Summary
Dit artikel beschrijft de diagnostische methoden voor congenitale hartziekten (CHD) met behulp van foetale echocardiografie, obductie en episcopische fluorescentiebeeldopname (EFIC) met behulp van episcopische confocale microscopie (ECM) gevolgd door driedimensionale (3D) reconstructie.
Abstract
Aangeboren hartziekten (CHD's) zijn belangrijke oorzaken van kindersterfte in de Verenigde Staten. In de jaren 1980 en eerder stierven de meeste patiënten met matige of ernstige CHD vóór de volwassenheid, met de maximale mortaliteit tijdens de eerste levensweek. Opmerkelijke vooruitgang in chirurgische technieken, diagnostische benaderingen en medisch management hebben geleid tot duidelijke verbeteringen in de resultaten. Om tegemoet te komen aan de kritische onderzoeksbehoeften van het begrijpen van aangeboren hartafwijkingen, hebben muizenmodellen een ideaal onderzoeksplatform geboden, omdat ze zeer vergelijkbare hartanatomie hebben als mensen en korte zwangerschapspercentages. De combinatie van genetische manipulatie met high-throughput fenotyperingstools heeft de replicatie en diagnose van structurele hartafwijkingen mogelijk gemaakt om de moleculaire routes achter CHD's verder op te helderen. Het gebruik van niet-invasieve foetale echocardiografie om de cardiale fenotypes in muismodellen te screenen in combinatie met de high fidelity van Episcopic fluorescence image capture (EFIC) met behulp van Episcopische confocale microscopie (ECM) histopathologie met driedimensionale (3D) reconstructies maakt een gedetailleerd inzicht in de anatomie van verschillende aangeboren hartafwijkingen mogelijk. Dit protocol schetst een complete workflow van deze methoden om een nauwkeurige diagnose van muizen aangeboren hartafwijkingen te verkrijgen. Het toepassen van dit fenotyperingsprotocol op modelorganismen zal een nauwkeurige CHD-diagnose mogelijk maken, wat inzicht oplevert in de mechanismen van CHD. Het identificeren van de onderliggende mechanismen van CHD biedt kansen voor potentiële therapieën en interventies.
Introduction
Aangeboren hartziekten (CHD's) zijn de meest voorkomende neonatale geboorteafwijking 1,2, die ongeveer 0,8% -1,7% van de pasgeborenen treft en resulteert in significante neonatale mortaliteit en morbiditeit3. Een genetische etiologie is sterk geïndiceerd met CHD's 4,5. Genetisch gemodificeerde muismodellen zijn op grote schaal gebruikt om de complexiteit van CHD's en de mechanismen die ze veroorzaken te begrijpen als gevolg van het feit dat de muizen harten met vier kamers en vergelijkbare cardiale ontwikkelings-DNA-sequenties hebben bij muizen en menselijke foetussen6. Het identificeren van het fenotype van de muismutanten is de fundamentele eerste stap in het karakteriseren van de functie van het beoogde gen. Muismodellen die gendoseringseffecten tot expressie brengen, waarbij een enkele genetische mutatie kan resulteren in een spectrum van hartafwijkingen die menselijke CHD's nabootsen, zijn belangrijk voor het begrijpen van de complexiteit van CHD's en de mechanismen die ze veroorzaken.
Dit artikel schetst een pijplijn om cardiale fenotypen in muismodellen te karakteriseren. De toegepaste methoden maken gebruik van foetaal echocardiogram7, gevolgd door obductie en ECM-histopathologie 7,8, die de gedetailleerde anatomie van het ontwikkelen van muizenhartfenotypen kan weergeven. Een foetaal echocardiogram is een niet-invasieve modaliteit die directe visualisatie van meerdere embryo's met een redelijke beeldresolutie mogelijk maakt. Bovendien biedt een foetaal echocardiogram een snelle bepaling van het totale aantal embryo's in een nest, hun ontwikkelingsstadia en de relatieve oriëntatie en locatie in de baarmoederhoorn. Met behulp van een spectrale Doppler/kleurstroom kunnen abnormale embryo's worden geïdentificeerd op basis van de structuur, de hemodynamische verstoring, de groeibeperking of de ontwikkeling van hydrops. Aangezien een foetaal echocardiogramonderzoek een niet-invasieve techniek is, kan het worden gebruikt om op meerdere dagen te scannen en om de veranderingen in hemodynamiek of cardiale morfologie te observeren. Het verkrijgen van hoogwaardige beeldvorming van foetale echocardiogrammen vereist oefening en vaardigheid, omdat specifieke hartafwijkingen kunnen worden gemist vanwege een gebrek aan ervaring en kennis. Hierdoor kan een meer definitieve analyse van cardiale morfologie worden verkregen door een combinatie van obductie en ECM-histopathologie. Obductie biedt directe visualisatie van de