この記事では、胎児心エコー検査、剖検、およびエピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)を使用したマウス先天性心疾患(CHD)診断方法とそれに続く3次元(3D)再構成について詳しく説明します。
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方法論記事
マウス胎児の構造的心臓欠損を特徴付けるパイプライン
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
先天性心疾患(CHD)は、米国における乳児死亡の主な原因です。1980年代以前には、中等度または重度のCHDのほとんどの患者は成人期前に死亡し、生後1週間で最大の死亡率を示しました。外科的技術、診断アプローチ、および医学的管理の目覚ましい進歩により、転帰は著しく改善されました。先天性心疾患を理解するという重要な研究ニーズに対応するために、マウスモデルは人間と心臓の解剖学的構造が非常に似ており、妊娠率が短いため、理想的な研究プラットフォームを提供してきました。遺伝子工学とハイスループット表現型ツールの組み合わせにより、構造的な心臓欠陥の複製と診断が可能になり、CHDの背後にある分子経路をさらに解明することができました。非侵襲的胎児心エコー検査を使用してマウスモデルの心臓表現型をスクリーニングし、エピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)組織病理学と3次元(3D)再構成を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)の高忠実度を組み合わせることで、さまざまな先天性心疾患の解剖学的構造を詳細に見ることができます。このプロトコルは、マウス先天性心疾患の正確な診断を得るためのこれらの方法の完全なワークフローを概説しています。この表現型プロトコルをモデル生物に適用することで、正確なCHD診断が可能になり、CHDのメカニズムに関する洞察が得られます。CHDの根底にあるメカニズムを特定することは、潜在的な治療法と介入の機会を提供します。
概要
先天性心疾患(CHD)は最も一般的な新生児先天性欠損症1,2であり、新生児の約0.8%〜1.7%に影響を及ぼし、重大な新生児死亡率と罹患率をもたらします3。遺伝的病因はCHD4,5で強く示されています。遺伝子改変マウスモデルは、マウスとヒトの胎児において4腔心臓と同等の心臓発達DNA配列を有するマウスに起因するCHDの複雑さとそれらを引き起こすメカニズムを理解するために広く使用されてきた6。マウス変異体の表現型を特定することは、標的遺伝子の機能を特徴付けるための基本的な最初のステップです。単一の遺伝子変異がヒトCHDを模倣する心臓欠陥のスペクトルをもたらす可能性がある遺伝子投与量効果を発現するマウスモデルは、CHDの複雑さとそれらを引き起こすメカニズムを理解するために重要です。
この記事では、マウスモデルにおける心臓表現型を特徴付けるためのパイプラインの概要を説明します。適用された方法は、胎児心エコー図7、続いて剖検およびECM組織病理学7,8<....
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プロトコル
マウスはヒトCHDを模倣できる4室の心臓を持っているため、これらの研究にマウスを使用する必要があります。 マウスは獣医ケアを受け、施設の実験動物管理評価認定協会(AAALAC)認定の動物飼育施設に収容されました。マウスの不快感、ストレス、痛み、および怪我を最小限に抑えるために、厳格なプロトコルに従いました。マウスは、安楽死に関する米国獣医師会ガイドラインに従って小型げっ歯類に許容されるCO2 ガスを使用して安楽死させた。この原稿のマウスに関する研究は、ピッツバーグ大学で承認されたIACUCプロトコルを使用して実施されました。
1.胎児心エコー図
注:心エコー図は、マウスの心血管奇形と心臓外障害を特定するための強力なツールです。マウス胚のサイズが小さいため(妊娠中期に約1〜2 mm、出生時に3.5 mm)、超音波生体顕微鏡(UBM)を備えた超高周波心エコー検査装置が必要です。UBMは、一度に1匹のマウス胎児を視覚化するための解像度(軸方向30 μm x 68 μm)を提供する小さなイメージングウィンドウ(15 mm x 14 mm)を備えたさまざまな高周波(30〜50 MHz)プローブを提供します。40 MHzトランスデューサは、心血管表現型を識別するための高解像度画像を提供します7。
- 心エコー検査装....
