Summary
이 기사에서는 태아 심 초음파, 부검 및 episcopic confocal 현미경 (ECM)을 사용한 episcopic 형광 이미지 캡처 (EFIC)를 사용한 쥐 선천성 심장병 (CHD) 진단 방법에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
선천성 심장병 (CHD)은 미국에서 유아 사망의 주요 원인입니다. 1980 년대와 그 이전에 중등도 또는 중증 CHD 환자는 성인이되기 전에 사망했으며 생후 첫 주 동안 최대 사망률을 보였습니다. 수술 기술, 진단 접근법 및 의료 관리의 놀라운 발전으로 결과가 크게 개선되었습니다. 선천성 심장 결함을 이해하는 중요한 연구 요구를 해결하기 위해 쥐 모델은 인간과 심장 해부학이 매우 유사하고 임신 속도가 짧기 때문에 이상적인 연구 플랫폼을 제공했습니다. 유전 공학과 고 처리량 표현형 도구의 결합은 구조적 심장 결함의 복제 및 진단을 통해 CHD 뒤에있는 분자 경로를 더 자세히 설명 할 수있었습니다. 3차원(3D) 재구성을 통해 에피스코프 컨포칼 현미경(ECM) 조직병리학을 사용한 고충실도의 에피스코픽 형광 이미지 캡처(EFIC)와 결합된 마우스 모델의 심장 표현형을 스크리닝하기 위한 비침습적 태아 심초음파를 사용하면 다양한 선천성 심장 결함의 해부학에 대한 자세한 보기가 가능합니다. 이 프로토콜은 쥐 선천성 심장 결함의 정확한 진단을 얻기 위해 이러한 방법의 완전한 워크 플로우를 설명합니다. 이 표현형 프로토콜을 모델 유기체에 적용하면 정확한 CHD 진단이 가능하여 CHD 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. CHD의 기본 메커니즘을 확인하는 것은 잠재적인 치료법과 개입의 기회를 제공합니다.
Introduction
선천성 심장 질환(CHD)은 가장 흔한 신생아 선천적 결함1,2으로 신생아의 약 0.8%-1.7%에 영향을 미치고 상당한 신생아 사망률과 이환율3을 초래합니다. 유전 적 병인은 CHD 4,5로 강력하게 나타납니다. 유전자 변형 마우스 모델은 CHD의 복잡성과 마우스와 인간 태아에서 4 개의 챔버 심장과 유사한 심장 발달 DNA 서열을 갖는 마우스로 인해 CHD를 유발하는 메커니즘을 이해하기 위해 널리 사용되었습니다6. 마우스 돌연변이체의 표현형을 확인하는 것은 표적 유전자의 기능을 특성화하는 기본적인 첫 번째 단계입니다. 단일 유전자 돌연변이가 인간 CHD를 모방하는 심장 결함의 스펙트럼을 초래할 수있는 유전자 투여 효과를 나타내는 마우스 모델은 CHD의 복잡성과이를 유발하는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.
이 문서에서는 마우스 모델에서 심장 표현형을 특성화하는 파이프라인을 간략하게 설명합니다. 적용된 방법은 태아 심 초음파 7, 부검 및 ECM 조직 병리학 7,8을 사용하여 쥐 심장 표현형 발달의 상세한 해부학을 표시 할 수 있습니다. 태아 심 초음파는 합리적인 이미징 해상도로 여러 배아를 직접 시각화 할 수있는 비 침습적 양식입니다. 또한 태아 심 초음파는 깔짚에있는 배아의 총 수, 발달 단계, 자궁 뿔의 상대적 방향과 위치를 신속하게 결정합니다. 스펙트럼 도플러 / 색상 흐름을 사용하여 구조, 혈역학 적 장애, 성장 제한 또는 수종의 발달을 기반으로 비정상적인 배아를 식별 할 수 있습니다. 태아 심 초음파 연구는 비 침습적 기술이기 때문에 여러 날에 스캔하고 혈류 역학 또는 심장 형태의 변화를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 태아 심 초음파의 고품질 영상을 얻으려면 경험과 지식 부족으로 인해 특정 심장 결함을 놓칠 수 있으므로 연습과 기술이 필요합니다. 이 때문에 부검과 ECM 조직 병리학의 조합을 통해 심장 형태에 대한보다 확실한 분석을 얻을 수 있습니다. 부검은 아치 구조, 대동맥과 폐동맥의 상대적 관계, 심실과 심방의 크기, 가슴에 대한 심장의 위치 및 기관지 폐 구조의 직접적인 시각화를 제공합니다. 그러나 심장 판막 및 벽 두께와 같은 내부 특징은 부검만으로는 평가하기 어려울 수 있습니다. 따라서 결정적인 진단을 위해서는 ECM 조직 병리학이 권장됩니다. ECM 조직병리학은 이미지 스택(9)의 2D 및 3D 재구성 모두를 허용하는 고해상도 시각화 기술이다. 