boogstructuur, de relatieve relaties van de aorta en longslagader, de grootte van de ventrikels en boezems, de positie van het hart ten opzichte van de borst en de bronchopulmonale structuren. Interieurkenmerken zoals de hartkleppen en wanddikte kunnen echter moeilijk te beoordelen zijn door obductie alleen. Ecm-histopathologie wordt dus aanbevolen voor een sluitende diagnose. ECM-histopathologie is een visualisatietechniek met hoge resolutie die zowel 2D- als 3D-reconstructie van de beeldstapel9 mogelijk maakt. Deze beelden worden verkregen door middel van seriële episcopische fluorescerende beeldvorming van een paraffine-ingebed monster, omdat het met een consistent interval dun wordt doorsneden door een automatische microtoom. In tegenstelling tot de klassieke histologie worden afbeeldingen vastgelegd als een sectie voordat deze uit het blok wordt gesneden, zodat alle afbeeldingen binnen hetzelfde referentiekader worden vastgelegd. Hierdoor kan de 2D-beeldstapel geproduceerd door ECM histopathologie eenvoudig en betrouwbaar worden gereconstrueerd in drie dimensies. Dit wordt gedaan met behulp van een DICOM-viewer, die 3D-visualisatie van de beelden in de drie anatomische vlakken mogelijk maakt: coronaal, sagittale en transversale. Uit deze hoge resolutie 3D reconstructies kan een definitieve hartdiagnose worden gesteld. De toepassing van deze drie verschillende visualisatiemodaliteiten, individueel of in combinatie, kan nauwkeurige karakteriseringen van structurele hartafwijkingen in muizenembryo's opleveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van muizen voor deze studies is noodzakelijk omdat muizen harten met vier kamers hebben die menselijke CHD's kunnen nabootsen. Muizen kregen veterinaire zorg en werden ondergebracht in de association for assessment and accreditation of laboratory animal care (AAALAC) -geaccrediteerde dierenverzorgingsfaciliteit van de instelling. Strikte protocollen werden gevolgd om het ongemak, de stress, de pijn en het letsel van de muizen te minimaliseren. Muizen werden geëuthanaseerd met behulp van CO2-gas , wat acceptabel is voor kleine knaagdieren volgens de Richtlijnen van de American Veterinary Medical Association over euthanasie. De studies op muizen in dit manuscript werden uitgevoerd met een goedgekeurd IACUC-protocol aan de Universiteit van Pittsburgh.
1. Foetaal echocardiogram
OPMERKING: Een echocardiogram is een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van cardiovasculaire misvorming en extracardiale defecten bij muizen. Vanwege de kleine omvang van de muizenembryo's (ongeveer 1-2 mm bij het middenstation, 3,5 mm bij de geboorte), is ultrahoogfrequente echocardiografische apparatuur met ultrasone biomicroscopie (UBM) vereist. UBM biedt verschillende hoogfrequente (30-50 MHz) sondes met een klein beeldvenster (15 mm x 14 mm) dat de resolutie biedt (30 μm axiale x 68 μm lateraal) om één muisfoetus tegelijk te visualiseren. Een 40 MHz transducer biedt beelden met een hoge resolutie om cardiovasculaire fenotypen7 te identificeren.
- Schakel de echocardiogrammachine in en selecteer het programma Cardiologie.
OPMERKING: Het volgende protocol kan worden gebruikt voor elke muisachtergrond van embryonale dag (E) 14,5 tot 19,5. - Verdoof de gewenste muis in een anesthesie-inductiekamer. Induceer anesthesie met behulp van een concentratie van 4% isofluraan en medische zuurstof bij een stroomsnelheid van 1 L / min en verminder deze tot 2% -3% voor onderhoud.
- Plaats de muis snel op het beeldverwerkingsplatform. Het beeldvormingsplatform heeft verwarmd staal om de muis warm te houden tijdens de procedure. Plaats de mond en neus van de muis in de verdovingsneuskegel. Bevestig de ledematen met tape om beweging te voorkomen. Controleer de hartslag om ervoor te zorgen dat deze tussen de 400-450 bpm blijft.
- Controleer de temperatuur met behulp van een rectale thermometersonde en zorg ervoor dat deze rust op 37 °C ± 0,5 °C. Controleer de ademhaling om hypoxie te voorkomen. Houd een zachte kracht op de sonde om schade te voorkomen.
OPMERKING: Een warmtelamp kan boven de muis worden geplaatst om onderkoeling te voorkomen terwijl u onder bent en om te herstellen van anesthesie. Vaseline oftalmische zalf kan worden gebruikt als glijmiddel om droge ogen te voorkomen. - Verwijder de vacht van de thorax en de buik met ontharingscrème. Breng de crème aan en wacht 3 minuten voordat u deze verwijdert. Reinig het gebied met 70% ethanol. Ethanol werkt beter dan water als scheersmeermiddel.