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結果
重大な血行動態障害を有するマウス胚は、胚致死であることが指摘された。さまざまなビューを使用した高出力の非侵襲的胎児心エコー図により、さまざまなCHDを特定できます(図1)。
中隔欠損症:最も一般的なCHDは、心室中隔欠損症(VSD)、房室中隔欠損症(AVSD)、心房中隔欠損症(ASD)などの中隔欠損症です1。VSDまたはAVSDは、2D画像とカラーフロー画像を使用して簡単に視覚化できます。心室を横切る、または心房と心室の間の血流を簡単に識別できます(図3)。ASDは、胎児の卵円孔開存症と区別することは困難です。
流出路の異常:図3に示すように、主肺動脈における流れは、正常胚における上行大動脈流を横切る。右心室の二重出口(DORV)を有す.......
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ディスカッション
遺伝子改変マウスは、先天性心疾患の病態メカニズムを理解するために使用されています。この研究で提供するプロトコルは、マウス胎児の心臓の欠陥を評価するプロセスを合理化および標準化しようとしています。ただし、プロトコル中に注意すべき重要な手順があります。マウスの胚は妊娠の各日に有意に成長し、胎児の心エコー図を正確に行うことでマウスを採取する正確な時期を決定することができます。胎児心エコー図は、胎児の心血管病理をスクリーニングするために使用できます。2D画像は、血流を調べ、心臓の腔または異常な流出と流入路の間の通信を検出するためにカラードップラーの助けを借りて、異常な解剖学的構造と心機能の識別を可能にします。CHD診断を決定するために、胎児は、流出路中隔および心腔形成が完了した胚の日E14.5からスキャンされる。初期段階でのスキャンは、発達の遅れを反映している可能性があります。
組織病理学は、ミクロトームとそれに続く光学顕微鏡の視覚化を使用してCHD8を特徴付けるための標準です。標準的な方法の主な欠点は、診断のための心血管構造の直感的な3D表.......
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開示事項
著者は、この原稿で利益相反を宣言しません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf チューブ (または組織保存用の優先バイアル) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% 緩衝ホルマリンリン酸溶液 | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% パラホルムアルデヒド (PFA)固定剤 | ThermoScientific | 28908 | 4% 使用濃度 1x PBS で新たに調製 4 °C;C |
| 50 mLチューブFalcon | 352070 | ||
| 6–12ウェルプレートまたは20mLバイアル 胚保存用 | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | ライカ | MDG36 | |
| 解剖ピン (A1 または A2 グレード) | F.S.T | 26002-15 | |
| 解剖プレート | F.S.T | FB0875713 | パラフィンベースのペトリ皿 |
| 埋め込み型 | さくら | 4133 | |
| 極細ハサミ (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2ペア |
| フィジーアプリケーション/画像J | NIH | Fiji.sc | |
| 細い先端 (0.05 mm x 0.01 mm) 解剖鉗子 (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 ペア |
| ホット鉗子 | F.S.T | 11252-00 | 胚の向き |
| ワックスブロック用工業用マーカー | Sharpie | 2003898 | ラボ用にフォーマット済み |
| Jenoptik ProgRes C14plus 顕微鏡カメラ | イエナオプティック | 017953-650-26 | |
| イエナオプティック ProgRess CapturePro 取得ソフトウェア | イエナオプティック | jenoptik.com | |
| 大型ガラスビーカー | フィッシャーサイエンティフィック | S111053 | パラフィン溶解用 |
| ライカ M165 FC 双眼顕微鏡 (16.5:1 ズーム光学系) | ライカ | M165 FC | |
| OsiriX MD バージョン 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| パラプラスト埋め込みパラフィンワックス | ミリポアシグマ | 1003230215 | |
| 小さなガラスビーカー | フィッシャーサイエンティフィック | S111045 | |
| 小さな穴あきスプーン(14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| ストレートバンナスハサミ(4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | Aペア |
| Vevo2100 超高周波超音波バイオマイクロスコープ | 富士フイルムビジュアルソニックス | Vevo2100 | |
| キシレン | フィッシャーケミカル | UN1307 |
参考文献
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al.
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再版と許可