이 이미지는 파라핀이 포매된 샘플의 연속 Episcopic 형광 이미징을 통해 얻어지며, 자동 마이크로톰에 의해 일정한 간격으로 얇게 절단됩니다. 고전적인 조직학과 달리 이미지는 블록에서 절단되기 전에 섹션으로 캡처되어 모든 이미지가 동일한 참조 프레임 내에서 캡처됩니다. 이 때문에 ECM 조직 병리학에 의해 생성 된 2D 이미지 스택은 쉽고 안정적으로 3 차원으로 재구성 될 수 있습니다. 이것은 DICOM 뷰어를 사용하여 수행되며, 이를 통해 관상, 시상 및 횡단의 세 가지 해부학적 평면에서 이미지를 3D 시각화할 수 있습니다. 이러한 고해상도 3D 재구성으로부터 결정적인 심장 진단이 이루어질 수 있습니다. 이 세 가지 시각화 양식을 개별적으로 또는 조합하여 적용하면 마우스 배아의 구조적 심장 결함에 대한 정확한 특성을 제공할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
마우스는 인간 CHD를 모방 할 수있는 4 개의 챔버가있는 심장을 가지고 있기 때문에 이러한 연구를 위해 마우스를 사용하는 것이 필요합니다. 마우스는 수의학 치료를 받았으며 기관의 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC) 인증 동물 관리 시설에 수용되었습니다. 마우스의 불편 함, 스트레스, 통증 및 부상을 최소화하기 위해 엄격한 프로토콜을 따랐습니다. 마우스를CO2 가스를 사용하여 안락사시켰으며, 이는 안락사에 관한 미국 수의학 협회 지침에 따라 작은 설치류에 대해 허용된다. 이 원고의 마우스에 대한 연구는 피츠버그 대학에서 승인 된 IACUC 프로토콜로 수행되었습니다.
1. 태아 심 초음파
알림: 심초음파는 생쥐의 심혈관 기형과 심장외 결함을 식별하는 강력한 도구입니다. 마우스 배아의 크기가 작기 때문에 (임신 중기에 약 1-2mm, 출생시 3.5mm) 초음파 생체 현미경 검사 (UBM)가있는 초고주파 심 초음파 장비가 필요합니다. UBM은 한 번에 하나의 마우스 태아를 시각화할 수 있는 해상도(30μm 축 x 측면 68μm)를 제공하는 작은 이미징 창(15mm x 14mm)이 있는 다양한 고주파(30-50MHz) 프로브를 제공합니다. 40MHz 변환기는 심혈관 표현형을 식별하기 위해 고해상도 이미지를 제공합니다7.
- 심 초음파 기계를 켜고 심장학 프로그램을 선택하십시오.
참고: 다음 프로토콜은 배아 일(E)14.5에서 19.5까지의 모든 마우스 배경에 사용할 수 있습니다. - 마취 유도 챔버에서 원하는 마우스를 마취하십시오. 4% 이소플루란 농도와 의료용 산소를 1L/min의 유속으로 사용하여 마취를 유도하고 유지 관리를 위해 2%-3%로 줄입니다.
- 마우스를 이미징 플랫폼에 빠르게 놓습니다. 이미징 플랫폼에는 시술 중에 마우스를 따뜻하게 유지하기 위해 강철이 가열되어 있습니다. 마우스의 입과 코를 마취 코 콘에 넣으십시오. 움직이지 않도록 팔다리를 테이프로 고정하십시오. 심박수가 400-450bpm 사이로 유지되도록 모니터링합니다.
- 직장 온도계 프로브를 사용하여 온도를 모니터링하고 37 ° C± 0.5 ° C에 있는지 확인하십시오. 저산소증을 피하기 위해 호흡을 모니터링하십시오. 손상을 방지하기 위해 프로브에 부드러운 힘을 유지하십시오.
알림: 열 램프는 마우스 아래에 있는 동안 저체온증을 예방하고 마취에서 회복하기 위해 마우스 위에 설정할 수 있습니다. 바셀린 안과 연고는 안구 건조증을 예방하기위한 윤활제로 사용할 수 있습니다. - 탈모 크림을 사용하여 흉부와 복부에서 모피를 제거하십시오. 크림을 바르고 제거하기 전에 3 분 정도 기다리십시오. 70 % 에탄올로 해당 부위를 청소하십시오. 에탄올은 면도 윤활제로 물보다 더 잘 작동합니다.
- 초음파 젤을 정상 체온으로 예열하십시오. 초음파 젤을 넉넉하게 바르고 변환기를 복부에 놓아 수평면에 방향을 지정하고 화면에서 방광을 식별합니다. 방광이 확인되면 방광에서 두개골로 스캔하고 태아를 찾습니다. 정수리에서 엉덩이까지의 길이를 측정하여 재태 연령10 을 결정합니다(그림 1 및 표 1).
참고: 변환기 위치를 변경하여 가로 4챔버, 시상 및 정면/코로나 이미징 평면(7 )을 포함한 다양한 평면을 시각화합니다(그림 1). - 컬러 도플러를 사용하여 심장에서 혈류를 분석하십시오.
