Summary
この記事では、胎児心エコー検査、剖検、およびエピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)を使用したマウス先天性心疾患(CHD)診断方法とそれに続く3次元(3D)再構成について詳しく説明します。
Abstract
先天性心疾患(CHD)は、米国における乳児死亡の主な原因です。1980年代以前には、中等度または重度のCHDのほとんどの患者は成人期前に死亡し、生後1週間で最大の死亡率を示しました。外科的技術、診断アプローチ、および医学的管理の目覚ましい進歩により、転帰は著しく改善されました。先天性心疾患を理解するという重要な研究ニーズに対応するために、マウスモデルは人間と心臓の解剖学的構造が非常に似ており、妊娠率が短いため、理想的な研究プラットフォームを提供してきました。遺伝子工学とハイスループット表現型ツールの組み合わせにより、構造的な心臓欠陥の複製と診断が可能になり、CHDの背後にある分子経路をさらに解明することができました。非侵襲的胎児心エコー検査を使用してマウスモデルの心臓表現型をスクリーニングし、エピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)組織病理学と3次元(3D)再構成を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)の高忠実度を組み合わせることで、さまざまな先天性心疾患の解剖学的構造を詳細に見ることができます。このプロトコルは、マウス先天性心疾患の正確な診断を得るためのこれらの方法の完全なワークフローを概説しています。この表現型プロトコルをモデル生物に適用することで、正確なCHD診断が可能になり、CHDのメカニズムに関する洞察が得られます。CHDの根底にあるメカニズムを特定することは、潜在的な治療法と介入の機会を提供します。
Introduction
先天性心疾患(CHD)は最も一般的な新生児先天性欠損症1,2であり、新生児の約0.8%〜1.7%に影響を及ぼし、重大な新生児死亡率と罹患率をもたらします3。遺伝的病因はCHD4,5で強く示されています。遺伝子改変マウスモデルは、マウスとヒトの胎児において4腔心臓と同等の心臓発達DNA配列を有するマウスに起因するCHDの複雑さとそれらを引き起こすメカニズムを理解するために広く使用されてきた6。マウス変異体の表現型を特定することは、標的遺伝子の機能を特徴付けるための基本的な最初のステップです。単一の遺伝子変異がヒトCHDを模倣する心臓欠陥のスペクトルをもたらす可能性がある遺伝子投与量効果を発現するマウスモデルは、CHDの複雑さとそれらを引き起こすメカニズムを理解するために重要です。
この記事では、マウスモデルにおける心臓表現型を特徴付けるためのパイプラインの概要を説明します。適用された方法は、胎児心エコー図7、続いて剖検およびECM組織病理学7,8を利用し、発達中のマウス心臓表現型の詳細な解剖学的構造を表示できます。胎児心エコー図は、合理的な画像解像度で複数の胚を直接視覚化できる非侵襲的なモダリティです。さらに、胎児心エコー図は、同腹仔の胚の総数、それらの発達段階、および子宮角の相対的な向きと位置を迅速に決定します。スペクトルドップラー/カラーフローを使用して、構造、血行動態障害、成長制限、または水腫の発生に基づいて異常な胚を特定できます。胎児心エコー図検査は非侵襲的な技術であるため、数日間スキャンし、血行動態や心臓形態の変化を観察するために使用できます。胎児心エコー図の高品質な画像を取得するには、経験と知識が不足しているために特定の心臓の欠陥が見逃される可能性があるため、練習とスキルが必要です。このため、剖検とECM組織病理学の組み合わせにより、心臓形態のより明確な分析が得られる可能性があります。剖検は、アーチ構造、大動脈と肺動脈の相対的な関係、心室と心房のサイズ、胸部に対する心臓の位置、および気管支肺構造を直接視覚化します。ただし、心臓弁や壁の厚さなどの内部の特徴は、剖検だけでは評価が難しい場合があります。したがって、ECM組織病理学は決定的な診断に推奨されます。ECM組織病理学は、画像スタック9の2Dおよび3D再構成の両方を可能にする高解像度の視覚化技術である。