Summary
Her presenterer vi en standard rørledning for å oppnå murine ATC-svulster ved spontane genetisk konstruerte musemodeller. Videre presenterer vi tumordynamikk og patologisk informasjon om de primære og metastaserte lesjonene. Denne modellen vil hjelpe forskere til å forstå tumorigenese og legge til rette for narkotikafunn.
Abstract
Anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft (ATC) er en sjelden, men dødelig malignitet med en dyster prognose. Det er et presserende behov for mer grundig forskning på karsinogenese og utvikling av ATC, samt terapeutiske metoder, siden standardbehandlinger i hovedsak er utarmet hos ATC-pasienter. Lav prevalens har imidlertid hemmet grundige kliniske studier og innsamling av vevsprøver, så lite fremgang har blitt oppnådd i å skape effektive behandlinger. Vi brukte genteknologi for å lage en betinget induserbar ATC murine modell (mATC) i en C57BL/6 bakgrunn. ATC-murinmodellen ble genotypet av TPO-cre/ERT2; BrafCA / wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 og indusert ved intraperitoneal injeksjon med tamoksifen. Med murinmodellen undersøkte vi tumordynamikken (tumorstørrelse varierte fra 12,4 mm 2 til 32,5 mm2 etter 4 måneders induksjon), overlevelse (median overlevelsestid var 130 dager) og metastase (lungemetastaser forekom hos 91,6 % av musene) kurver og patologiske trekk (karakterisert ved Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 og Caspase-3 immunhistokjemisk farging). Resultatene indikerte at spontan mATC har svært lik tumordynamikk og immunologisk mikromiljø til humane ATC-svulster. Som konklusjon, med høy likhet i patofysiologiske trekk og enhetlige genotyper, løste mATC-modellen mangelen på klinisk ATC-vev og prøveheterogenitet til en viss grad. Derfor vil det lette mekanismen og translasjonsstudier av ATC og gi en tilnærming til å undersøke behandlingspotensialet for småmolekylære legemidler og immunterapimidler for ATC.
Introduction
Skjoldbruskkjertelkreft er en av de vanligste endokrine malignitetene1, som stammer fra skjoldbruskepitelet. De siste årene har forekomsten av kreft i skjoldbruskkjertelen økt raskt på verdensbasis2. Skjoldbruskkjertelkreft kan deles inn i forskjellige typer i henhold til graden av tumorcelledifferensiering. På grunnlag av klinisk atferd og histologi deles skjoldbruskkarsinomer inn i godt differensierte karsinomer, inkludert papillær skjoldbruskkarsinom (PTC) og follikulært skjoldbruskkarsinom (FTC), dårlig differensiert karsinom (PDTC) og udifferensiert eller anaplastisk karsinom i skjoldbruskkjertelen (ATC)3. I motsetning til PTC, som er en vanlig type med mild oppførsel og bedre prognose4, er ATC en sjelden og svært aggressiv malignitet som står for 2% til 3% av alle skjoldbruskkjerteltumorer5. Selv om ATC er sjelden, er det ansvarlig for omtrent 50% av skjoldbruskkjertelkreftrelaterte dødsfall, med dyster overlevelse (6-8 måneder)6,7. Over 50% av ATC-tilfellene diagnostiseres som lungemetastase8. I tillegg til ATCs aggressive natur er det utviklet begrenset effektiv behandling i klinikken. Derfor har ATC-pasienter en dyster prognose 9,10,11. Dette antyder at det er behov for ytterligere grundige studier av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for utviklingen av ATC og behandling.
Tumorigenese av ATC er en dynamisk dedifferensiert prosess. Vanskeligheten med å samle humane tumorprøver på hvert stadium i kliniske studier har hindret forståelsen av utviklingsmekanismen fra godt differensierte til udifferensierte karsinomer. I motsetning til dette favoriserer bruken av murine ATC-modeller (mATC) innsamling av mATC-prøver i hele tumorigenesekurset. Derfor kan vi bedre forstå mekanismene for tumordannelse ved å analysere den dynamiske dedifferensierte prosessen. I tillegg har heterogeniteten til kliniske ATC-prøver også bidratt til vanskeligheten med å forstå den molekylære mekanismen. Likevel delte mus de samme genetiske bakgrunnene og ble opprettholdt i lignende livsmiljøer, noe som sikret hver svulsts konsistens. Dette gjør det lettere å utforske den generelle rollen til ATC-utvikling12,13,14. I tillegg er mATC en in situ tumormodell som kan gjenopprette innflytelsen fra den anatomiske plasseringen og vevsspesifikt mikromiljø. Som sådan, sammenlignet med vanlige immundefekte mus, er mATC en spontan murinmodell med et intakt immunsystem og immunmikromiljø.