- 배아가 의도 한 단계에 도달하지 않은 경우 마우스를 새장에 다시 넣으십시오. 그렇지 않으면 수확을 위해 마우스를 준비하십시오.
알림: 마우스를 케이지에 다시 넣기 전에 마우스가 이미 깨어 있고 마취에서 잘 회복되었는지 확인하십시오. - 이소플루란과 산소를 끄고 작업 영역을 청소한 다음 기계를 끕니다.
알림: 변환기에서 젤을 제거하는 것이 중요합니다.
2. 부검
알림: 태아 심 초음파를 사용하여 비정상적인 심장 표현형이 의심되면 태아를 수집하고 고정 용액 (10 % 완충 포르말린 인산염 또는 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA))에 전신 침수를 통해 고정합니다. 샘플의 외부 및 내부 형태를 검사하여 거시적 해부학적 이상이나 기형을 찾습니다.
- 마우스를 준비하십시오.
- 마우스가 성인인 경우, 표준CO2 프로토콜을 사용하여 마우스를 안락사시킨다. 집게나 해부 가위를 사용하여 측면 흉부와 복부에 절개(약 3cm)를 하여 정착액이 내부 장기에 침투할 수 있도록 합니다.
알림: 배아가 E24보다 오래된 경우 부검 전 최소 14.5시간 동안 샘플을 고정해야 합니다.
- 마우스가 성인인 경우, 표준CO2 프로토콜을 사용하여 마우스를 안락사시킨다. 집게나 해부 가위를 사용하여 측면 흉부와 복부에 절개(약 3cm)를 하여 정착액이 내부 장기에 침투할 수 있도록 합니다.
- 신체의 외부를 분석하십시오.
- 샘플 식별, 현미경 배율 및 사진 내용을 포함한 이름으로 사진을 저장하도록 소프트웨어를 설정합니다.
참고: 1.0x에서 3.2x까지의 배율은 E14.5 이상의 마우스에서 대부분의 구조를 이미징하는 데 적합해야 합니다. - 실체 현미경 렌즈 아래의 플레이트에 마우스를 놓습니다. 플레이트에 인산염 완충 식염수(PBS)를 채워 샘플을 완전히 덮어 사진에서 탈수 및 반사를 방지합니다. 화면에 전체 배아가 포함되도록 배율을 조정 한 다음 배아의 왼쪽과 오른쪽 사진을 찍습니다.
알림: 플레이트의 바닥은 고정을 용이하게 하기 위해 파라핀, 실리콘 또는 기타 기판으로 코팅되어야 합니다. - 샘플을 목구멍에 고정하고 위를 향하게 하고 다른 사진을 찍습니다.
알림: 흉강의 중요한 구조가 뚫리지 않도록 핀을 약간 위쪽으로 향하게 하십시오.
- 샘플 식별, 현미경 배율 및 사진 내용을 포함한 이름으로 사진을 저장하도록 소프트웨어를 설정합니다.
- 가슴을 분석하십시오.
- 집게로 목 중앙의 피부를 들어 올리면서 가위로 양쪽 겨드랑이 쪽으로 피부를 자른 다음 꼬리 쪽으로 정중 축을 따라 피부를 자릅니다. 그런 다음 배꼽에서 다리까지 피부를 자릅니다. 손목과 발목에 샘플을 고정합니다.
알림: 피부만 자르도록 주의하십시오. 가위의 날을 수평으로 또는 위쪽으로 기울이는 것이 좋습니다. - 결합 조직을 분리하려면 한 쌍의 집게로 피부를 들어 올리고 다른 쌍과 함께 밑에있는 조직을 제자리에 고정하십시오. 가슴과 복부를 노출시키는 데 도움이 되도록 피부를 통해 샘플을 고정합니다(그림 2).
알림: 고정, 절단 또는 긁는 동안 너무 많이 늘리면 조직이 손상될 수 있습니다. - 노출 된 근육의 사진을 찍은 다음 근육을 부드럽게 긁어 갈비뼈를 노출시킵니다.
- 노출된 갈비뼈의 사진을 찍습니다. 다이어프램에서 리브를 분리하고 양쪽의 리브를 가능한 한 측면 축에서 목쪽으로 자릅니다.
- 잘린 갈비뼈를 제거하여 심장을 노출시킵니다. 심장 사진을 찍습니다.
- 한 쌍의 집게로 흉선을 벗겨서 흉선을 제거하십시오. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 흉선 기저부를 안정화시켜 밑에있는 혈관이 찢어지지 않도록하십시오. 심장과 큰 혈관의 사진을 찍으십시오.
참고: 핀을 사용하여 일부 인접 구조물을 늘리면 더 나은 이미징 보기를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 큰 동맥, 심장 및 기타 관심 구조에 초점을 맞춘 별도의 사진을 찍으십시오.
- 집게로 목 중앙의 피부를 들어 올리면서 가위로 양쪽 겨드랑이 쪽으로 피부를 자른 다음 꼬리 쪽으로 정중 축을 따라 피부를 자릅니다. 그런 다음 배꼽에서 다리까지 피부를 자릅니다. 손목과 발목에 샘플을 고정합니다.