これらの画像は、パラフィン包埋サンプルを自動ミクロトームによって一定の間隔で薄く切片化した連続エピスコピック蛍光イメージングによって得られます。古典的な組織学とは異なり、画像はブロックから切り取られる前にセクションとしてキャプチャされ、すべての画像が同じ参照フレーム内でキャプチャされます。このため、ECM組織病理学によって生成された2D画像スタックは、容易かつ確実に3次元で再構築することができます。これは、DICOMビューアを使用して行われ、コロナ、矢状、横の3つの解剖学的平面の画像を3D視覚化できます。これらの高解像度3D再構成から、決定的な心臓診断が行われる可能性があります。これら3つの異なる視覚化モダリティを個別または組み合わせて適用することで、マウス胚の構造的心臓欠陥の正確な特性評価を提供できます。
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Protocol
マウスはヒトCHDを模倣できる4室の心臓を持っているため、これらの研究にマウスを使用する必要があります。 マウスは獣医ケアを受け、施設の実験動物管理評価認定協会(AAALAC)認定の動物飼育施設に収容されました。マウスの不快感、ストレス、痛み、および怪我を最小限に抑えるために、厳格なプロトコルに従いました。マウスは、安楽死に関する米国獣医師会ガイドラインに従って小型げっ歯類に許容されるCO2 ガスを使用して安楽死させた。この原稿のマウスに関する研究は、ピッツバーグ大学で承認されたIACUCプロトコルを使用して実施されました。
1.胎児心エコー図
注:心エコー図は、マウスの心血管奇形と心臓外障害を特定するための強力なツールです。マウス胚のサイズが小さいため(妊娠中期に約1〜2 mm、出生時に3.5 mm)、超音波生体顕微鏡(UBM)を備えた超高周波心エコー検査装置が必要です。UBMは、一度に1匹のマウス胎児を視覚化するための解像度(軸方向30 μm x 68 μm)を提供する小さなイメージングウィンドウ(15 mm x 14 mm)を備えたさまざまな高周波(30〜50 MHz)プローブを提供します。40 MHzトランスデューサは、心血管表現型を識別するための高解像度画像を提供します7。
- 心エコー検査装置の電源を入れ、プログラム 心臓病学を選択します。
注:次のプロトコルは、胎児の日(E)14.5から19.5までの任意のマウスバックグラウンドに使用できます。 - 麻酔導入チャンバーで目的のマウスを麻酔します。4%のイソフルランと医療用酸素の濃度を1 L / minの流量で麻酔を誘発し、維持のために2%〜3%に減らします。
- マウスをイメージングプラットフォームにすばやく置きます。イメージングプラットフォームは、処置中にマウスを暖かく保つためにスチールを加熱しています。マウスの口と鼻を麻酔鼻コーンに入れます。動きを避けるために手足をテープで固定します。心拍数を監視して、400〜450bpmの間にとどまるようにします。
- 直腸温度計プローブを使用して温度を監視し、37°C±0.5°Cにあることを確認します。 低酸素を避けるために呼吸を監視します。危害を防ぐために、プローブに穏やかな力をかけてください。
注意: ヒートランプをマウスの上に設定して、麻酔下での低体温を防ぎ、麻酔から回復することができます。ワセリン眼科用軟膏は、ドライアイを避けるための潤滑剤として使用することができます。 - 脱毛クリームを使用して胸部と腹部から毛皮を取り除きます。クリームを塗り、3分待ってから取り出します。70%エタノールでその領域をきれいにします。エタノールはシェービング潤滑剤として水よりも効果的です。
- 超音波ゲルを通常の体温に温めます。超音波ゲルをたっぷりと塗布し、トランスデューサーを腹部に配置して水平面に向け、画面上の膀胱を識別します。膀胱が特定されたら、膀胱から頭蓋をスキャンして胎児を探します。クラウンからランプまでの長さを測定して、在胎週数10 を決定します(図 1および 表1)。
メモ: 探触子の位置を変更して、横方向の4チャンバー、矢状、正面/冠状のイメージング面など、さまざまな面を視覚化します7 (図1)。 - カラードップラーを使用して、心臓からの血流を分析します。
- 胚が意図した段階に達していない場合は、マウスをケージに戻します。それ以外の場合は、マウスを収穫用に準備します。