- Warm ultrasone gel op tot een normale lichaamstemperatuur. Breng de ultrasone gel royaal aan en plaats de transducer op de buik om deze in een horizontaal vlak te oriënteren en de blaas op het scherm te identificeren. Zodra de blaas is geïdentificeerd, scant u craniaal uit de blaas en zoekt u naar de foetus. Meet de lengte van kroon tot romp om de zwangerschapsduurvan 10 jaar te bepalen (figuur 1 en tabel 1).
OPMERKING: Verander de posities van de transducer om verschillende vlakken te visualiseren, waaronder de transversale vierkamer-, sagittale en frontale /coronale beeldvormingsvlakken7 (figuur 1). - Gebruik de kleur Doppler om de bloedstroom uit het hart te analyseren.
- Plaats de muis terug in de kooi als de embryo's het beoogde stadium niet hebben bereikt. Bereid anders de muis voor op de oogst.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de muis al wakker is en goed herstelt van de anesthesie voordat u hem terug in de kooi plaatst. - Schakel isofluraan en zuurstof uit, reinig het werkgebied en schakel de machine uit.
OPMERKING: Het is belangrijk om de gel uit de transducer te verwijderen.
2. Obductie
OPMERKING: Zodra abnormale cardiale fenotypen worden vermoed met behulp van foetale echocardiografie, worden foetussen verzameld en gefixeerd via volledige lichaamsdompeling in de fixatieve oplossing: ofwel 10% gebufferd formalinefosfaat of 4% paraformaldehyde (PFA). Inspecteer de externe en interne morfologie van het monster, op zoek naar macroscopische anatomische afwijkingen of misvormingen.
- Bereid de muis voor.
- Als de muis volwassen is, euthanaseer de muis dan met behulp van een standaard CO2-protocol . Gebruik een tang of ontleedschaar om incisies (ongeveer 3 cm) in de laterale thorax en buik te maken om penetratie van het fixatief in de inwendige organen mogelijk te maken.
OPMERKING: Het monster moet gedurende ten minste 24 uur vóór obductie worden gefixeerd als het embryo ouder is dan E14.5.
- Als de muis volwassen is, euthanaseer de muis dan met behulp van een standaard CO2-protocol . Gebruik een tang of ontleedschaar om incisies (ongeveer 3 cm) in de laterale thorax en buik te maken om penetratie van het fixatief in de inwendige organen mogelijk te maken.
- Analyseer de buitenkant van het lichaam.
- Stel de software in om de foto's op te slaan met een naam, inclusief de identificatie van het monster, de microscoopvergroting en de inhoud van de afbeelding.
OPMERKING: Vergroting van 1,0x tot 3,2x zou voldoende moeten zijn voor het in beeld brengen van de meeste structuren bij E14.5-muizen of ouder. - Plaats de muis op de plaat onder de stereomicroscooplens. Vul de plaat met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om het monster volledig te bedekken om uitdroging en reflectie op de foto's te voorkomen. Pas de vergroting aan zodat het scherm het hele embryo bevat en maak vervolgens een foto van zowel de linker- als rechterkant van het embryo.
OPMERKING: De bodem van de plaat moet worden gecoat met paraffine, silicium of een ander dergelijk substraat om het pinnen te vergemakkelijken. - Prik het monster door zijn keel, naar boven gericht, en maak nog een foto.
OPMERKING: Richt de pin iets naar boven om ervoor te zorgen dat er geen belangrijke structuren van de thoracale holte worden doorboord.
- Stel de software in om de foto's op te slaan met een naam, inclusief de identificatie van het monster, de microscoopvergroting en de inhoud van de afbeelding.
- Analyseer de borstkas.
- Terwijl u de huid in het midden van de nek met een tang optilt, snijdt u de huid met de schaar naar beide oksels voordat u de huid langs de middenas naar de staart snijdt. Snijd vervolgens de huid van de navel naar de benen. Speld het monster door zijn polsen en enkels.
OPMERKING: Wees voorzichtig om alleen de huid te snijden. Het wordt aanbevolen om de messen van de schaar horizontaal of schuin naar boven te houden. - Om het bindweefsel af te breken, til je de huid op met één tang terwijl je het onderliggende weefsel op zijn plaats houdt met het andere paar. Prik het monster door de huid om de borst en de buik bloot te leggen (figuur 2).
OPMERKING: Te veel uitrekken tijdens het pinnen, snijden of schrapen kan leiden tot weefselschade. - Maak een foto van de blootgestelde spieren en schraap vervolgens voorzichtig de spieren weg om de ribben bloot te leggen.
- Maak een foto van de blootgestelde ribben. Scheid de ribben van het middenrif en snijd de ribben aan beide zijden zo ver mogelijk op de laterale as naar de nek.
- Leg het hart bloot door de gesneden ribben te verwijderen. Maak een foto van het hart.
- Verwijder de thymus door deze af te pellen met één tang. Gebruik de andere tang om de basis van de thymus te stabiliseren om te voorkomen dat onderliggende bloedvaten scheuren. Maak foto's van het hart en de grote vaten.