- 복부를 분석하십시오.
- 다이어프램을 당겨 제거하고 간을 노출시킵니다. 사진을 찍습니다.
- 위를 드러내기 위해 간을 뒤로 고정하십시오. 사진을 찍습니다.
- 식도를 자르십시오. 결장과 내장을 집게로 당겨 제거하십시오. 간 바로 위를 자르고 제거하여 신장과 부신을 드러냅니다. 사진을 찍습니다.
알림: 제거 된 장기는 고정 용액에 보관해야합니다.
- ECM 분석을 위해 흉부를 분리합니다.
- 간과 폐 사이의 직선을 따라 아래쪽 흉부를 자릅니다. 경동맥의 가지를 자르지 않을 정도로 머리를 자릅니다.
- 등쪽 갈비뼈와 척추를 유지하면서 측면 갈비뼈를 부드럽게 제거하십시오. 등 지방을 껍질을 벗기고 긁어냅니다.
- 신체의 나머지 부분에서 흉부를 분리하고 10 % 완충 포르말린 인산염 용액에 넣으십시오.
3. 임베딩
- 정착액을 적절한 유해 폐기물 병에 담습니다. 샘플을 1x PBS로 15분 동안 3회 세척한다.
- 에탄올과 크실렌의 농도를 증가시켜 샘플을 탈수하십시오. 다음 단계의 지속 기간은 배아의 단계에 따라 다릅니다. 자세한 내용은 표 2 를 참조하십시오.
알림: 용액을 변경할 때는 샘플이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 샘플 처리를 위한 최적의 파라미터는 경험적으로 조정될 수 있다. 크실렌은 특정 플라스틱을 용해시킵니다. 유리 도구와 용기를 사용해야합니다. - 원하는 기간 동안 크실렌을 파라핀으로 대체하십시오. 병을 적절한 기간 동안 65 ° C 인큐베이터에 두십시오 (표 2).
- 신선한 파라핀을 사용하여 샘플을 원하는 위치에 삽입하십시오.
알림: 샘플을 파라핀 블록의 중앙으로 향하게하고 등쪽이 상단을 향하고 뒤쪽이 블록 전면을 향하도록하는 것이 좋습니다. 샘플 방향을 지정할 때 샘플은 블록이 거꾸로 향하도록 내장되어 있음을 기억하십시오.
4. 비경 공초점 현미경(ECM)
참고: 적절한 삽입 후 배아는 조직병리학 분석을 위해 ECM을 통해 순차적으로 이미지 수집 을 거칩니다. 추가 연구를 위해 마이크로톰에서 개별 슬라이드를 복구할 수 있습니다.
- -20°C 냉동고에서 파라핀 블록을 꺼내 금형을 제거합니다.
- 면도날을 사용하여 카세트의 가장자리와 뒷면의 왁스를 다듬습니다. 카세트에 부착 된 작은 사각형의 왁스에 싸일 때까지 샘플을 둘러싼 왁스를 자릅니다.
알림: 블레이드를 취급하는 동안 각별히 주의하십시오. - 금속 레버를 사용하여 파라핀 블록을 마이크로톰의 슬라이싱 단계에 고정합니다. 실행 모드에서 MAN(수동) 기능을 선택하고 파라핀 표면을 블레이드에 가깝게 올린 다음 몇 개의 슬라이드를 실행하여 블레이드가 파라핀 블록에 닿도록 합니다.
- LAS AF 애플리케이션을 열고 매트릭스스크리너를 선택합니다. 단일 정규 행렬을 선택하고 이전에 저장한 적절한 템플릿을 로드합니다. 빠른 LUT 버튼을 클릭하여 흰색과 주황색 옴브레로 전환합니다.
- 작업 설정을 선택하고 405nm 가시광선 레이저를 최대로 끕니다. 스펙트럼 블록의 왼쪽 가장자리를 405nm 라인과 일치시키고 오른쪽 가장자리를 800nm 라인으로 드래그합니다. 표시 핀홀 옵션을 선택하고 라이브 뷰를 시작합니다.
- 레이저 투사의 위치를 조정하여 표본을 화면 중앙에 놓고 줌 노브를 ~20x로 조정합니다. 해상도를 최적화하려면 게인을 1,250V로 설정하고 초점 노브를 사용하여 파란색 영역을 최대화합니다. 그런 다음 이미징을 위해 게인을 약 750V로 재설정합니다.
참고: 특정 값은 배아의 상태에 따라 다를 수 있습니다. - 절단 방법을 자동으로 전환하고 두께를 약 50μm로 설정한 다음 슬라이드를 실행합니다. 폐와기도가 보일 때 절단을 중지하십시오.
- 8-10 μm 사이의 절단 두께를 선택하고 라이브 뷰를 중지합니다. 마이크로톰 커뮤니케이터를 열어 이미징을 시작합니다. 이미지를 수집하기 전에 임시 저장소 폴더가 비어 있는지 확인하십시오.