Derfor konstruerte vi betinget indusert mATC med C57BL/6-stammen, som er en murinmodell som er i stand til å reprodusere de patologiske egenskapene til dedifferensiert tyreoideakarsinom. Basert på denne modellen ga vi en kort oversikt over molekylært grunnlag, konstruksjonsideer, patologiske egenskaper og anvendelser av mATC. I tillegg observerte og rapporterte vi tumorvekst, overlevelsestid, metastase og patologiske trekk ved mATC. Vi tror dette vil være en informatisk oversikt for å hjelpe andre forskere med å bruke denne modellen enklere.
Vi konstruerte en betinget induserbar mATC-modell, som først rapportert av McFadden15; I utgangspunktet konstruerte vi mus: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt og Trp53flox/wt. Spesielt inkluderte TPO-cre/ERT2-mus den humane skjoldbruskkjertelperoksidasen (TPO) promotor (en skjoldbruskspesifikk promotor), som drev uttrykket av et cre-ERT2-fusjonsgen (en cre rekombinase fusjonert til et humant østrogenreseptorligandbindende domene). Cre-ERT2 er vanligvis begrenset til cytoplasma og går bare inn i kjernen når den utsettes for tamoksifen, noe som induserer cre for å utøve rekombinant enzymaktivitet. Når musene krysses med mus som bærer loxP-flankerte sekvenser, etter tamoxifen-induksjon, sletter cre-mediert rekombinasjon de floxed sekvensene i skjoldbruskkjertelcellene for å oppnå formålet med å slå ut eller banke inn bestemte gener.
I tillegg er Braf flox / wt-mus en knock-in allel av menneskelig Braf basert på cre-loxP-systemet. Brafflox / wt murine transcript er kodet av endogene eksoner 1-14 og loxP-flankerte menneskelige eksoner 15-18. Etter cre-mediert eksisjon av floxed regioner, mutant ekson 15 (modifisert med en V600E aminosyresubstitusjon knyttet til konstitutivt aktiv BrafV600E i humane kreftformer) og endogene eksoner 16-18 brukes til å generere transkripsjoner. Videre er Trp53 flox/wt-mus knockout-alleler av humant Trp53 og har loxP-steder som flankerer eksoner 2-10 av Trp53. Når krysset med mus med en cre recombinase, cre-mediert rekombinasjon sletter floxed sekvensen for å slå ut Trp53. Deretter ble TPO-cre/ERT2, Braf flox/w og Trp53flox/wt-mus krysset for å oppnå TB (TPO-cre/ERT2; Brafflox / wt) mus og TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox / wt; Trp53flox/wt) mus, som kan brukes til å generere PTC og ATC. Etter ca. 8 uker ble musene indusert av en intraperitoneal (i.p.) administrering av 150 mg/kg tamoksifen oppløst i maisolje i to administrasjoner. Tumorvekst kunne overvåkes med høyfrekvent ultralyd (første tidspunkt for ultralyd ble registrert som dag 0). Initial ultralydundersøkelse ble utført 40 dager etter tamoksifenintroduksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprosedyrene beskrevet her ble utført med godkjenning fra dyreetikkomiteen ved West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, Kina.
1. Induksjon av TBP-mus
- Identifiser musgenotype
- På rundt 3 uker, skille hunnmusene fra hannmusene. Bruk samtidig øremerkeklemme for å fikse et øremerke. Plasser øremerkene i nedre halvdel og på den midterste tredjedelen av øret, og sørg for å unngå området med høyest konsentrasjon av kapillærer.
- Hold musene forsiktig, men sikkert. Ta godt tak i bunnen av musehalen. Plasser musene på en overflate som lar dem gripe.