注意: マウスをケージに戻す前に、マウスがすでに目を覚まし、麻酔から十分に回復していることを確認してください。 - イソフルランと酸素をオフにし、作業領域を清掃し、機械の電源を切ります。
注意: 探触子からゲルを取り除くことが重要です。
2.剖検
注:胎児心エコー検査を使用して異常な心臓表現型が疑われると、胎児を収集し、固定液(10%緩衝ホルマリンリン酸または4%パラホルムアルデヒド(PFA)のいずれか) に全身を 浸して固定します。サンプルの外部および内部の形態を検査し、巨視的な解剖学的異常または奇形を探します。
- マウスを準備します。
- マウスが成体の場合、標準のCO2 プロトコルを使用してマウスを安楽死させます。鉗子または解剖ハサミを使用して外側胸部と腹部を切開(約3 cm)し、固定液を内臓に浸透させます。
注:胚がE24より古い場合、サンプルは剖検前に少なくとも14.5時間固定する必要があります。
- マウスが成体の場合、標準のCO2 プロトコルを使用してマウスを安楽死させます。鉗子または解剖ハサミを使用して外側胸部と腹部を切開(約3 cm)し、固定液を内臓に浸透させます。
- 体の外側を分析します。
- サンプルの識別、顕微鏡の倍率、画像の内容など、名前を付けて画像を保存するようにソフトウェアを設定します。
注:1.0倍から3.2倍の倍率は、E14.5マウス以上のほとんどの構造をイメージングするのに十分なはずです。 - 実体顕微鏡レンズの下のプレートにマウスを置きます。プレートにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を充填してサンプルを完全に覆い、写真の脱水や反射を防ぎます。画面に胚全体が含まれるように倍率を調整してから、胚の左側と右側の両方を撮影します。
注意: プレートの底部は、ピン留めを容易にするために、パラフィン、シリコン、または別のそのような基板でコーティングする必要があります。 - サンプルを上向きにして喉にピンで留め、別の写真を撮ります。
注意: ピンを少し上に向けて、胸腔の重要な構造に穴が開いていないことを確認します。
- サンプルの識別、顕微鏡の倍率、画像の内容など、名前を付けて画像を保存するようにソフトウェアを設定します。
- 胸を分析します。
- 鉗子で首の真ん中の皮膚を持ち上げながら、ハサミで両方の脇の下に向かって皮膚を切り、中央軸に沿って尾に向かって皮膚を切ります。次に、臍から脚まで皮膚を切ります。手首と足首にサンプルを固定します。
注意: 皮膚だけを切るように注意してください。はさみの刃を水平に保持するか、上向きに角度を付けることをお勧めします。 - 結合組織を切り離すには、一方の鉗子で皮膚を持ち上げ、もう一方のペアで下にある組織を所定の位置に保持します。サンプルを皮膚にピンで留めて、胸部と腹部を露出させます(図2)。
注意: ピン留め、切断、またはこすっているときに伸ばしすぎると、組織が損傷する可能性があります。 - 露出した筋肉の写真を撮り、筋肉をそっとこすり落として肋骨を露出させます。
- 露出した肋骨の写真を撮ります。リブをダイヤフラムから分離し、両側のリブを首に向かって横軸上で可能な限りカットします。
- 切り取られた肋骨を取り除いて心臓を露出させます。心臓の写真を撮ります。
- 胸腺を1対の鉗子で剥がして取り除きます。もう一方の鉗子を使用して胸腺の基部を安定させ、下にある血管を引き裂かないようにします。心臓と大きな血管の写真を撮ります。
注:ピンを使用して隣接する構造を引き伸ばすと、より良いイメージングビューが得られる場合があります。さらに、大動脈、心臓、およびその他の関心のある構造に焦点を当てた別々の写真を撮ります。
- 鉗子で首の真ん中の皮膚を持ち上げながら、ハサミで両方の脇の下に向かって皮膚を切り、中央軸に沿って尾に向かって皮膚を切ります。次に、臍から脚まで皮膚を切ります。手首と足首にサンプルを固定します。
- 腹部を分析します。
- 横隔膜を引っ張って取り外し、肝臓を露出させます。写真を撮ります。
- 肝臓をピンで留めて、胃と膵臓を露出させます。写真を撮ります。
- 食道を切る。結腸と腸を鉗子で引き抜いて取り除きます。肝臓のすぐ上を切り、それを取り除くと腎臓と副腎が現れます。写真を撮ります。
注:除去した臓器は固定液に保管してください。