- 추가 심장 구조가 시각화되지 않으면 절단을 중지하십시오. Microtome Communicator 응용 프로그램을 닫고 나중에 3D 재구성을 위해 이미지 처리 소프트웨어를 통해 임시 파일을 하나의 .tiff 이미지 시리즈로 내보냅니다.
5. 3차원(3D) 재구성
참고: 3D 재구성의 목적은 ECM 이미징의 2D 이미지 스택을 관상, 시상 및 가로 방향의 3D 비디오로 처리하고 샘플의 구조적 및 해부학적 이상을 진단하기 위해 3D 비디오를 사용하는 것입니다.
- 이미지 처리 소프트웨어에서 ECM 이미지 스택을 엽니다.
- 이미지를 이미지 처리 소프트웨어로 끌어다 놓습니다. 메뉴 막대에서 이미지 > 변환 > 수평 대칭 이동 을 선택하여 ECM 이미지를 가로로 뒤집습니다.
- 뒤집힌 이미지를 저장하고 이미지 처리 소프트웨어를 닫습니다.
- DICOM 보기 소프트웨어에서 ECM 이미지 스택을 가져옵니다.
- 수평으로 뒤집힌 ECM 이미지를 DICOM 보기 소프트웨어로 끌어다 놓습니다. 샘플 목록 주위에 연한 파란색 테두리가 있는지 확인하거나 기존 샘플 폴더에 이미지를 추가할 수 있습니다.
- 팝업 창이 나타날 때 데이터베이스에 복사할 링크 또는 파일을 선택합니다. DICOM 보기 소프트웨어에 복사된 파일과 동일한 이름으로 샘플 목록에 새 샘플이 나타납니다.
- 새로 추가된 파일을 클릭하여 엽니다.
- 3D 재구성을 수행합니다.
- 파일이 열리면 도구 모음에서 2D/3D 재구성 도구 메뉴를 클릭하고 3D MPR을 선택합니다.
- 픽셀 X 해상도 및 픽셀 Y 해상도의 경우 ECM 이미징 중에 사용되는 줌을 제공하여 이미지 해상도를 입력합니다. 슬라이스 간격의 경우 ECM 이미징 중에 절단하는 데 사용되는 슬라이스 두께를 입력합니다.
참고: 카메라 해상도는 카메라의 줌에 따라 달라지며 카메라마다 다를 수 있습니다.
- 왼쪽의 도구 탭에서 다른 도구를 사용하여 이미지 스택을 원하는 대로 조정합니다.
- WW/WL 도구를 사용하여 창 너비와 창 수준을 조정합니다. 이미지의 도구를 클릭하고 위쪽으로 드래그하여 이미지 밝기를 줄이고 아래쪽으로 드래그하여 증가시킵니다. 이미지의 도구를 클릭하고 오른쪽으로 드래그하여 이미지 대비를 줄이고 왼쪽으로 드래그하여 증가시킵니다.
참고: 한 구조에 대한 최적의 WW/WL 설정은 다른 구조에 대해 차선책일 수 있습니다. 이러한 이유로 별도의 비디오를 만들어 다른 구조를 보는 것이 좋습니다. - 팬 도구를 사용하여 이미지를 원하는 위치로 드래그합니다. [확대/축소] 도구를 사용하여 원하는 대로 이미지를 확대하거나 축소하고 [회전] 도구를 사용하여 이미지를 원하는 대로 회전합니다.
참고: 이미지를 확대하면 이미지 품질이 저하될 수 있습니다. 이미지를 회전할 때는 축이 뒤집힐 수 있으므로 주의하십시오.
- WW/WL 도구를 사용하여 창 너비와 창 수준을 조정합니다. 이미지의 도구를 클릭하고 위쪽으로 드래그하여 이미지 밝기를 줄이고 아래쪽으로 드래그하여 증가시킵니다. 이미지의 도구를 클릭하고 오른쪽으로 드래그하여 이미지 대비를 줄이고 왼쪽으로 드래그하여 증가시킵니다.
- 첫 번째 패널의 색상이 지정된 축을 클릭하여 끕니다. 이 축을 회전하면 다른 두 패널의 방향이 어떻게 변경되는지 확인합니다. 세 개의 패널이 샘플의 관상, 시상 및 가로 보기를 나타낼 때까지 세 패널의 축을 회전합니다.
알림: 샘플의 방향을 바꾸는 동안 올바른 전방 / 후방 방향을 유지하십시오. - 비디오를 생성합니다.
- 세 패널이 모두 적절하게 배치되고 방향이 지정되고 밝아지면 코로나 뷰를 나타내는 패널을 클릭합니다.
- 메뉴 막대의 오른쪽에 있는 동영상 내보내기 를 클릭합니다. 배치 를 클릭하고 시작 및 끝 슬라이더를 드래그하여 전체 관심 영역을 포함합니다. 간격에서 두께와 동일 옵션을 선택합니다. 보기의 방향을 나타내는 비디오를 저장합니다.