- Legg den ledige hånden forsiktig, men bestemt over skuldrene, og ta raskt tak i skrubben i nakken mellom tommelen og pekefingeren. Hold halen med lillefingeren.
- Tørk halen med alkohol. Bruk steril saks til å klippe hudprøven <5 mm og legg den i en ren prøvebeholder med en etikett. Det er ikke nødvendig å fjerne pelsen av musene. Komprimer halen med sterile svamper for å oppnå hemostase.
- Deretter lyse murine halen og utføre polymerasekjedereaksjon (PCR) for å identifisere genotypen.
MERK: Etter å ha kuttet en murinhale, må overflaten på saksen tørkes med alkoholbomull for å unngå gjensidig forurensning av gener mellom murinhaler. Etter å ha plassert dem i buret, må musene overvåkes i 5 minutter for å se etter tegn på blødning på sårstedet. Se tabell 1 for listen over primere og PCR-innstillingene som ble brukt i denne studien.
- Tamoxifen-induserte TBP-mus
- Vei 0,3 g tamoxifen og oppløs den i 15 ml maisolje ved ultralyd (effekt = 20%, varighet = 20 min, temperatur = 4 ° C), i en konsentrasjon på 20 mg / ml. Oppbevares ved 4 °C.
MERK: Tamoxifen er følsom for lys og må plasseres i en brun beholder. - På rundt 8 uker, vei musene med elektroniske vekter og gi dem en i.p. injeksjon av tamoxifen i en dose på 150 mg / kg, administrert to ganger med en 1 ukes intervall.
- Vei 0,3 g tamoxifen og oppløs den i 15 ml maisolje ved ultralyd (effekt = 20%, varighet = 20 min, temperatur = 4 ° C), i en konsentrasjon på 20 mg / ml. Oppbevares ved 4 °C.
2. Disseksjon og avbildning av mus skjoldbrusk svulster og metastatiske svulster
- Forberedelse
- Forbered disseksjonsverktøyene: steril saks og tang, sterilt blad, 75% alkoholsprayflaske, 20 cm rettkant, vernier kalipere, papirhåndklær og alkoholbomull.
- Musevevfikseringsløsning: lag 4% paraformaldehydvevsfikseringsløsning.
- Rengjør en 10 cm tallerken fylt med ca. 10 ml steril fosfatbufret saltvann (PBS) for midlertidig lagring av vev, og vask blodet på overflaten av vevet.
- Utvinning av skjoldbruskkjertelen
- Avlive musene med karbondioksid med en strømningshastighet på 2,0 l/min i 5 minutter. Fjern musene fra buret og utfør cervikal dislokasjon.
- Plasser musen på dissekerbrettet med ventralsiden vendt opp og hodet vekk fra eksperimentøren, og fest lemmer på dissekeringsbrettet med sterile sprøytenåler. For en mer praktisk fjerning av skjoldbruskkjertelvev, bruk en annen steril sprøytenål for å fikse hodet.
- Desinfiser nakken med tre alternerende runder med klorhexidin- eller povidon-jodskrubb etterfulgt av 75% alkohol. Deretter gjør du et lite snitt over midten av kragebenet med steril saks og tang.
- Fortsett snittet midtlinjen opp til munnen. Finn den submandibulære kjertelen og fjern den for å avsløre den anatomiske plasseringen av skjoldbruskkjertelen, som er plassert nær skjoldbrusk og luftrør.
- Finn skjoldbruskkjertelen, dissekere skjoldbruskkjertelen forsiktig fra resten av nakkeområdet med steril saks, og legg deretter den fjernede skjoldbruskkjertelen i en 10 cm tallerken fylt med 10 ml steril PBS.
MERK: Under fjerning av skjoldbruskkjertelen, vær forsiktig og langsom og unngå å kutte blodårene i nakken. Hvis nakkekarene blir kuttet, blir nakken umiddelbart fylt med blod, og blodet må straks fjernes med alkoholsvamper for å avsløre skjoldbruskens anatomiske plassering. Før du fjerner skjoldbruskkjertelvevet, må du nøye observere egenskapene til venstre og høyre lobes av skjoldbruskkjertelen (størrelse, form, etc.) for å unngå å skille mellom venstre og høyre lobes av skjoldbruskkjertelen etter fjerning. - I steril PBS, fjern blodet fra overflaten av skjoldbruskkjertelen med steril saks og kutt forsiktig av luftrøret. Deretter legger skjoldbruskkjertelen vev på en steril klut, og måle størrelsen på venstre og høyre lobes av skjoldbruskkjertelen med vernier kalipere.