OPMERKING: Het gebruik van pinnen om sommige aangrenzende structuren uit te rekken, kan helpen om betere beeldweergaven te krijgen. Maak bovendien afzonderlijke foto's gericht op de grote slagaders, het hart en andere interessante structuren, omdat ze mogelijk niet samen scherp zijn.
- Terwijl u de huid in het midden van de nek met een tang optilt, snijdt u de huid met de schaar naar beide oksels voordat u de huid langs de middenas naar de staart snijdt. Snijd vervolgens de huid van de navel naar de benen. Speld het monster door zijn polsen en enkels.
- Analyseer de buik.
- Trek aan het diafragma om het te verwijderen en de lever bloot te leggen. Maak een foto.
- Pin de lever terug om de maag en alvleesklier bloot te leggen. Maak een foto.
- Snijd de slokdarm door. Verwijder de dikke darm en de darmen door ze eruit te trekken met een tang. Snijd net boven de lever en verwijder het om de nieren en bijnieren te onthullen. Maak een foto.
OPMERKING: De verwijderde organen moeten in de fixatieve oplossing worden bewaard.
- Isoleer de thorax voor de ECM-analyse.
- Snijd de onderste thorax langs een rechte lijn tussen de lever en de longen. Snijd de kop hoog genoeg af om de vertakkingen van de halsslagaders niet af te snijden.
- Verwijder voorzichtig de laterale ribben met behoud van de dorsale ribben en de wervelkolom. Pel en schraap het dorsale vet weg.
- Maak de thorax los van de rest van het lichaam en plaats deze in een 10% gebufferde formalinefosfaatoplossing.
3. Inbedding
- Decanteer het fixatief in een geschikte fles voor gevaarlijk afval. Was de monsters drie keer met 1x PBS gedurende 15 minuten.
- Gebruik toenemende concentraties ethanol en xyleen om de monsters uit te drogen. De duur van alle volgende stappen hangt af van het stadium van de embryo's. Raadpleeg tabel 2 voor meer informatie.
OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het wisselen van oplossingen om beschadiging van de monsters te voorkomen. De optimale parameters voor monsterverwerking kunnen empirisch worden aangepast. Xyleen lost bepaalde kunststoffen op; glazen instrumenten en containers moeten worden gebruikt. - Vervang xyleen door paraffine voor de gewenste duur. Laat de flessen gedurende de juiste duur in een incubator van 65 °C staan (tabel 2).
- Gebruik verse paraffine om de monsters in de gewenste positie in te bedden.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het monster in het midden van het paraffineblok te richten, met de dorsale kant naar de bovenkant en de achterste kant naar de voorkant van het blok. Houd er bij het oriënteren van het monster rekening mee dat het monster is ingebed met het blok ondersteboven gericht.
4. Episcopische confocale microscopie (ECM)
OPMERKING: Na de juiste inbedding ondergaan embryo's collectie collectief via ECM voor histopathologische analyse. Individuele dia's kunnen worden hersteld van de microtoom voor verder onderzoek.
- Haal het paraffineblok uit de vriezer -20 °C en verwijder de metalen mallen.
- Gebruik een scheermesje om de was aan de randen en de achterkant van de cassette bij te snijden. Snijd de was rond het monster totdat deze is ingepakt in een klein vierkantje was dat aan de cassette is bevestigd.
OPMERKING: Wees uiterst voorzichtig bij het hanteren van messen. - Gebruik de metalen hendel om het paraffineblok tegen de snijfase van de microtoom te klemmen. Selecteer de MAN (handmatige) functie in de run-modus, verhoog het oppervlak van de paraffine dicht bij het blad en voer een paar dia's uit om ervoor te zorgen dat het blad contact maakt met het paraffineblok.
- Open de toepassing LAS AF en selecteer MatrixScreener. Selecteer Enkele reguliere matrix en laad de juiste eerder opgeslagen sjabloon. Klik op de Quick LUT knop om over te schakelen naar witte en oranje ombre.
- Selecteer Taken instellen en sleep de zichtbare laser van 405 nm naar het maximum. Stem de linkerrand van het spectrumblok af op de 405 nm-lijn en sleep de rechterrand naar de 800 nm-lijn. Markeer de optie Pinhole en start de Live view.
- Pas de positie van de laserprojectie aan om het monster op het scherm te centreren en stel de zoomknop in op ~ 20x. Om de resolutie te optimaliseren, stelt u de versterking in op 1.250 V en maximaliseert u het blauwe gebied met behulp van de scherpstelknop; stel vervolgens de versterking opnieuw in op ongeveer 750 V voor beeldvorming.
OPMERKING: Specifieke waarden kunnen variëren afhankelijk van de toestand van het embryo. - Schakel de snijmethode in op Automatisch, stel de dikte in op ongeveer 50 μm en voer de dia's uit. Stop met snijden wanneer de longen en luchtwegen in zicht zijn.
- Kies een snijdikte tussen 8-10 μm en stop de liveweergave . Open Microtome Communicator om de beeldvorming te starten. Zorg ervoor dat de tijdelijke opslagmap leeg is voordat u afbeeldingen verzamelt.