- 비디오를 검토하여 관심 구조를 적절하게 식별할 수 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 도구 (5.4 단계)를 사용하여 필요에 따라 비디오를 다시 조정하고 비디오를 다시 저장하십시오.
- 가로 및 시상보기에 대해 5.6 단계를 반복하십시오. 재구성 된 비디오를 사용하여 샘플을 진단합니다.
참고: 각 방향의 비디오를 주의 깊게 시청하여 샘플에 해부학적 이상이나 질병 표현형이 있는지 여부를 완전히 평가합니다(그림 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
현저한 혈역학적 결함을 가진 마우스 배아는 배아 치명적인 것으로 나타났다. 다양한 CHD는 다양한 보기를 사용하여 고출력, 비침습적 태아 심초음파를 통해 식별할 수 있습니다(그림 1).
중격 결손: 가장 흔한 CHD는 심실 중격 결손(VSD), 방실 중격 결손(AVSD) 및 심방 중격 결손(ASD)1과 같은 중격 결손입니다. VSD 또는 AVSD는 2D 이미지와 컬러 플로우 이미지를 사용하여 쉽게 시각화할 수 있습니다. 심실을 가로질러 또는 심방과 심실 사이의 혈류를 쉽게 식별할 수 있습니다(그림 3). ASD는 태아에서 난소 공과 구별하기가 어렵습니다.
유출로 이상 : 그림 3에 표시된 바와 같이, 주 폐동맥의 흐름은 정상 배아에서 상행 대동맥 흐름을 가로 질러 있습니다. 우심실 (DORV)의 이중 출구가있는 배아에서는 우심실에서 발생하는 두 개의 큰 동맥을 볼 수 있습니다. DORV는 VSD (그림 3D)와도 관련이 있으며 색상 흐름을 사용하여 식별 할 수 있습니다. 그러나 배아의 크기가 작기 때문에 DORV는 때때로 대동맥, 폐 폐쇄증 또는 지속적인 동맥 경화 (PTA)의 재정의와 확실하게 구별 할 수 없습니다. PTA에서는 태아 심 초음파에서 하나의 유출로 흐름 만 볼 수 있습니다 (그림 3E). 상세한 아치 구조와 주요 폐동맥은 부검을 사용하여 관찰 할 수 있습니다 (그림 2E, F).
부검은 가슴과 복부의 좌위 상태와 가슴에 대한 심장 위치 (levocardia (그림 2C-E) 또는 dextrocardia)를 신속하게 진단 할 수 있습니다. 유출로 구조와 심방과 심실의 상대적 크기를 쉽게 시각화 할 수 있습니다 (그림 2E, F).
ECM 조직 병리학은 구조적 심장 이상 8,11,12를 평가하기위한 황금 표준 기술입니다. 그것은 배아의 구조에 대한 비교할 수없는 해상도와 세부 사항을 제공합니다. 다른 평면과 뷰를 사용한 3차원 재구성은 대동맥과 심실 사이의 관계(그림 3)와 심실과 심방 사이의 결함을 쉽게 식별할 수 있습니다.
그림 1: 재태 연령을 결정하기 위해 배아의 2D 심초음파 이미지에서 크라운-엉덩이 길이를 측정하는 위치. (A) E11.5, (B) E12.5, (C, D) E13.5-E14.5에서 배아의 2D 심 초음파 이미지. (D) 병에 걸린 배아는 (C) 형제보다 작으며 수종(화살표)이 있는 "흐물흐물한" 모양을 갖는 것으로 나타났습니다. (A-C) 살아있는 배아는 별개의 기관을 보여줍니다. (E) 유출관을 이미지화하기 위해 앞쪽으로 기울어진 관상 동맥 4개 챔버 보기에서 E14.5 심장의 컬러 이미지가 있는 대표적인 VB 모드는 (E') 관상 동맥 보기에서 ECM으로 확인되는 대동맥의 정상적인 관계를 가진 온전한 심실 중격을 보여줍니다. (F) E14.5 심장의 대표적인 시상도는 좌심실 및 우심실 유출로를 보여주며, 이는 상행 대동맥(AO)이 두개골을 가리키고 폐동맥이 후방(척추 쪽)을 가리키며, 이는 (F') 시상도에서 ECM으로 확인됩니다. (G) 좌심실 (LV) 및 우심실 (RV)의 대표 횡단면도, (G ') 횡단면도에서 ECM으로 확인됩니다. (H) ECM에서 심장 기저부의 횡단면도는 뚜렷하고 분리 된 대동맥 판막 (AV)과 폐동맥 판막 (PV)을 보여줍니다. PV는 AV의 앞쪽에 있습니다. (H') 지속성 트룬커스 동맥(PTA)의 대표적인 ECM 횡단면도 이미지는 좌측 경동맥이 영구 트렁커스 동맥으로부터 전방 및 두개골로 발생하는 비분할 지속성 트렁시동맥으로부터 후방으로 발생하는 좌측 폐동맥 및 우폐동맥을 보여준다. 약어 : A : 전방, AO : 대동맥, AV : 대동맥 판막, Cd : 꼬리, Cr : 두개골, DAO : 하행 대동맥, L : 왼쪽, LA : 좌심방, LCA : 왼쪽 경동맥, LPA : 왼쪽 폐동맥, LV : 좌심실, P : 후부, PA : 폐동맥, PTA : 지속성 동맥 경화, R : 오른쪽, RA : 우심방, RPA : 우폐동맥, RV : 우심실. 