- ECM分析のために胸郭を分離します。
- 肝臓と肺の間の直線に沿って下胸部を切ります。頸動脈の枝を切らないように十分に高く頭を切り落とします。
- 背肋骨と背骨を維持しながら、外側肋骨をそっと取り外します。背側の脂肪をはがしてこすり落とします。
- 胸部を体の他の部分から切り離し、10%緩衝リン酸ホルマリン溶液に入れます。
3. 埋め込み
- 固定液を適切な有害廃棄物ボトルにデカントします。サンプルを1x PBSで15分間3回洗浄します。
- 濃度を上げるエタノールとキシレンを使用して、サンプルを脱水します。以下のすべてのステップの期間は、胚の段階によって異なります。詳細については、 表2 を参照してください。
注意: サンプルの損傷を避けるために、溶液を変更するときは注意が必要です。サンプル処理に最適なパラメータは、経験的に調整できます。キシレンは特定のプラスチックを溶解します。ガラス器具と容器を使用する必要があります。 - キシレンをパラフィンと交換して、希望の期間使用します。ボトルを65°Cのインキュベーターに適切な時間放置します(表2)。
- 新鮮なパラフィンを使用して、サンプルを目的の位置に埋め込みます。
注意: サンプルをパラフィンブロックの中央に向け、背側を上に向けて、後側をブロックの前面に向けることをお勧めします。サンプルの向きを決めるときは、ブロックを逆さまにしてサンプルが埋め込まれていることに注意してください。
4. エピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)
注:適切な埋め込みの後、胚は組織病理学分析のためにECM を介して 連続的に画像収集を受けます。個々のスライドは、さらなる研究のためにミクロトームから回収することができます。
- -20°Cの冷凍庫からパラフィンブロックを取り出し、金型を取り出します。
- かみそりの刃を使用して、カセットの端と背面のワックスをトリミングします。カセットに取り付けられたワックスの小さな正方形に包まれるまで、サンプルを囲むワックスをカットします。
注意: ブレードを取り扱うときは細心の注意を払ってください。 - 金属製のレバーを使用して、パラフィンブロックをミクロトームのスライスステージに固定します。実行モードでMAN(手動)機能を選択し、パラフィンの表面をブレードに近づけ、数回スライドを実行して、ブレードがパラフィンブロックに接触することを確認します。
- LAS AFアプリケーションを開き、マトリックススクリーナーを選択します。[単一の通常の行列] を選択し、以前に保存した適切なテンプレートを読み込みます。クイックLUTボタンをクリックして、白とオレンジのオンブルに切り替えます。
- [ジョブの設定]を選択し、405nmの可視レーザーを最大までドラッグします。スペクトルブロックの左端を405 nmの線に合わせ、右端を800 nmの線にドラッグします。ピンホールオプションをマークして、ライブビューを開始します。
- レーザー投影の位置を調整して標本を画面の中央に配置し、 ズーム ノブを~20倍に調整します。解像度を最適化するには、ゲインを1,250 Vに設定し、フォーカスノブを使用して青色の領域を最大化します。次に、イメージングのためにゲインを約750Vにリセットします。
注:具体的な値は、胚の状態によって異なる場合があります。 - 切断方法を Autoに切り替え、厚さを50μm前後に設定して、スライドを実行します。肺と気道が見えたら切断を停止します。
- 8〜10μmの切断厚さを選択し、 ライブ を停止します view. ミクロトームコミュニケーター を開いてイメージングを開始します。画像を収集する前に、一時ストレージフォルダが空であることを確認してください。
- 追加の心臓構造が視覚化されていない場合は、切断を停止します。 Microtome Communicator アプリケーションを終了し、後で3D再構成するために画像処理ソフトウェア を介して 一時ファイルを1つの.tiff画像シリーズにエクスポートします。
5. 3次元(3D)再構成
注:3D再構成の目的は、ECMイメージングからの2D画像スタックを冠状、矢状、および横方向の3Dビデオに処理し、サンプルの構造的および解剖学的異常の診断に3Dビデオを使用することです。