- Stop met snijden wanneer er geen extra hartstructuur wordt gevisualiseerd. Sluit de toepassing Microtome Communicator en exporteer het tijdelijke bestand naar één .tiff beeldreeks via de beeldverwerkingssoftware voor 3D-reconstructies later.
5. Driedimensionale (3D) reconstructie
OPMERKING: Het doel van 3D-reconstructie is om een 2D-beeldstapel van ECM-beeldvorming te verwerken tot 3D-video's in de coronale, sagittale en transversale oriëntaties en om de 3D-video's te gebruiken voor de diagnose van de structurele en anatomische afwijkingen in de monsters.
- Open de ECM-afbeeldingsstapel in de beeldverwerkingssoftware.
- Sleep de afbeelding van de bestanden naar de beeldverwerkingssoftware. Draai de ECM-afbeeldingen horizontaal door Afbeelding > Transformeren > Horizontaal spiegelen in de menubalk te selecteren.
- Sla de omgedraaide afbeelding op en sluit de beeldverwerkingssoftware.
- Importeer de ECM-afbeeldingsstapel in de DICOM-weergavesoftware.
- Sleep de horizontaal omgedraaide ECM-afbeeldingen naar de DICOM-weergavesoftware. Zorg ervoor dat er een lichtblauwe rand rond de voorbeeldlijst staat, anders kunnen afbeeldingen worden toegevoegd aan een bestaande voorbeeldmap.
- Selecteer de koppelingen of de bestanden die u naar de database wilt kopiëren wanneer het pop-upvenster verschijnt. Er verschijnt een nieuw voorbeeld in de voorbeeldlijst met dezelfde naam als het bestand dat naar de DICOM-weergavesoftware is gekopieerd.
- Klik op het nieuw toegevoegde bestand om het te openen.
- Voer een 3D-reconstructie uit.
- Zodra het bestand is geopend, klikt u op het menu 2D / 3D Reconstruction Tools op de werkbalk en selecteert u 3D MPR.
- Voor Pixel X-resolutie en Pixel Y-resolutie voert u de afbeeldingsresolutie in door de zoom te geven die wordt gebruikt tijdens ECM-beeldvorming. Voer voor het segmentinterval de segmentdikte in die wordt gebruikt om te snijden tijdens ECM-beeldvorming.
OPMERKING: De cameraresolutie verandert afhankelijk van de zoom van de camera en kan van camera tot camera verschillen.
- Gebruik de verschillende gereedschappen op het tabblad Extra aan de linkerkant om afbeeldingsstapels naar wens aan te passen.
- Gebruik het gereedschap WW/WL om vensterbreedte en vensterniveau aan te passen. Klik en sleep het gereedschap op de afbeelding omhoog om de helderheid van de afbeelding te verlagen en naar beneden om het te verhogen. Klik en sleep het gereedschap op de afbeelding naar rechts om het afbeeldingscontrast te verlagen en naar links om het te vergroten.
OPMERKING: De optimale WW/WL-instellingen voor de ene structuur kunnen suboptimaal zijn voor een andere structuur. Om deze reden wordt het maken van afzonderlijke video's om verschillende structuren te bekijken aanbevolen. - Gebruik het gereedschap Pannen om de afbeeldingen naar de gewenste posities te slepen. Gebruik het gereedschap Zoomen om de afbeelding naar wens te vergroten of te verkleinen en het gereedschap Roteren om de afbeelding naar wens te roteren.
OPMERKING: Het vergroten van afbeeldingen kan leiden tot een verminderde beeldkwaliteit. Wees voorzichtig bij het roteren van afbeeldingen, omdat dit ertoe kan leiden dat de assen omdraaien.
- Gebruik het gereedschap WW/WL om vensterbreedte en vensterniveau aan te passen. Klik en sleep het gereedschap op de afbeelding omhoog om de helderheid van de afbeelding te verlagen en naar beneden om het te verhogen. Klik en sleep het gereedschap op de afbeelding naar rechts om het afbeeldingscontrast te verlagen en naar links om het te vergroten.
- Klik en sleep de gekleurde as van het eerste deelvenster. Merk op hoe het draaien van deze as de oriëntatie van de andere twee panelen verandert. Draai de assen van de drie panelen totdat de drie panelen coronale, sagittale en dwarse weergaven van het monster vertegenwoordigen.
OPMERKING: Houd tijdens het heroriënteren van de monsters de juiste anterieure/ posterieure oriëntatie aan. - Genereer video's.
- Zodra alle drie de panelen correct zijn gepositioneerd, georiënteerd en verlicht, klikt u op het paneel dat de coronale weergave vertegenwoordigt.
- Klik op Filmexport aan de rechterkant van de menubalk. Klik op Batch en sleep de schuifregelaars Van en Naar om de hele interesseregio te omvatten. Selecteer bij Interval de optie Hetzelfde als dikte . Sla de video op die de richting van de weergave aangeeft.