스케일 바: 0.5 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 심혈관 이상을 관찰하기 위한 부검의 대표 이미지 . (A) 명백한 표현형이 없는 검은색 배경 해부 접시에 고정된 배아. 이미지는 머리, 디지털, 흉강 및 복부의 총 해부학을 보여줍니다. (B) 진피가 강아지에서 제거되어 턱밑 땀샘, 흉곽 및 복부가 드러납니다. (C) 흉곽을 들어 올려 흉선, 심장, 폐 및 횡격막을 포함한 흉강의 전체 해부학을 드러냅니다. (D) 흉곽을 제거한 가슴의 확대 보기. (E) 흉선이 제거되어 큰 혈관과 기관이 드러납니다. (F) 큰 선박의 확대 보기. 약어 : AAO : 상행 대동맥, D : 횡격막, LA : 좌심방, LCA : 왼쪽 경동맥, LSVC : 좌측 상 대정맥, LV : 좌심실, P : 심낭, RA : 우심방, Rb : 갈비뼈, RCA : 우경 동맥, RL : 우폐, RSVC : 우측 상 대정맥, RV : 우심실, S : 흉골, SCA : 우측 쇄골 하 동맥, SMG : 턱밑 땀샘, T : 기관, Th: 흉선. 스케일 바: 1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표적인 태아 심초음파(Echo) 및 episcopic 컨포칼 현미경(ECM)의 이미지. (A) Echo는 E14.5-15.5 단계에서 (A') ECM으로 확인된 정상 대조군에서 심실 션트 및 정상 관련 대동맥이 없는 온전한 심실 중격을 보여줍니다. (B) 방실 중격 결손 (AVSD)의 초음파 검출. 4-챔버 보기의 에코 이미징은 E14.5 단계에서 (B') ECM으로 확인된 LA, RA, LV 및 RV 간의 통신을 보여줍니다. (C) 색 흐름이있는 심실 중격 결손 (VSD)의 초음파 진단은 E16.5 단계에서 (C ') ECM으로 확인 된 LV 및 RV를 가로 지르는 흐름을 보여줍니다. (D) 에코 및 (D') ECM은 E14.5 단계에서 나란히 있는 대동맥(대동맥이 폐동맥 바로 맞음)이 있는 LV와 RV 사이의 VSD가 있는 DORV를 보여줍니다. (E) 지속적인 동맥 트룬 쿠스 (PTA)의 초음파 진단은 LV와 RV 사이의 통신을 두 심실 (PTA)보다 우선하는 단일 유출로와 함께 보여줍니다. (E') 이 병리는 E14.5 단계에서 ECM에 의해 확인됩니다. 스케일 바 : 0.5 mm. AO : 대동맥, AVSD : 방실 중격 결손, Cd : 꼬리, Cr : 두개골, L : 왼쪽, LA : 좌심방, LV : 좌심실, PA : 폐동맥, PTA : 지속적인 동맥 경화, R : 오른쪽, RA : 우심방, RV : 우심실, VSD : 심실 중격 결손. 스케일 바: 0.5 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 무대 | 크라운에서 엉덩이까지의 길이 (mm) | 태아 영역 (mm2) | 심장 부위 (mm2) | 심장 부위/태아 부위 |
| E12.5 | 7.9 ± 0.8 (n = 77) | 23.2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13.5 | 10.5 ± 0.9 (n = 92) | 40.9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14.5 | 12.5 ± 0.9 (n = 101) | 57.6 ± 8 (n = 101) | 2.9 ± 0.5 (n = 70) | 0.050 ± 0.004 (n = 70) |
| E15.5 | 14.1 ± 0.5 (n = 134) | 71.4 ± 6 (n = 134) | 3.8 ± 0.4 (n = 87) | 0.053 ± 0.004 (n = 87) |
| E16.5 | 15.4 ± 0.6 (n = 112) | 82.7 ± 6 (n = 112) | 4.9 ± 0.5 (n = 87) | 0.058 ± 0.007 (n = 87) |
| E17.5 | 16.6 ± 0.4 (n = 211) | 96.9 ± 7 (n = 211) | 6.1 ± 0.6 (n = 146) | 0.063 ± 0.004 (n = 146) |
| E18.5 | 17.7 ± 0.6 (n = 139) | 112.1 ± 8 (n = 139) | 7.1 ± 0.8 (n = 93) | 0.063 ± 0.005 (n = 93) |
| E19.5 | 18.7 ± 0.7 (n = 57) | 126.7 ± 8 (n = 57) | 7.7 ± 0.7 (n = 36) | 0.062 ± 0.005 (n = 36) |
표 1 : 태아 성장의 발달 프로파일.