- 画像処理ソフトウェアでECM画像スタックを開きます。
- ファイルを画像処理ソフトウェアにドラッグアンドドロップします。ECM 画像を水平方向に反転するには、メニューバーで [ 画像>変換] > [水平方向に反転 ] を選択します。
- 反転した画像を保存し、画像処理ソフトウェアを閉じます。
- DICOM表示ソフトウェアにECM画像スタックをインポートします。
- 水平方向に反転したECM画像をDICOM表示ソフトウェアにドラッグアンドドロップします。サンプルリストの周囲に水色の境界線があるか、既存のサンプルフォルダに画像が追加されていることを確認してください。
- ポップアップウィンドウが表示されたら、データベースにコピーするリンクまたはファイルを選択します。DICOM表示ソフトウェアにコピーされたファイルと同じ名前の新しいサンプルがサンプルリストに表示されます。
- 新しく追加したファイルをクリックして開きます。
- 3D 再構築を実行します。
- ファイルを開いたら、ツールバーの [2D / 3D再構築ツール ]メニューをクリックし、[ 3D MPR]を選択します。
- ピクセル X 解像度と ピクセルY解像度は、ECMイメージング中に使用するズームを指定して画像解像度を入力します。スライス間隔には、ECMイメージング中にカットに使用する スライスの厚さを入力します。
注意: カメラの解像度はカメラのズームによって変化し、カメラごとに異なる場合があります。
- 左側の[ ツール ]タブのさまざまなツールを使用して、必要に応じて画像スタックを調整します。
- WW / WLツールを使用して、ウィンドウ幅とウィンドウレベルを調整します。画像上のツールをクリックして上方向にドラッグすると画像の明るさが下がり、下向きにドラッグすると画像の明るさが上がります。画像のツールをクリックして右にドラッグすると画像のコントラストが下がり、左にドラッグするとコントラストが上がります。
注意: ある構造に最適なWW / WL設定が、別の構造では最適ではない場合があります。このため、異なる構造を表示するために別々のビデオを作成することをお勧めします。 - パンツールを使用して、画像を目的の位置にドラッグします。ズームツールを使用して画像を必要に応じて拡大または縮小し、回転ツールを使用して画像を必要に応じて回転させます。
注意: 画像を拡大すると、画質が低下する場合があります。画像を回転させると軸が反転する可能性があるため、注意してください。
- WW / WLツールを使用して、ウィンドウ幅とウィンドウレベルを調整します。画像上のツールをクリックして上方向にドラッグすると画像の明るさが下がり、下向きにドラッグすると画像の明るさが上がります。画像のツールをクリックして右にドラッグすると画像のコントラストが下がり、左にドラッグするとコントラストが上がります。
- 最初のパネルの色付き軸をクリックしてドラッグします。この軸を回転させると、他の 2 つのパネルの向きがどのように変化するかに注目してください。3つのパネルがサンプルのコロナ、矢状、および横方向のビューを表すまで、3つのパネルの軸を回転させます。
注意: サンプルの向きを変えるときは、正しい前後の向きを維持してください。 - ビデオを生成します。
- 3つのパネルすべてを適切に配置、向き、明るくしたら、コロナビューを表すパネルをクリックします。
- メニューバーの右側にある [ムービーのエクスポート ]をクリックします。 [バッチ] をクリックし、[ 開始 ] スライダーと [終了 ] スライダーをドラッグして、対象領域全体を囲みます。 [間隔]で、[ 厚さと同じ ]オプションを選択します。ビューの向きを示すビデオを保存します。
- ビデオを確認して、関心のある構造を適切に識別できるかどうかを確認します。そうでない場合は、ツール(手順5.4)を使用して、必要に応じてビデオを再調整し、ビデオを再保存します。
- 横方向と矢状ビューに対して手順 5.6 を繰り返します。再構築されたビデオを使用してサンプルを診断します。
注意: 各向きのビデオを注意深く見て、サンプルが解剖学的異常または疾患表現型を示すかどうかを完全に評価します(図3)。
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Representative Results
