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Developmental Biology

मानव विस्तारित संभावित स्टेम कोशिकाओं से प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं का उत्पादन

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64608
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 2,3
1Major in Molecular Biology and Biotechnology, School of Biological Sciences, The University of Hong Kong, 2School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 3Centre for Translational Stem Cell Biology

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल दिखाता है कि 3 डी और 2 डी कल्चर स्थितियों दोनों के तहत मानव विस्तारित संभावित स्टेम कोशिकाओं (एचईपीएससी) से हल्के साइटोटॉक्सिसिटी के साथ सीडी 3−/सीडी 45 + सीडी 56 + कोशिकाओं को कैसे अलग किया जाए। यह जटिल माइक्रोएन्वायरमेंट के विनाश के बिना नियमित फेनोटाइपिक सत्यापन की अनुमति देता है।

Abstract

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं का भेदभाव इम्यूनोथेरेपी के लिए नैदानिक ग्रेड सेलुलर उत्पादों पर अनुसंधान और निर्माण की अनुमति देता है। यहां वर्णित एक दो-चरण प्रोटोकॉल है जो सीरम-मुक्त वाणिज्यिक माध्यम और साइटोकिन्स (इंटरल्यूकिन [आईएल]-3, आईएल -7, आईएल -15, स्टेम सेल फैक्टर [एससीएफ], और एफएमएस जैसे टायरोसिन किनेज 3 लिगैंड [एफटीएल 3 एल]) के कॉकटेल का उपयोग करता है ताकि मानव विस्तारित संभावित स्टेम कोशिकाओं (एचईपीएससी) को उन कोशिकाओं में अलग किया जा सके जिनके पास 3-आयामी (3 डी) और 2-आयामी (2 डी) संस्कृति तकनीक दोनों के साथ इन विट्रो में एनके सेल गुण होते हैं। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, CD3−CD56+ या CD45+CD56+ NK कोशिकाएँ लगातार उत्पन्न होती हैं. जब 3 घंटे के लिए ट्यूमर लक्ष्यों के साथ सह-संवर्धन किया जाता है, तो विभेदित उत्पाद आईएल -2-स्वतंत्र स्थायी सेल लाइन, एनके 92 एमी कोशिकाओं की तुलना में हल्के साइटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित करते हैं। प्रोटोकॉल 3 डी संरचनाओं की पीढ़ी द्वारा भेदभाव माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता को संरक्षित करता है, इस प्रकार प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके आला के बीच स्थानिक संबंधों के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। इस बीच, 2 डी संस्कृति प्रणाली नाजुक भेदभाव आला को नुकसान पहुंचाए बिना सेल भेदभाव के नियमित फेनोटाइपिक सत्यापन को सक्षम बनाती है।

Introduction

मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) जैसे पारंपरिक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल की तुलना में, मानव विस्तारित संभावित स्टेम सेल (एचईपीएससी) टोटिपोटेंसी की स्थिति के करीब हैं, क्योंकि वे अतिरिक्त भ्रूण और भ्रूण वंश दोनों में अंतर करसकते हैं। उदाहरण के लिए, एचईपीएससी को ट्रोफोब्लास्ट1 और जर्दी-थैली जैसी कोशिकाओं2 में विभेदित किया जा सकता है। एचईपीएससी की अनूठी शक्ति प्राप्त करने के लिए, एक व्यक्तिगत ब्लास्टोमेरे को एक माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है जिसमें कई छोटे अणु होते हैं जो वंश प्रतिबद्धता सिग्नलिंग1 को रोकते हैं, जिसे ईपीएससी माध्यम (ईपीएससीएम) कहा जाता है। ईपीएससीएम में एचईएससी और एचआईपीएससी की खेती उन्हें ट्रोफोब्लास्टकोशिकाओं में अलग करने के लिए उनकी पहले से प्रतिबंधित शक्ति का विस्तार करती है।