- Bekijk de video om te zien of de interessante structuren adequaat kunnen worden geïdentificeerd. Als dit niet het geval is, gebruikt u de tools (stap 5.4) om de video's zo nodig aan te passen en de video opnieuw op te slaan.
- Herhaal stap 5.6 voor dwars- en sagittale weergaven. Diagnosticeer de monsters met behulp van gereconstrueerde video's.
OPMERKING: Bekijk de video's in elke richting zorgvuldig om een volledige beoordeling te maken of het monster anatomische afwijkingen of ziektefenotypen vertoont (figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De muizenembryo's met significante hemodynamische defecten bleken embryonaal dodelijk te zijn. Een grote verscheidenheid aan CHD's kan worden geïdentificeerd door middel van het hoge output, niet-invasieve foetale echocardiogram met behulp van verschillende weergaven (figuur 1).
Septumdefecten: De meest voorkomende CHD's zijn septumdefecten zoals een ventrikelseptumdefect (VSD), een atrioventriculaire septumdefect (AVSD) en een atriumseptumdefect (ASS)1. VSD of AVSD kan eenvoudig worden gevisualiseerd met behulp van 2D-afbeeldingen en kleurenstroomafbeeldingen. De bloedstroom over de ventrikels of tussen de boezems en de ventrikels kan gemakkelijk worden geïdentificeerd (figuur 3). ASS is moeilijk te onderscheiden met patent foramen ovale bij een foetus.
Anomalieën van het uitstroomkanaal: Zoals te zien is in figuur 3, is de stroom in de hoofdlongslagader over de opgaande aortastroom in normale embryo's. Bij embryo's met een dubbele uitlaat van de rechter ventrikel (DORV) zijn beide grote slagaders te zien die voortkomen uit de rechter ventrikel. DORV wordt ook geassocieerd met VSD (Figuur 3D) en kan worden geïdentificeerd met behulp van kleurstroom. Gezien de kleine omvang van de embryo's kan DORV echter soms niet betrouwbaar worden onderscheiden van het overschrijven van de aorta, pulmonale atresie of persistente truncus arteriosus (PTA). Bij PTA is slechts één uitstroomkanaalstroom te zien op het foetale echocardiogram (figuur 3E). De gedetailleerde boogstructuur en de belangrijkste longslagader kunnen worden waargenomen met behulp van obductie (figuur 2E, F).
Obductie kan snel de situsstatus in de borst en buik en de hartpositie ten opzichte van de borstkas diagnosticeren (levocardie (figuur 2C-E) of dextrocardie). Uitstroomkanaalstructuren en de relatieve grootte van zowel boezems als ventrikels kunnen eenvoudig worden gevisualiseerd (figuur 2E, F).
ECM-histopathologie is de gouden standaardtechniek voor het beoordelen van een structurele hartafwijking 8,11,12. Het biedt een ongeëvenaarde resolutie en detail aan de structuren van embryo's. Driedimensionale reconstructie met behulp van verschillende vlakken en weergaven kan gemakkelijk de relatie tussen de grote slagaders en ventrikels identificeren (figuur 3) en het defect tussen de ventrikels en boezems.
Figuur 1: De locaties voor het meten van de kroon-romplengte in 2D-echocardiogrambeelden van embryo's om de zwangerschapsduur te bepalen. 2D-echocardiogrambeelden van embryo's bij (A) E11.5, (B) E12.5, (C,D) E13.5-E14.5. (D) Het zieke embryo is kleiner dan zijn (C) broer of zus en er wordt opgemerkt dat het een "papperig" uiterlijk heeft met hydrops (pijl). (A-C) Levende embryo's vertonen verschillende organen. Representatieve VB-modus met kleurenbeelden van E14.5 hart in een coronaal 4-kamerbeeld anterieur gekanteld om de (E) uitstroomkanalen in beeld te brengen, tonen intact ventrikelseptum met de normale relatie van grote slagaders, wat wordt bevestigd met ECM in de (E') coronale weergave. (F) Representatieve sagittale weergave van E14.5-hart toont de linkerventrikel- en rechterventrikeluitstroomkanalen met de opgaande aorta (AO) craniaal gericht en de longslagader naar achteren gericht (naar de wervelkolom), wat wordt bevestigd met ECM in de (F') sagittale weergave. (G) Representatieve dwarsaanzichten van de linker ventrikel (LV) en rechter ventrikel (RV), die wordt bevestigd met ECM in de (G') transversale weergave. (H) Een dwarsbeeld aan de basis van het hart in ECU toont een afzonderlijke en gescheiden aortaklep (AV) en longklep (PV). PV is anterieur aan AV. (H') Representatief ECM