重大な血行動態障害を有するマウス胚は、胚致死であることが指摘された。さまざまなビューを使用した高出力の非侵襲的胎児心エコー図により、さまざまなCHDを特定できます(図1)。
中隔欠損症:最も一般的なCHDは、心室中隔欠損症(VSD)、房室中隔欠損症(AVSD)、心房中隔欠損症(ASD)などの中隔欠損症です1。VSDまたはAVSDは、2D画像とカラーフロー画像を使用して簡単に視覚化できます。心室を横切る、または心房と心室の間の血流を簡単に識別できます(図3)。ASDは、胎児の卵円孔開存症と区別することは困難です。
流出路の異常:図3に示すように、主肺動脈における流れは、正常胚における上行大動脈流を横切る。右心室の二重出口(DORV)を有する胚では、両方の大動脈が右心室から生じているのが見られる。DORVはVSDにも関連しており(図3D)、カラーフローを使用して識別できます。ただし、胚のサイズが小さいため、DORVは、大動脈、肺閉鎖症、または持続性動脈切開症(PTA)のオーバーライドと確実に区別できない場合があります。PTAでは、胎児心エコー図に1つの流出路の流れしか見られません(図3E)。詳細なアーチ構造と主肺動脈は、剖検を使用して観察できます(図2E、F)。
剖検は、胸部と腹部の座状態、および胸部に対する心臓の位置(低心脈(図2C-E)または右心不全のいずれか)を迅速に診断できます。流出路の構造と心房と心室の両方の相対的なサイズを簡単に視覚化できます(図2E、F)。
ECM組織病理学は、構造的心臓異常を評価するためのゴールドスタンダード技術です8、11、12。それは胚の構造に比類のない解像度と詳細を提供します。異なる平面とビューを使用した3次元再構成は、大動脈と心室の関係(図3)と心室と心房の間の欠陥を簡単に特定できます。
図1:妊娠期間を決定するために、胚の2D心エコー図画像でクラウンランプの長さを測定する場所。 (A)E11.5、(B)E12.5、(C、D)E13.5-E14.5における胚の2D心エコー画像。(D)罹患胚は(C)兄弟よりも小さく、水腫(矢印)を伴う「どろどろした」外観を有することが指摘される。(A-C)生きた胚は異なる器官を示します。(E)流出路を画像化するために前方に傾けたコロナ4室ビューのE14.5心臓のカラー画像を用いた代表的なVBモードは、(E')冠状ビューのECMで確認された大動脈の正常な関係を有する無傷の心室中隔を示す。(F)E14.5心臓の代表的な矢状図は、上行大動脈(AO)が頭蓋に向けられ、肺動脈が後方(脊椎に向かって)を向いた左心室および右心室流出路を示しており、(F')矢状図のECMで確認されています。(G)左心室(LV)と右心室(RV)の代表的な横図、(G')横図のECMで確認されます。(H)ECMにおける心臓の基部の横方向の図は、明確で分離された大動脈弁(AV)と肺動脈弁(PV)を示しています。PVはAVの前方にある。 (H') 持続性切開動脈症(PTA)の代表的なECM横図画像は、分割されていない持続性切開動脈から後方に生じる左肺動脈および右肺動脈を示し、左頸動脈は持続性切開動脈から前方および頭蓋に生じる。略称:A:前部、AO:大動脈、AV:大動脈弁、Cd:尾側、Cr:頭蓋、DAO:下行大動脈、L:左、LA:左心房、LCA:左頸動脈、LPA:左肺動脈、LV:左心室、P:後、PA:肺動脈、PTA:持続性動脈切開、R:右、RA:右心房、RPA:右肺動脈、RV:右心室。スケールバー:0.5 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:心血管異常を観察するための剖検の代表的な画像 。 (A)明らかな表現型のない黒い背景の解剖皿に固定された胚。画像は、頭、デジタル、胸腔、腹部の肉眼解剖学的構造を示しています。(B)真皮が子犬から取り除かれ、顎下腺、胸郭、腹部が現れます。(C)胸郭が持ち上げられ、胸腺、心臓、肺、横隔膜を含む胸腔の肉眼解剖学的構造が明らかになります。(D)胸郭を取り外した胸部のズームビュー。(E)胸腺が取り除かれ、大きな血管と気管が現れます。(F)偉大な船舶のズームビュー。略語:AAO:上行大動脈、D:横隔膜、LA:左心房、LCA:左頸動脈、LSVC:左上大静脈、LV:左心室、P:心膜、RA:右心房、Rb:肋骨、RCA:右頸動脈、RL:右肺、RSVC:右上大静脈、RV:右心室、S:胸骨、SCA:右鎖骨下動脈、SMG:顎下腺、T:気管、Th:胸腺。