasivo ad alto rendimento utilizzando diverse viste (Figura 1).
Difetti del setto: I CHD più comuni sono difetti del setto come un difetto del setto ventricolare (VSD), un difetto del setto atrioventricolare (AVSD) e un difetto del setto atriale (ASD)1. VSD o AVSD possono essere facilmente visualizzati utilizzando immagini 2D e immagini di flusso di colore. Il flusso sanguigno attraverso i ventricoli o tra gli atri e i ventricoli può essere facilmente identificato (Figura 3). L'ASD è difficile da distinguere con il forame ovale pervio in un feto.
Anomalie del tratto di deflusso: Come mostrato nella Figura 3, il flusso nell'arteria polmonare principale è attraverso il flusso dell'aorta ascendente negli embrioni normali. Negli embrioni con una doppia uscita del ventricolo destro (DORV), entrambe le grandi arterie possono essere viste sorgere dal ventricolo destro. DORV è anche associato a VSD (Figura 3D) e può essere identificato utilizzando il flusso di colore. Tuttavia, date le piccole dimensioni degli embrioni, la DORV a volte non può essere distinta in modo affidabile dall'override dell'aorta, dall'atresia polmonare o dal tronco arterioso persistente (PTA). Nel PTA, solo un flusso del tratto di efflusso può essere visto nell'ecocardiogramma fetale (Figura 3E). La struttura dettagliata dell'arco e l'arteria polmonare principale possono essere osservate mediante necroscopia (Figura 2E,F).
La necroscopia può diagnosticare rapidamente lo stato situs nel torace e nell'addome e la posizione cardiaca rispetto al torace (levocardia (Figura 2C-E) o destrocardia). Le strutture del tratto di deflusso e la dimensione relativa degli atri e dei ventricoli possono essere facilmente visualizzate (Figura 2E,F).
L'istopatologia ECM è la tecnica gold standard per valutare qualsiasi anomalia cardiaca strutturale 8,11,12. Fornisce una risoluzione e un dettaglio senza precedenti alle strutture degli embrioni. La ricostruzione tridimensionale utilizzando diversi piani e viste può facilmente identificare la relazione tra le grandi arterie e ventricoli (Figura 3) e il difetto tra i ventricoli e gli atri.
Figura 1: Le posizioni per misurare la lunghezza della groppa della corona nelle immagini ecocardiografiche 2D degli embrioni per determinare l'età gestazionale. Immagini ecocardiografiche 2D di embrioni a (A) E11.5, (B) E12.5, (C,D) E13.5-E14.5. (D) L'embrione malato è più piccolo del suo fratello (C) ed è noto per avere un aspetto "pastoso" con idrope (freccia). (A-C) Gli embrioni vivi dimostrano organi distinti. La modalità VB rappresentativa con immagini a colori del cuore E14.5 in una vista coronale a 4 camere inclinata anteriormente per visualizzare i tratti di deflusso (E) dimostra il setto ventricolare intatto con la normale relazione delle grandi arterie, che è confermata con ECM nella vista coronale (E'). (F) La visione sagittale rappresentativa del cuore E14.5 dimostra i tratti di efflusso ventricolare sinistro e ventricolare destro con l'aorta ascendente (AO) puntata cranialmente e l'arteria polmonare rivolta posteriormente (verso la colonna vertebrale), che è confermata con ECM nella vista sagittale (F'). (G) Vista trasversale rappresentativa del ventricolo sinistro (LV) e del ventricolo destro (RV), confermata con ECM nella vista trasversale (G'). (H) Una vista trasversale alla base del cuore nella ECM dimostra una valvola aortica (AV) e una valvola polmonare (PV) distinte e separate. La PV è anteriore all'AV. (H') L'immagine rappresentativa della vista trasversale ECM del tronco arterioso persistente (PTA) mostra l'arteria polmonare sinistra e l'arteria polmonare destra che sorgono posteriormente dall'arteria tronca persistente indivisa, con l'arteria carotide sinistra che sorge anteriormente e cranialmente dall'arteria tronca persistente. Abbreviazioni: A: anteriore, AO: aorta, AV: valvola aortica, Cd: caudale, Cr: craniale, DAO: aorta