transversaal beeld van persistente truncus arteriosus (PTA) toont de linker longslagader en rechter longslagader die posterief ontstaan uit de ongedeelde persistente truncale slagader, waarbij de linker halsslagader anterieur en craniaal ontstaat uit de persistente truncale slagader. Afkortingen: A: anterior, AO: aorta, AV: aortaklep, Cd: caudal, Cr: craniaal, DAO: dalende aorta, L: links, LA: linker atrium, LCA: linker halsslagader, LPA: linker longslagader, LV: linker ventrikel, P: posterior, PA: longslagader, PTA: persistent truncus arteriosus, R: rechts, RA: rechter atrium, RPA: rechter longslagader, RV: rechter ventrikel. Schaalbalk: 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van een obductie om cardiovasculaire afwijkingen waar te nemen. (A) Een embryo vastgepind op een ontledende schaal met zwarte achtergrond zonder duidelijke fenotypen. De afbeelding toont de grove anatomie van het hoofd, digitals, borstholte en buik. (B) De dermis wordt uit de pup verwijderd, waardoor submandibulaire klieren, ribbenkast en buik worden onthuld. (C) De ribbenkast wordt opgeheven en onthult de grove anatomie van de borstholte, inclusief de thymus, het hart, de longen en het middenrif. (D) Een ingezoomd beeld van de borstkas met de ribbenkast verwijderd. (E) De thymus wordt verwijderd, waardoor grote bloedvaten en luchtpijpen zichtbaar worden. (F) Een ingezoomd beeld van grote schepen. Afkortingen: AAO: opgaande aorta, D: diafragma, LA: linker atrium, LCA: linker halsslagader, LSVC: linker superieure vena cava, LV: linker ventrikel, P: pericardium, RA: rechter atrium, Rb: ribben, RCA: rechter halsslagader, RL: rechter long, RSVC: rechter superieure vena cava, RV: rechter ventrikel, S: borstbeen, SCA: rechter subclavia arterie, SMG: submandibulaire klieren, T: trachea, Th: thymus. Schaalbalk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatief foetaal echocardiogram (Echo) en beelden van episcopische confocale microscoop (ECM). (A) Echo toont een intact ventrikelseptum zonder een interventriculaire shunt en normaal verwante grote slagaders in de normale controle, bevestigd door (A') ECM in E14.5-15.5 stadium. (B) Echografie detectie van een atrioventriculaire septumdefect (AVSD). Echobeeldvorming in de 4-kamerweergave toont de communicatie tussen LA, RA, LV en RV, bevestigd door (B') ECM in het E14.5-stadium. (C) Ultrasone diagnose van het ventrikelseptumdefect (VSD) met kleurstroom toont de stroom over LV en RV, bevestigd door (C') ECM in het E16.5-stadium. (D) Echo en (D') ECM demonstreren DORV met een VSD tussen LV en RV met zij-aan-zij grote slagaders (aorta is recht op de longslagader) in het E14.5 stadium. (E) Echografie diagnose van persisterende truncus arteriosus (PTA) toont communicatie tussen LV en RV met een enkele uitstroom tractus die beide ventrikels (PTA) overschrijft. (E') Deze pathologie wordt bevestigd door ECM in het E14.5-stadium. Schaalbalk: 0,5 mm. AO: aorta, AVSD: atrioventriculaire septumdefect, Cd: caudal, Cr: craniaal, L: links, LA: linker atrium, LV: linker ventrikel, PA: longslagader, PTA: persistent truncus arteriosus, R: rechts, RA: rechter atrium, RV: rechter ventrikel, VSD: ventrikelseptumdefect. Schaalbalk: 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Podium | Crown-to-Rump Lengte (mm) | Fetus Gebied (mm2) | Hartgebied (mm2) | Hart gebied / foetus gebied |
| E12,5 | 7,9 ± 0,8 (n = 77) | 23,2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13,5 | 10,5 ± 0,9 (n = 92) | 40,9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14,5 | 12,5 ± 0,9 (n = 101) | 57,6 ± 8 (n = 101) | 2,9 ± 0,5 (n = 70) | 0,050 ± 0,004 (n = 70) |
| E15,5 | 14,1 ± 0,5 (n = 134) | 71,4 ± 6 (n = 134) | 3,8 ± 0,4 (n = 87) | 0,053 ± 0,004 (n = 87) |
| E16,5 | 15,4 ± 0,6 (n = 112) | 82,7 ± 6 (n = 112) | 4,9 ± 0,5 (n = 87) | 0,058 ± 0,007 (n = 87) |
| E17,5 | 16,6 ± 0,4 (n = 211) | 96,9 ± 7 (n = 211) | 6,1 ± 0,6 (n = 146) | 0,063 ± 0,004 (n = 146) |
| E18,5 | 17,7 ± 0,6 (n = 139) | 112,1 ± 8 (n = 139) | 7,1 ± 0,8 (n = 93) | 0,063 ± 0,005 (n = 93) |
| E19,5 | 18,7 ± 0,7 (n = 57) | 126,7 ± 8 (n = 57) | 7,7 ± 0,7 (n = 36) | 0,062 ± 0,005 (n = 36) |
Tabel 1: Ontwikkelingsprofiel van foetale groei.