प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल नए आनुवंशिक संशोधनों के साथ प्रयोग करने के लिए एक मूल्यवान अनुसंधान उपकरण हैं। प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की आत्म-नवीकरण और विभेदन क्षमताओं के कारण, एक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का एक रूपांतरित क्लोन विभेदित सेलुलर उत्पादों का उत्पादन कर सकता है जिनके पास एक ही स्थान पर समान आनुवंशिक संशोधन होता है। झू और कॉफमैन ने पारंपरिक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचईएससी और एचआईपीएससी) से एनके सेल भेदभाव के लिए मानक स्थापित किया। सबसे पहले, उन्होंने प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त भ्रूण शरीर से हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) को प्रेरित किया। स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), एफएमएस जैसे टायरोसिन किनेज 3 लिगैंड (एफटीएल 3 एल), इंटरल्यूकिन (आईएल) -7, आईएल -15, और आईएल -3 के शुरुआती पूरक के अलावा एचएससी को प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं में विकसित करने के लिए पक्षपाती बनाया गया। इसके बाद, उन्होंने कृत्रिम एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एएपीसी) के साथ एनके कोशिकाओं का विस्तार किया, जो आईएल -2 के निरंतर पूरक के साथ झिल्ली-बाध्य आईएल -21 पेश करते हैं। शोधकर्ताओं ने चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर-आईएनके) 4 के साथ संपन्न आईपीएससी-व्युत्पन्न प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इम्यूनोथेरेपी के लिए इस दृष्टिकोण को लागू किया है।

मानव एनके कोशिकाओं को परिधीय रक्त में सीडी 3-सीडी 56 + ल्यूकोसाइट्स के रूप में परिभाषित किया गया है। वे वायरस से संक्रमित कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओंके खिलाफ प्रभावक हैं। एनके कोशिकाओं पर कुछ निरोधात्मक रिसेप्टर्स सामान्य कोशिकाओं में सर्वव्यापी रूप से व्यक्त अणुओं को पहचानते हैं। एक उदाहरण के रूप में, एनके कोशिकाओं पर व्यक्त एनकेजी 2 ए / सीडी 94 हेटेरोडिमर एमएचसी वर्ग 1 अणुओं5 को पहचानता है। इस बीच, एनके कोशिकाओं पर सक्रिय रिसेप्टर्स तनाव-प्रेरित लिगेंड को पहचानते हैं, जैसे कि एनकेजी 2 डी परिवर्तन-प्रेरित एमएचसी वर्ग 1 पॉलीपेप्टाइड-संबंधित अनुक्रम ए (एमआईसीए / एमआईसीबी) 6 को कैसे पहचानता है। कुछ रूपांतरित कोशिकाएं प्रतिरक्षा निगरानी से बचने के लिए अपने "स्व-लिगेंड" को डाउनरेगुलेट करती हैं और असामान्य लिगेंड को बढ़ाती हैं, जो एनके कोशिकाओं को अपनी लिटिक मशीनरी को निष्पादित करने के लिए ट्रिगर करती हैं। एनके कोशिकाओं की आंतरिक एंटी-ट्यूमर क्षमताओं ने इस प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार पर ध्यान दिया है।

भ्रूण और अतिरिक्त-भ्रूण वंश दोनों को एक साथ जन्म देने की क्षमता एचईपीएससी को पारंपरिक प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की तुलना में भ्रूण के विकास आला का अधिक वफादार पुनर्मूल्यांकन प्रदान कर सकती है। अनुभव से, एचपीएससी की तुलना में एचईपीएससी की शक्ति को बनाए रखना आसान है। वर्तमान अध्ययन में, हेमटोपोइएटिक वंश में विकसित करने के लिए एचईपीएससी को पूर्वाग्रह करने के लिए एक प्रोटोकॉल (चित्रा 1) विकसित किया गया था और बाद में पूर्वज कोशिकाओं को प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं में अलग किया गया था। प्रोटोकॉल में, सीरम विसंगतियों से बचने के लिए वाणिज्यिक मीडिया का उपयोग किया जाता है, इसके बाद लिम्फोइड वंश में पूर्वाग्रह भेदभाव के लिए साइटोकिन्स के चरणबद्ध जोड़ होते हैं। इस प्रोटोकॉल में सीडी 3-सीडी 56 +/सीडी 45 + सीडी 56 + सीडी 56 + कोशिकाओं को प्राप्त करते हुए जटिल 3 डी माइक्रोएन्वायरमेंट को संरक्षित करने के लिए दो प्रणालियां हैं जो फेनोटाइपिक और कार्यात्मक रूप से मानव एनके कोशिकाओं से मिलती जुलती हैं।

यह प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उनके भेदभाव आला के साथ बातचीत का अध्ययन करने में उपयोगी हो सकता है और इम्यूनोथेराप्यूटिक उपयोगों के लिए सेलुलर उत्पादों को शुद्ध करने की क्षमता हो सकती है।