discendente, L: sinistra, LA: atrio sinistro, LCA: arteria carotide sinistra, LPA: arteria polmonare sinistra, LV: ventricolo sinistro, P: posteriore, PA: arteria polmonare, PTA: tronco arterioso persistente, R: destra, RA: atrio destro, RPA: arteria polmonare destra, RV: ventricolo destro. Barra scala: 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative di una necroscopia per osservare anomalie cardiovascolari . (A) Un embrione appuntato su un piatto di dissezione a sfondo nero senza fenotipi evidenti. L'immagine mostra l'anatomia grossolana della testa, dei digitali, della cavità toracica e dell'addome. (B) Il derma viene rimosso dal cucciolo, rivelando ghiandole sottomandibolari, gabbia toracica e addome. (C) La gabbia toracica viene sollevata, rivelando l'anatomia grossolana della cavità toracica, compreso il timo, il cuore, i polmoni e il diaframma. (D) Una vista ingrandita del torace con la gabbia toracica rimossa. (E) Il timo viene rimosso, rivelando grandi vasi e trachea. (F) Una vista ingrandita di grandi vascelli. Abbreviazioni: AAO: aorta ascendente, D: diaframma, LA: atrio sinistro, LCA: arteria carotide sinistra, LSVC: vena cava superiore sinistra, LV: ventricolo sinistro, P: pericardio, RA: atrio destro, Rb: costole, RCA: arteria carotide destra, RL: polmone destro, RSVC: vena cava superiore destra, RV: ventricolo destro, S: sterno, SCA: arteria succlavia destra, SMG: ghiandole sottomandibolari, T: trachea, Th: timo. Barra scala: 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Ecocardiogramma fetale rappresentativo (Echo) e immagini dal microscopio episcopico confocale (ECM). (A) Echo dimostra un setto ventricolare intatto senza uno shunt interventricolare e grandi arterie normali correlate nel controllo normale, confermato da (A') ECM allo stadio E14.5-15.5. (B) Rilevazione ecografica di un difetto del setto atrioventricolare (AVSD). L'imaging ecografico nella vista a 4 camere dimostra la comunicazione tra LA, RA, LV e RV, confermata da (B') ECM allo stadio E14.5. (C) La diagnosi ecografica del difetto del setto ventricolare (VSD) con flusso di colore dimostra il flusso attraverso LV e RV, confermato da ECM (C') allo stadio E16.5. (D) Echo e (D') ECM dimostrano DORV con un VSD tra LV e RV con grandi arterie affiancate (l'aorta è proprio all'arteria polmonare) allo stadio E14.5. (E) La diagnosi ecografica del tronco arterioso persistente (PTA) dimostra la comunicazione tra LV e RV con un singolo tratto di efflusso che sovrascrive entrambi i ventricoli (PTA). (E') Questa patologia è confermata dalla ECM allo stadio E14.5. Barra scala: 0,5 mm. AO: aorta, AVSD: difetto del setto atrioventricolare, Cd: caudale, Cr: craniale, L: sinistra, LA: atrio sinistro, LV: ventricolo sinistro, PA: arteria polmonare, PTA: tronco arterioso persistente, R: destra, RA: atrio destro, RV: ventricolo destro, VSD: difetto del setto ventricolare. Barra scala: 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Palco | Lunghezza corona-groppa (mm) | Area fetale (mm2) | Area del cuore (mm2) | Area del cuore/Area del feto |
| E12.5 | 7,9 ± 0,8 (n = 77) | 23,2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13.5 | 10,5 ± 0,9 (n = 92) | 40,9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14.5 | 12,5 ± 0,9 (n = 101) | 57,6 ± 8 (n = 101) | 2,9 ± 0,5 (n = 70) | 0,050 ± 0,004 (n = 70) |
| E15.5 | 14,1 ± 0,5 (n = 134) | 71,4 ± 6 (n = 134) | 3,8 ± 0,4 (n = 87) | 0,053 ± 0,004 (n = 87) |
| E16,5 | 15,4 ± 0,6 (n = 112) | 82,7 ± 6 (n = 112) | 4,9 ± 0,5 (n = 87) | 0,058 ± 0,007 (n = 87) |
| E17.5 | 16,6 ± 0,4 (n = 211) | 96,9 ± 7 (n = 211) | 6,1 ± 0,6 (n = 146) | 0,063 ± 0,004 (n = 146) |
| E18,5 | 17,7 ± 0,6 (n = 139) | 112,1 ± 8 (n = 139) | 7,1 ± 0,8 (n = 93) | 0,063 ± 0,005 (n = 93) |
| E19.5 | 18,7 ± 0,7 (n = 57) | 126,7 ± 8 (n = 57) | 7,7 ± 0,7 (n = 36) | 0,062 ± 0,005 (n = 36) |
Tabella 1: Profilo di sviluppo della crescita fetale.