スケールバー:1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:代表的な胎児心エコー図(エコー)とエピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)からの画像。 (A)エコーは、心室シャントのない無傷の心室中隔を示し、正常なコントロールでは正常に関連する大動脈であり、E14.5-15.5段階で(A')ECMによって確認されます。(B)房室中隔欠損症(AVSD)の超音波検出。4チャンバービューのエコーイメージングは、E14.5段階で(B')ECMによって確認されたLA、RA、LV、およびRV間の通信を示しています。(C)色の流れを伴う心室中隔欠損症(VSD)の超音波診断は、E16.5段階で(C')ECMによって確認されたLVとRVを横切る流れを示しています。(D)エコーと(D')ECMは、E14.5段階でLVとRVの間に大動脈が並んでいる(大動脈は肺動脈の右側にある)VSDを伴うDORVを示しています。(E)持続性動脈切開症(PTA)の超音波診断は、LVとRVの間の通信を示し、単一の流出路が両心室(PTA)を上書きします。(E')この病理はE14.5段階でECMによって確認されています。スケールバー:0.5ミリメートルAO:大動脈、AVSD:房室中隔欠損、Cd:尾部、Cr:頭蓋、L:左、LA:左心房、LV:左心室、PA:肺動脈、PTA:持続性動脈切開、R:右、RA:右心房、RV:右心室、VSD:心室中隔欠損。スケールバー:0.5 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 舞台 | クラウンからランプまでの長さ(mm) | 胎児面積(mm2) | 心臓面積(mm2) | 心臓領域/胎児領域 |
| E12.5 | 7.9 ± 0.8 (n = 77) | 23.2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13.5 | 10.5 ± 0.9 (n = 92) | 40.9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14.5 | 12.5 ± 0.9 (n = 101) | 57.6 ± 8 (n = 101) | 2.9 ± 0.5 (n = 70) | 0.050 ± 0.004 (n = 70) |
| E15.5 | 14.1 ± 0.5 (n = 134) | 71.4 ± 6 (n = 134) | 3.8 ± 0.4 (n = 87) | 0.053 ± 0.004 (n = 87) |
| E16.5 | 15.4 ± 0.6 (n = 112) | 82.7 ± 6 (n = 112) | 4.9 ± 0.5 (n = 87) | 0.058 ± 0.007 (n = 87) |
| E17.5 | 16.6 ± 0.4 (n = 211) | 96.9 ± 7 (n = 211) | 6.1 ± 0.6 (n = 146) | 0.063 ± 0.004 (n = 146) |
| E18.5 | 17.7 ± 0.6 (n = 139) | 112.1 ± 8 (n = 139) | 7.1 ± 0.8 (n = 93) | 0.063 ± 0.005 (n = 93) |
| E19.5 | 18.7 ± 0.7 (n = 57) | 126.7 ± 8 (n = 57) | 7.7 ± 0.7 (n = 36) | 0.062 ± 0.005 (n = 36) |
表1:胎児の成長の発達プロファイル。
| E14.5 | E16.5 | E18.5 | 新生児 | |
| 70%エタノール | 1時間 | 1.5時間 | 3時間 | 4時間 |
| 95%エタノール | 35分 | 45分 | 1時間 | 1時間 |
| 95%エタノール | 35分 | 45分 | 1時間 | 1時間 |
| 100%エタノール | 15分 | 15分 | 30分 | 6 ミン |
| キシレン 1 | 20分 | 30分 | 40分 | 30分 |