Protocol

वर्तमान अध्ययन में इन विट्रो प्रयोग शामिल थे; इसलिए, नैतिकता अनुमोदन लागू नहीं है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली स्थापित सेल लाइनें वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त की गई थीं ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. एचईपीएससी से 3 डी ऑर्गेनोइड संरचनाओं का उत्पादन

  1. एसएनएल फीडरकोशिकाओं 1 पर ईपीएससी माध्यम (12-वेल प्लेट) के 1 एमएल के साथ खेती करके एचईपीएससी बनाए रखें।
    नोट: गुंबद के आकार की कॉलोनियों को देखा जाता है (चित्रा 2 ए) यदि उनकी विस्तारित शक्ति बनी रहती है।
  2. एचईपीएससी का पूर्व-विभेदन करें।
    1. एचईपीएससी माध्यम को हटा दें, और डीएफके माध्यम के 1 एमएल जोड़ें (डीएमईएम / एफ 12 + 10% सीरम प्रतिस्थापन माध्यम, सामग्री की तालिका देखें)। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर2-3 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। यदि इनक्यूबेशन को 3 दिनों तक जारी रखा जाता है तो दूसरे दिन मध्यम परिवर्तन करें।
      नोट: माइक्रोस्कोप के तहत, गुंबद के आकार की कॉलोनियों को चपटा किया जाता है (चित्रा 2 बी)।
  3. हैंगिंग ड्रॉप तकनीक 7,8 द्वारा भ्रूण निकायों के गठन की जांच करें।
    1. डीएफके माध्यम को हटा दें, और एक बार पीबीएस के 1 एमएल से धो लें। 0.05% ट्रिप्सिन का 500 μL जोड़ें, और आकृति विज्ञान के आधार पर 3-7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: एचईपीएससी को फीडर कोशिकाओं से अलग करने में सक्षम होना चाहिए जब प्लेट थोड़ा परेशान होती है।
    2. ट्रिप्सिन को हटा दें, और कोशिकाओं को काटने के लिए डीएफके माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को घुमाएं।
    3. एक पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को हटा दें। फ्लिक करके कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए डीएफके माध्यम का 1 एमएल और वाई 27632 का 1 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. हेमोसाइटोमीटर 9 के साथ सेल निलंबन के भीतर कोशिकाओं की संख्याकी गणना करें। सेल सस्पेंशन को डीएफके माध्यम और वाई 27632 (1,000x) के साथ पतला करें ताकि डीएफके माध्यम के 4,000 कोशिकाएं /
    5. 10 सेमी पेट्री डिश की टोपी को प्रति कैप 25 μL सेल सस्पेंशन की लगभग 30-40 बूंदों के साथ भरें। बूंदों के वाष्पीकरण को रोकने के लिए निचले पकवान में कुछ पीबीएस डालें। धीरे से टोपी को उलटा करें, और पकवान को कवर करें। पकवान को 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।

2. भ्रूण शरीर (ईबी) के मेसोडर्म और हेमटो-एंडोथेलियल पैटर्निंग

  1. बूंद के भीतर ईबी एकत्र करें।
    1. बूंद से सभी ईबी को 1 एमएल पिपेट और कुछ पीबीएस का उपयोग करके 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। बूंद में थोड़ा पीबीएस पंप करें, और फिर पिपेट के साथ ईबी सहित माध्यम को बाहर निकालें।
      नोट: बूंदें जो अधिक पीली होती हैं, गुलाबी बूंदों की तुलना में अधिक सफल गठन और विकास का संकेत देती हैं।
    2. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए एकत्र किए गए ईबी को 100 x g पर घुमाएं, और सतह पर तैरने वाले को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। एकत्र किए गए ईबी को गैर-अनुयायी 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए मध्यम ए का 1 एमएल जोड़ें (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल भेदभाव किट से, सामग्री की तालिका देखें)। इस दिन को दिन 0 के रूप में लेबल करें (चित्रा 1)।
      नोट: आमतौर पर, एक 10 सेमी डिश से एकत्र किए गए सभी ईबी को समूहीकृत किया जाता है और 24-वेल प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित किया जाता है।
  2. ईबी के मेसोडर्म पैटर्निंग का प्रदर्शन करें।
    1. प्लेट को 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ इनक्यूबेट करें। दूसरे दिन, ईबी को हटाने से बचते हुए मध्यम ए (किट से, चरण 2.1.2) के 500 μL को हटा दें। फिर, ताजा माध्यम ए के 500 μL जोड़ें।
  3. भ्रूण शरीर के हेमेटो-एंडोथेलियल विनिर्देश का प्रदर्शन करें।
    1. कुएं से मध्यम ए के 700 μL को हटा दें, और मध्यम B के 700 μL जोड़ें (किट से, चरण 2.1.2)। सात दिनों के लिए संस्कृति। दिन 5, दिन 7 और दिन 9 पर मध्यम बी का आधा बदलाव करें।