| E14.5 | E16,5 | E18,5 | Neonato | |
| 70% etanolo | 1 h | 1,5 ore | 3 ore | 4 ore |
| 95% etanolo | 35 minuti | 45 minuti | 1 h | 1 h |
| 95% etanolo | 35 minuti | 45 minuti | 1 h | 1 h |
| 100% etanolo | 15 minuti | 15 minuti | 30 minuti | 6 minuti |
| Xilene 1 | 20 minuti | 30 minuti | 40 minuti | 30 minuti |
| Xilene 2 | 20 minuti | 30 minuti | 40 minuti | 30 minuti |
| Cera 1 | 20 minuti | 20 minuti | 20 minuti | 30 minuti |
| Cera 2 | 20 minuti | 20 minuti | 20 minuti | 30 minuti |
| Cera 3 | Per la notte | Per la notte | Per la notte | Per la notte |
Tabella 2: Protocollo per l'incorporazione degli embrioni basato sui giorni embrionali.
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Discussion
Topi geneticamente modificati sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi patologici dei difetti cardiaci congeniti. I protocolli che forniamo in questo studio tentano di semplificare e standardizzare il processo di valutazione dei difetti cardiaci fetali murina. Tuttavia, ci sono passaggi critici da notare durante il protocollo. Gli embrioni di topo crescono in modo significativo durante ogni giorno di gestazione e il momento corretto per raccogliere un topo può essere determinato eseguendo accuratamente un ecocardiogramma fetale. L'ecocardiogramma fetale può essere utilizzato per lo screening della patologia cardiovascolare fetale. Un'immagine 2D consente l'identificazione dell'anatomia anormale e della funzione cardiaca, con l'assistenza del color Doppler per esaminare il flusso sanguigno e rilevare eventuali comunicazioni tra le camere del cuore o i tratti anomali di deflusso e afflusso. Per determinare la diagnosi di CHD, i feti vengono scansionati dal giorno embrionale E14.5 quando la settazione del tratto di efflusso e la formazione della camera cardiaca sono completate. La scansione nelle fasi precedenti potrebbe riflettere il ritardo dello sviluppo.
L'istopatologia è lo standard per caratterizzare i CHD8 utilizzando un microtomo seguito dalla visualizzazione al microscopio ottico. Il principale svantaggio del metodo standard è la mancanza di una visualizzazione 3D intuitiva delle strutture cardiovascolari per la diagnosi e la limitazione della mancanza di fornire viste diverse dei campioni. Un'istologia ECM è il metodo più efficiente in termini di tempo per caratterizzare i difetti cardiaci. Se la ECM non è disponibile, un microtomo può essere utilizzato per sezionare l'embrione e determinare i fenotipi cardiaci. Altre opzioni per ottenere l'imaging cardiaco sono l'esecuzione di alta produttività, risonanza magnetica ad alta risoluzione (MRI) o tomografia computerizzata (TC). Un aspetto chiave della risonanza magnetica o TC è che più embrioni possono essere visualizzati contemporaneamente; tuttavia, anche dopo un'ecografia, TC o risonanza magnetica, è necessaria l'istopatologia per confermare qualsiasi diagnosi di CHD.
Utilizzando l'imaging ECM per l'istopatologia, l'embrione viene ripreso in serie dopo ogni taglio utilizzando un microscopio confocale a scansione laser montato sul microtomo a scorrimento automatico. Le singole immagini raccolte da ECM consentono successive ricostruzioni 3D e consentono di ritagliare digitalmente i campioni in qualsiasi piano di imaging senza riprendere le immagini 8,11. Tale operazione consente una valutazione completa dell'anatomia cardiaca, che può essere utilizzata in diverse fasi dello sviluppo. Inoltre, le singole diapositive potrebbero essere recuperate dal microtomo durante la raccolta dei dati dalle apparecchiature ECM. Sebbene l'istopatologia ECM sia il gold standard per valutare qualsiasi anomalia cardiaca strutturale, ci sono limitazioni con la disponibilità di attrezzature, software e tempo di esecuzione per embrione. Il tempo di esecuzione per sezionare un cuore embrionale può variare da 1-3 ore per campione, a seconda delle sue dimensioni. A causa della complessità delle apparecchiature, i ricercatori devono controllare regolarmente sul computer per assicurarsi che la regione di interesse all'interno del campo venga registrata. I ricercatori devono anche controllare il campione per assicurarsi che nessun truciolo di cera di paraffina ostruisca il campione dallo scanner laser.
L'ECM e la successiva ricostruzione 3D forniscono una valutazione completa ad alta risoluzione di qualsiasi difetto cardiaco strutturale indipendentemente dal piano di incorporamento del campione. Questi protocolli hanno aiutato a diagnosticare con successo una serie di CHD e ci hanno permesso di comprendere l'embriogenesi cardiaca in modelli murini e patologie legate alle mutazioni genetiche.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse in questo manoscritto.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
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