- Del venstre og høyre lobes av skjoldbruskkjertelen i to deler med et sterilt blad. Sett en del i 2 ml 4% paraformaldehydoppløsning for fiksering, og sett den andre delen i flytende nitrogen for konservering.
- Ekstraksjon av lunge og lever
- Desinfiser magen med tre vekslende runder med klorhexidin- eller povidon-jodskrubb og 75% alkohol. Deretter klemmer du like over musens penis og gjør et lite snitt, kutt langs midtlinjen av magen til det subklaviske beinet, og utsett bukhulen.
- Finn leveren i den øvre delen av magen og fjern den forsiktig. Plasser leveren i steril PBS.
- Klipp forsiktig membranen langs ribbeina for å avsløre brysthulen. Deretter tar du tak i brystbenet og trekker opp for å utvide plassen enda mer. Finn lungen og fjern den. Sett den fjernede lungen i steril PBS.
- Grovt observere om det er metastaser i lunge og lever. Telle antall metastaser og ta en digital post. Deretter bruker du et sterilt blad for å dele lunge- og levervevet i to deler. Sett en del i 3 ml 4% paraformaldehydoppløsning for fiksering og en annen del i flytende nitrogen for konservering.
- Dehydrering av vev
- Sett vevet i dehydreringsboksen. Sett dehydreringsboksen i kurven ved gradient alkoholdehydrering som følger: 70% alkohol i 1 time; 80% alkohol i 1 time; 95% alkohol i 30 min; 95% alkohol i 30 min; vannfri etanol I i 30 minutter; vannfri etanol II i 30 minutter; xylen I i 20 minutter; xylen II i 20 minutter; parafinvoks I i 30 minutter; parafinvoks II i 1 time; parafinvoks III i 30 min.
- Legg det voksimpregnerte vevet inn i innebyggingsmaskinen.
- Sett den smeltede voksen inn i innebyggingsrammen først. Før voksen stivner, fjern vevet fra dehydreringsboksen og legg det inn i innebyggingsrammen, og fest deretter etiketten.
- La voksen avkjøles ved -20 °C på frysebordet. Etter at voksen stivner, fjern voksblokken fra innebyggingsrammen og trim den.
- Plasser den trimmede voksblokken på en parafinskive, sett med en tykkelse på 5 μm og en størrelse på 2 cm x 2 cm. Etter snitting, la seksjonene flyte på en spreder med varmt vann ved 45 °C for å flate ut vevet. Plukk opp papirlommetørkleet med en sklie, og stek skivene i ovn ved 65 °C i 2 timer.
- Etter at vannet tørker og voksen smelter, fjern lysbildet med vevet og bruk det til hematoksylin og eosin (HE) og immunhistokjemisk (IHC) farging16. Forsikre deg om at seksjonene er festet til lysbildene for farging.
3. HE farging av primærtumor og lunge
- Avvoksing
- Sett lysbildene med seksjonene i xylen i 10 minutter.
- Flytt inn i vannfri alkohol (100%) (to flasker) i ca 3 minutter hver.
- Flytt inn i 95% alkohol (to flasker) i ca 3 min hver.
- Flytt inn i 80% alkohol i ca 3 min.
- Flytt inn i 50% alkohol i ca 3 min.
- Flytt inn i vannet fra springen, og vask bort alkoholen i ca 1 min.
- Flekker
- Flytt lysbildene inn i hematoksylin i 8 minutter.
- Flytt lysbildene i vannet i 1 min for å vaske bort hematoksylinet; Vevet endres fra blått til rødt.
- Flytt lysbildene til 1% saltsyrealkohol i ca 30 s.
- Flytt skliene i vannet, vask i 5 min.
- Flytt lysbildene inn i eosin i 90 s, vask dem deretter med vann i 5 minutter.