| E14.5 | E16.5 | E18.5 | 신생아 | |
| 70% 에탄올 | 1시간 | 1.5 시간 | 3시간 | 4시간 |
| 95% 에탄올 | 35 분 | 45 분 | 1시간 | 1시간 |
| 95% 에탄올 | 35 분 | 45 분 | 1시간 | 1시간 |
| 100% 에탄올 | 15 분 | 15 분 | 30 분 | 6 분 |
| 크실렌 1 | 20 분 | 30 분 | 40 분 | 30 분 |
| 크실렌 2 | 20 분 | 30 분 | 40 분 | 30 분 |
| 왁스 1 | 20 분 | 20 분 | 20 분 | 30 분 |
| 왁스 2 | 20 분 | 20 분 | 20 분 | 30 분 |
| 왁스 3 | 밤새 | 밤새 | 밤새 | 밤새 |
표 2: 배아 일수를 기준으로 한 배아 임베딩 프로토콜.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
유전자 변형 마우스는 선천성 심장 결함의 병리 메커니즘을 이해하는 데 사용되었습니다. 이 연구에서 우리가 제공하는 프로토콜은 쥐 태아 심장 결함을 평가하는 과정을 간소화하고 표준화하려고 시도합니다. 그러나 프로토콜 중에 주의해야 할 중요한 단계가 있습니다. 마우스 배아는 임신 기간 동안 크게 자라며 태아 심 초음파를 정확하게 수행하여 마우스를 수확하는 정확한 시간을 결정할 수 있습니다. 태아 심초음파는 태아 심혈관 병리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 2D 이미지를 사용하면 컬러 도플러의 도움으로 혈류를 검사하고 심장의 챔버 또는 비정상적인 유출 및 유입로 간의 통신을 감지하여 비정상적인 해부학 및 심장 기능을 식별 할 수 있습니다. CHD 진단을 결정하기 위해 태아는 유출로 중격 및 심장 챔버 형성이 완료된 배아 일 E14.5부터 스캔됩니다. 초기 단계의 스캔은 발달 지연을 반영 할 수 있습니다.
조직 병리학은 마이크로톰과 광학 현미경 시각화를 사용하여 CHD8을 특성화하는 표준입니다. 표준 방법의 주요 단점은 진단을 위한 심혈관 구조의 직관적인 3D 디스플레이가 부족하고 샘플에 대한 다양한 보기를 제공하지 않는다는 한계입니다. ECM 조직학은 심장 결함을 특성화하는 가장 시간 효율적인 방법입니다. ECM을 사용할 수 없는 경우 마이크로톰을 사용하여 배아를 절편하고 심장 표현형을 결정할 수 있습니다. 심장 영상을 얻기 위한 다른 옵션은 고처리량, 고해상도 자기 공명 영상(MRI) 또는 컴퓨터 단층 촬영(CT)을 수행하는 것입니다. MRI 또는 CT의 한 가지 주요 측면은 여러 배아를 동시에 이미지화할 수 있다는 것입니다. 그러나 초음파, CT 또는 MRI 표현형 검사 후에도 CHD 진단을 확인하려면 조직 병리학이 필요합니다.
조직병리학을 위한 ECM 이미징을 사용하여, 배아는 자동 슬라이딩 마이크로톰 위에 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 각 절단 후 직렬로 이미징됩니다. ECM으로부터 수집된 개별 이미지들은 후속 3D 재구성을 허용하고, 이미지들을 다시 촬영하지 않고도 임의의 이미징 평면에서 샘플들을 디지털 방식으로 리슬라이스할 수 있게 한다(8,11). 이러한 수술은 다양한 발달 단계에서 사용될 수있는 심장 해부학에 대한 포괄적 인 평가를 가능하게합니다. 또한 ECM 장비에서 데이터를 수집하는 동안 마이크로톰에서 개별 슬라이드를 복구할 수 있습니다. ECM 조직병리학은 구조적 심장 이상을 평가하기 위한 황금 표준이지만 장비, 소프트웨어 및 배아당 실행 시간의 가용성에는 한계가 있습니다. 배아 심장을 절개하는 실행 시간은 크기에 따라 샘플 당 1-3 시간까지 다양합니다. 장비의 복잡성으로 인해 연구원은 정기적으로 컴퓨터를 확인하여 현장 내부의 관심 영역이 기록되고 있는지 확인해야합니다. 연구원은 또한 파라핀 왁스 부스러기가 레이저 스캐너에서 샘플을 방해하지 않도록 샘플을 확인해야 합니다.
ECM 및 후속 3D 재구성은 표본의 임베딩 계획에 관계없이 구조적 심장 결함에 대한 완전한 고해상도 평가를 제공합니다. 이러한 프로토콜은 다양한 CHD를 성공적으로 진단하는 데 도움이 되었으며 쥐 모델 및 유전적 돌연변이와 관련된 병리에서 심장 배아 발생을 이해할 수 있게 해주었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이 원고에 대한 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