| キシレン 2 | 20分 | 30分 | 40分 | 30分 |
| ワックス 1 | 20分 | 20分 | 20分 | 30分 |
| ワックス2 | 20分 | 20分 | 20分 | 30分 |
| ワックス 3 | 一夜 | 一夜 | 一夜 | 一夜 |
表2:胚の日数に基づく胚移植のプロトコル。
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Discussion
遺伝子改変マウスは、先天性心疾患の病態メカニズムを理解するために使用されています。この研究で提供するプロトコルは、マウス胎児の心臓の欠陥を評価するプロセスを合理化および標準化しようとしています。ただし、プロトコル中に注意すべき重要な手順があります。マウスの胚は妊娠の各日に有意に成長し、胎児の心エコー図を正確に行うことでマウスを採取する正確な時期を決定することができます。胎児心エコー図は、胎児の心血管病理をスクリーニングするために使用できます。2D画像は、血流を調べ、心臓の腔または異常な流出と流入路の間の通信を検出するためにカラードップラーの助けを借りて、異常な解剖学的構造と心機能の識別を可能にします。CHD診断を決定するために、胎児は、流出路中隔および心腔形成が完了した胚の日E14.5からスキャンされる。初期段階でのスキャンは、発達の遅れを反映している可能性があります。
組織病理学は、ミクロトームとそれに続く光学顕微鏡の視覚化を使用してCHD8を特徴付けるための標準です。標準的な方法の主な欠点は、診断のための心血管構造の直感的な3D表示の欠如と、サンプルの異なるビューを提供しないという制限です。ECM組織学は、心臓の欠陥を特徴付けるための最も時間効率の良い方法です。ECMが利用できない場合は、ミクロトームを使用して胚を切片化し、心臓の表現型を決定することができます。心臓画像を取得するための他のオプションは、ハイスループット、高解像度の磁気共鳴画像法(MRI)またはコンピューター断層撮影(CT)を実行することです。MRIまたはCTの重要な側面の1つは、複数の胚を同時に画像化できることです。ただし、超音波、CT、またはMRIの表現型検査の後でも、CHD診断を確認するには組織病理学が必要です。
組織病理学にECMイメージングを使用して、自動スライドミクロトーム上に取り付けられたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、各カット後に胚を連続イメージングします。ECMから収集された個々の画像は、その後の3D再構成を可能にし、画像を再撮影することなく、任意の画像平面でサンプルをデジタル的にスライスすることを可能にする8,11。このような手術は、心臓の解剖学的構造の包括的な評価を可能にし、それは異なる発達段階で使用することができる。さらに、ECM機器からデータを収集しながら、ミクロトームから個々のスライドを回収することができます。ECM組織病理学は、心臓の構造異常を評価するためのゴールドスタンダードですが、機器、ソフトウェア、および胚あたりの実行時間の可用性には制限があります。胚性心臓を切片化する実行時間は、そのサイズに応じて、サンプルあたり1〜3時間の範囲で変化します。機器の複雑さのため、研究者は定期的にコンピューターをチェックして、フィールド内の関心領域が記録されていることを確認する必要があります。研究者はまた、パラフィンワックスの削りくずがレーザースキャナーからのサンプルを遮っていないことを確認するために、サンプルをチェックする必要があります。
ECMとその後の3D再構成は、標本の埋め込み計画に関係なく、心臓の構造的欠陥の完全な高解像度評価を提供します。これらのプロトコルは、さまざまなCHDの診断に成功し、マウスモデルにおける心臓胚発生と遺伝子変異に関連する病状を理解するのに役立ちました。
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Disclosures
著者は、この原稿で利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
何一つ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