- Flytt lysbildene til 50% alkohol, 80% alkohol, 95% alkohol (to flasker) og vannfri alkohol (100%) (to flasker), i 1 min hver.
- Flytt lysbildene inn i xylen i 5 minutter.
- Etter at lysbildene er tørre, forsegl dem med nøytral harpiks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi induserte mATC for å undersøke tumorvekst, musoverlevelsestid og patologiske egenskaper. Etter induksjon ble musene umiddelbart ofret, og prøver (skjoldbruskkjertel, lunge og lever) ble samlet når en av følgende forhold ble funnet: 1) respiratorisk nød forårsaket av tumorkompresjon; 2) redusert appetitt og unormal vokalisering; 3) uvanlig sløvhet; og 4) vekttap på over 20%. Under prøvetakingsprosessen fant vi at alle mus (12/12) dannet svulster etter induksjon. Vi registrerte musens overlevelsestid, tumoregenskaper / størrelse og metastaserte lesjoner.
Grovt observerte vi følgende: 1) svulstene var ømme, og størrelsen på svulstene på venstre og høyre side var inkonsekvent; 2) De fleste musene (11/12) hadde lungemetastaser, men ingen hadde levermetastaser. Spesielt ble tumorstørrelsen overvåket av dyre høyfrekvente ultralyd- og fotoakustiske bildesystemer (Vevo®3100) gjennom hele prosessen17. Basert på ultralyddataene ble tumorvekstkurven (figur 1A) plottet for å observere den dynamiske endringen av tumorstørrelsen. Videre vokste svulstene langsomt tidlig (gjennomsnittlig tumorstørrelse varierte fra 9,47 mm 2 til 11,75 mm 2 fra dag 0 til dag 60), og ble dramatisk raskere sent på stadiet (gjennomsnittlig tumorstørrelse varierte fra 11,75 mm 2 til 23,95 mm 2 (fra dag 60 til dag 100). De fleste mus ble ofret i det sene stadiet. Kort sagt, mATC med en viss tumorlatensperiode må overvåkes nøye etter 60 dager for å forhindre kvelningsrelatert død.
På den annen side ble musenes overlevelsestid registrert, og en overlevelseskurve (figur 1B) ble plottet. Median overlevelse av mATC var 130 dager, varierende fra 56-166 dager. I tillegg ble det funnet lungemetastaser hos de fleste mATC (ca. 92 %) (figur 1C). Vi observerte at kun én mus i denne kohorten ikke viste lungemetastaser ved grov undersøkelse, og seks mus hadde mer enn én lungemetastaserende lesjon. Det ble ikke funnet levermetastaser. Kort sagt, disse resultatene var i samsvar med den biologiske oppførselen til ATC, som er utsatt for lungemetastase i klinikker.
Videre, for bedre å observere den dynamiske prosessen med mATC, ofret vi musene på to tidspunkter (1 måned og 2 måneder etter induksjon). Vi utførte HE-farging på primærsvulster og metastatisk lungevev i mATC (figur 1D). I 1 måned induserbart vev observerte vi ufullstendige størknede egenskaper og sameksistensen av follikulære strukturer og ondartede celler. Thyreoideafollikulære strukturer forsvant, og svulsten størknet helt etter en 2 måneders induksjon. HE-farging av primærtumor viste at tumorcellene var morfologisk forskjellige, med pleomorfe kjempeceller (indikert med rød pil) og spindelformede celler (indikert med gul pil). Det viste også et bredt utvalg i kjernefysisk størrelse, og mange celler inneholdt flere kjerner. Klare metastatiske foci (indikert med sirkel) ble sett i lungene. HE-farging av metastatisk lungevev viste at det normale lungevevet var en retikulær struktur med klare alveolære strukturer og luftrom. Likevel viste lungemetastaser tap av normal retikulær struktur, lufthulefortykkelse og lungeparenkym.