| E14,5 | E16,5 | E18,5 | Pasgeboren | |
| 70% Ethanol | 1 u | 1,5 u | 3 u | 4 u |
| 95% Ethanol | 35 min. | 45 min. | 1 u | 1 u |
| 95% Ethanol | 35 min. | 45 min. | 1 u | 1 u |
| 100% Ethanol | 15 min. | 15 min. | 30 min. | 6 min. |
| Xyleen 1 | 20 min. | 30 min. | 40 min | 30 min. |
| Xyleen 2 | 20 min. | 30 min. | 40 min | 30 min. |
| Was 1 | 20 min. | 20 min. | 20 min. | 30 min. |
| Was 2 | 20 min. | 20 min. | 20 min. | 30 min. |
| Was 3 | Overnachten | Overnachten | Overnachten | Overnachten |
Tabel 2: Protocol voor embryo-inbedding op basis van embryonale dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisch gemodificeerde muizen zijn gebruikt om de pathomechanismen van aangeboren hartafwijkingen te begrijpen. De protocollen die we in deze studie bieden, proberen het proces van het beoordelen van muizen foetale hartafwijkingen te stroomlijnen en te standaardiseren. Er zijn echter kritieke stappen om op te merken tijdens het protocol. Muizenembryo's groeien aanzienlijk tijdens elke dag van de dracht en de juiste tijd om een muis te oogsten kan worden bepaald door nauwkeurig een foetaal echocardiogram uit te voeren. Het foetale echocardiogram kan worden gebruikt om de foetale cardiovasculaire pathologie te screenen. Een 2D-beeld maakt de identificatie van abnormale anatomie en hartfunctie mogelijk, met behulp van kleurDoppler om de bloedstroom te onderzoeken en eventuele communicatie tussen de kamers van het hart of abnormale uitstroom- en instroomkanalen te detecteren. Om de CHD-diagnose te bepalen, worden foetussen gescand vanaf embryonale dag E14.5 wanneer de uitstroomkanaal septatie en hartkamervorming zijn voltooid. Scannen in eerdere stadia kan de ontwikkelingsachterstand weerspiegelen.
Histopathologie is de standaard om CHDs8 te karakteriseren met behulp van een microtoom gevolgd door optische microscoopvisualisatie. Het grote nadeel van de standaardmethode is het ontbreken van een intuïtieve 3D-weergave van de cardiovasculaire structuren voor diagnose en de beperking in het ontbreken van het bieden van verschillende weergaven van de monsters. Een ECM-histologie is de meest tijdsefficiënte methode om hartafwijkingen te karakteriseren. Als ECM niet beschikbaar is, kan een microtoom worden gebruikt om het embryo te sectieren en cardiale fenotypen te bepalen. Andere opties voor het verkrijgen van cardiale beeldvorming zijn het uitvoeren van high-throughput, hoge resolutie magnetische resonantie beeldvorming (MRI) of computertomografie (CT). Een belangrijk aspect van MRI of CT is dat meerdere embryo's tegelijkertijd in beeld kunnen worden gebracht; zelfs na een echografie, CT of MRI-fenotypering is histopathologie vereist om elke CHD-diagnose te bevestigen.
Met behulp van ECM-beeldvorming voor histopathologie wordt het embryo na elke snede serieel in beeld gebracht met behulp van een laserscanconfiscale microscoop die over de automatische glijdende microtoom is gemonteerd. De afzonderlijke beelden die van ECM worden verzameld, maken latere 3D-reconstructies mogelijk en maken het mogelijk om de monsters digitaal te repliceren in elk beeldvlak zonder de beelden opnieuw te nemen 8,11. Een dergelijke operatie maakt een uitgebreide beoordeling van de cardiale anatomie mogelijk, die in verschillende ontwikkelingsstadia kan worden gebruikt. Bovendien kunnen individuele dia's worden hersteld van de microtoom terwijl de gegevens van de ECM-apparatuur worden verzameld. Hoewel ECM-histopathologie de gouden standaard is om structurele hartafwijkingen te beoordelen, zijn er beperkingen met de beschikbaarheid van de apparatuur, software en looptijd per embryo. De looptijd om een embryonaal hart te doorsnijden kan variëren van 1-3 uur per monster, afhankelijk van de grootte. Vanwege de complexiteit van de apparatuur moeten onderzoekers regelmatig op de computer controleren of de regio van belang binnen het veld wordt vastgelegd. Onderzoekers moeten het monster ook controleren om er zeker van te zijn dat paraffinewaskrullen het monster van de laserscanner belemmeren.
ECM en de daaropvolgende 3D-reconstructie bieden een volledige beoordeling met hoge resolutie van elk structureel hartdefect, ongeacht het inbeddingsplan van het monster. Deze protocollen hebben geholpen om met succes een reeks CHD's te diagnosticeren en stelden ons in staat om de cardiale embryogenese in muizenmodellen en pathologieën gerelateerd aan genetische mutaties te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten in dit manuscript.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