I mellomtiden ble IHC-farging utført for ytterligere å karakterisere (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 og Caspase-3) mATC-svulster for å kvantifisere celleproliferasjon og apoptose, og undersøke infiltrasjon av lymfocytter, T-vanlige (Treg) celler og myeloide celler (figur 2A-D). Anti-Ki67-fargingen var svært positiv, fra 86,9 % til 95,07 %, noe som viste en høy grad av celleproliferasjon. Antiaktivert caspase-3 antistoff ble brukt til å teste graden av apoptose, varierende fra 5,2% til 51,9%. Spesielt presenterte mATC åpenbar CD8+ T-celleinfiltrasjon, hvis forhold varierte fra 0,47 % til 10,55 % (gjennomsnitt: 5,93 %). Dette indikerte at mATC ikke var en immunørkensvulst, noe som var forenlig med ATC-prøver. Dessuten definerte Foxp3-farging Treg-celler, som varierte fra 0,45% til 25,8%. I tillegg til lymfocytter ble F4/80 og Cd206 brukt til å definere henholdsvis makrofager og M2-makrofager. Vi fant at myeloide celler i stor grad infiltrerte svulster (F4/80 positiv cellerate fra 86,6% til 94,6%; Cd206 positiv cellerate fra 40,4 % til 67,7 %), noe som var i samsvar med tidligere litteratur16. Kort fortalt fant vi svært proliferative tumorceller, lymfocyttinfiltrasjon og omfattende infiltrasjon av myeloide celler i mATC, noe som var forenlig med kliniske prøver.
Avslutningsvis viste mATC-prøver homogenitet i tumordynamikk, metastase og patologiske trekk, i samsvar med de kliniske prøvene. Med tanke på tumordannelseshastigheten var mATC en pålitelig murinmodell.
Figur 1: Tumordynamikk og patologiske egenskaper. (A) Tumorvekstkurve hos mus (n = 5). Hver linje representerer en mus: det tidlige stadiet varierer fra dag 0 til dag 60, og det sene stadiet varierer fra dag 60 til dag 100. (B) Overlevelseskurver for mus (n = 12). Median overlevelse av mATC var 130 dager, varierende fra 56 dager til 166 dager. (C) Lungemetastasekurver hos mus (n = 12). Representative disseksjonsbilder av tyreoidea- og lungemetastaser. Den røde pilen indikerer skjoldbruskkjertelsvulsten, og den hvite sirkelen indikerer metastase i lungen. (D) HE-farging av primærtumor (1 måned og 2 måneder etter induksjon) og lungemetastase. Den røde pilen indikerer den pleomorfe gigantiske cellen, den gule pilen indikerer den spindelformede cellen, og det sirklede området indikerer en metastase i lungen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Kort beskrivelse av immuncelleinfiltrasjon i mATC. (A) Immunhistokjemisk farging av primærtumorer i ATC-murine med antistoffer (Cd8, Foxp3). Den røde pilen indikerer en CD8-positiv celle, den gule pilen indikerer en Foxp3-positiv celle. (B) Immunhistokjemisk farging av ATC-murine primærtumorer med antistoffer (Ki67, Caspase-3). (C) Immunhistokjemisk farging av primærtumorer i ATC-murine med antistoffer (F4/80, Cd206). (D) Kvantifiseringen av IHC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Listen over primere og PCR-innstillingene som ble brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen for skjoldbrusk tumor disseksjon
Under disseksjon må den anatomiske plasseringen av skjoldbruskkjertelen forstås riktig. Skjoldbruskkjertelen er en sommerfuglformet kjertel som ligger på dorsalsiden av submandibulær kjertel nær skjoldbrusk og luftrøret. Under prosedyren ble kutting av blodårene på begge sider av nakken nøye unngått.
Modifikasjon og feilsøking av mATC-rasen
ATC er en sjelden og svært aggressiv malignitet. De kliniske egenskapene til mATC- og ATC-pasienter har visse likheter. Spesielt er den viktigste dødsårsaken i mATC kvelning, noe som stemmer overens med ATC-pasienter. Derfor, under forsøket, bør følgende bemerkes: 1) Ta forsiktig tak i musene og vær oppmerksom på respirasjonen under operasjonen; 2) overvåke nøye i sen fase for å forhindre plutselig død og unnlatelse av å skaffe prøver i tide; 3) Skjoldbruskkjertelen og lungevevet påvirkes lett av blodet på overflaten av vevet for observasjon og fotografering, slik at blodvolumet av mus kan reduseres ved øyebolletukleasjon.
Begrensninger ved bruk av mATC
Forekomsten og utviklingen av human ATC er kompleks og foranderlig, men den genetiske bakgrunnen til mATC er relativt enkel, som bare kan simulere en del av menneskelig ATC. For eksempel hadde noen ATC-vev TERT- og BRAF-mutasjoner, NOTCH2NL kopinummervariant 18, i stedet for P53-mutasjoner, som kan ha forskjellige tumorigenesemekanismer og kliniske patologiske egenskaper 7,19,20. I tillegg har ATC vanligvis et langt tidsforløp før diagnosen, men mATC får en diagnose etter en induksjon på 2 måneder. Derfor er det iboende forskjeller mellom mATC og human skjoldbruskkjertelkreft, dyremodeller kan ikke fullt ut etterligne alle egenskaper ved human skjoldbruskkjertelkreft, og mange terapier som er begrenset til mennesker kan ikke evalueres på mATC. Videre, selv om mATC kan brukes til å undersøke terapeutiske effekter av ulike småmolekylære medisiner, bør flere biologiske legemidler (f.eks. Antistoff eller antistoffrelaterte legemidler) utformes spesielt for mus. I tillegg tar hele prosessen med å konstruere betingede knockoutmus og deretter oppnå målgenotypen til mus ved kryssavl lang tid og krever visse musekulturforhold og koster21,22.
Betydningen av å bruke mATC i forskning på skjoldbruskkjertelkreft
Heterogeniteten til den menneskelige befolkningen og sjeldenheten til menneskelig ATC hindrer utforskningen av potensielle mekanismer og terapeutiske muligheter for ATC. Som en pålitelig musemodell letter mATC innsamlingen av ATC-vev og beriker ATC-vevsprøvebassenget. mATC kan også brukes til å studere effekten av spesifikke genfunksjoner på ATC, studere de cellulære og molekylære mekanismene for ATC-utvikling, forstå mekanismene for skjoldbruskkjerteltumorprogresjon og legemiddelresistens, og til slutt forbedre prognosen til ATC-pasienter16.
Fremtidige anvendelser av mATC
mATC kan brukes til forskning på ulike aspekter ved strålebehandling, kjemoterapi, genterapi, immunterapi og målrettet terapi. mATC kan også brukes til å utforske terapeutiske effekter og bivirkninger av regimer, for eksempel kombinasjoner mellom ulike legemidler eller med strålebehandling. Deretter benyttet vi mATC for å undersøke terapeutisk effekt av strålebehandling kombinert med immunterapi og småmolekylære legemidler på ATC. I tillegg kan mATC brukes til å undersøke effekten av ulike leveringsmodaliteter eller ruter på antitumoreffekter av medisiner for å utvikle legemiddelleveringssystemer med forbedret antitumoraktivitet. I fremtidige kliniske applikasjoner håper vi å minimere tilbakefallsraten og dødeligheten hos pasienter med skjoldbruskkjertelkreft og dermed forbedre overlevelsesraten til pasientene.
Vi forventer at flere ATC murine modeller vil bli utviklet i fremtiden, samt mer dyptgående analyser av ATC i ulike genetiske bakgrunner, som PTEN og P13K23. Disse vil mer omfattende avsløre den molekylære mekanismen for ATC-tumorigenese og progresjon, forutsi utfallet av ATC-behandling, og kunne gi pasienter potensielle terapeutiske mål 24,25,26,27,28. Vi håper at vi gjennom mer eksperimentell utforskning kan forbedre modelleringsmetoden til musemodellen og forkorte modelleringstiden for å gi flere bidrag til grunnforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Key Research Development Program of China (2021YFA1301203); Kinas nasjonale naturvitenskapelige stiftelse (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University (22HXFH019); det internasjonale samarbeidsprosjektet til Chengdu kommunale vitenskaps- og teknologibyrå (2020-GH02-00017-HZ); Naturvitenskapelig stiftelse i Sichuan, 2022NSFSC1314; "1.3.5-prosjektet for fremragende disipliner, West China Hospital, Sichuan University" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); og Sichuan Science and Technology Program (2023YFS0098).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O'Neill, J. P., Shaha, A. R.
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D.
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