3. एनके सेल भेदभाव

  1. पैटर्न किए गए ईबी को एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस पर स्थानांतरित करें।
    1. प्लेट को थोड़ा झुकाएं ताकि ईबी नीचे की ओर एकत्रित हों। ईबी से बचते हुए जितना संभव हो उतना मध्यम बी को हटाने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें।
    2. शेष माध्यम को एस्पिरेटेड करके पिपेट के साथ ईबी उठाएं। उन्हें 24-वेल प्लेट में एक ट्रांसवेल में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: इष्टतम घनत्व के लिए संख्याओं को प्रति ट्रांसवेल दो से तीन ईबी तक सीमित करें।
  2. लिम्फोइड पूर्वज विस्तार करें।
    1. ट्रांसवेल के निचले डिब्बे में एनके -1 माध्यम के 500 μL (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लिम्फोइड विस्तार माध्यम + 14 IU / mL IL-3, 4,500 IU / mL IL-15, 8,800 IU / mL IL -7, 26 IU / mL SCF, और 12 IU / mL ftl3L, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। 14 दिनों के लिए संस्कृति, और हर दूसरे दिन एक मध्यम परिवर्तन करें।
  3. 7-10 दिनों में कोशिकाओं को एक लेपित प्लेट में काटें और स्थानांतरित करें।
    1. प्लेट को कोट करने के लिए, पीबीएस में कोटिंग सामग्री (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लिम्फोइड भेदभाव कोटिंग सामग्री, 100x, सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें। 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल पतला कोटिंग घोल जोड़ें, और प्लेट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। रैपिंग फिल्म के साथ प्लेट के उद्घाटन को कवर करें।
    2. ट्रांसवेल में पीबीएस के 200 μL जोड़ें, और धीरे-धीरे ऑर्गेनोइड्स से जारी कोशिकाओं को काटने के लिए लगभग पांच से छह बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। ऑर्गेनोइड्स को पाइप करने से बचें।
      नोट: गोल कोशिकाओं को ऑर्गेनोइड्स से लगातार जारी किया जाता है (चित्रा 2 डी)।
    3. काटे गए सेल निलंबन को 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर कोशिकाओं को घुमाएं। एक पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए एनके -1 माध्यम (चरण 3.2.1) का 1 एमएल जोड़ें।
    4. कुएं से सभी कोटिंग घोल निकालें, और 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को 1 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
    5. काटी गई कोशिकाओं को 1: 2 के अनुपात में विभाजित करें। सेल निलंबन को लेपित 12-वेल प्लेट (चरण 3.3.1) पर स्थानांतरित करें। 1 एमएल एनके -1 माध्यम जोड़ें ताकि प्रत्येक कुएं में 1.5 एमएल माध्यम हो।
    6. एक मध्यम परिवर्तन करने के लिए, कोशिकाओं को 1-2 मिनट तक बैठने दें ताकि कोशिकाओं को नीचे तक डूबने की अनुमति मिल सके। सावधानीपूर्वक 750 μL माध्यम से बाहर निकालें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एकत्रित सतह पर तैरने वाले को 500 x g पर घुमाएं।
    7. अधिकांश सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और एनके -1 माध्यम के 750 μL में पांच से छह बार पाइपिंग के साथ पुन: निलंबित करें। ताजा माध्यम में पुन: निलंबित कोशिकाओं को मूल कुएं में जोड़ें।
      नोट: इस समानांतर प्रणाली को चित्रा 1 में 2 डी प्रणाली के रूप में जाना जाता है। कोशिकाओं की उत्पत्ति वाले ऑर्गेनोइड्स के कुएं के मध्यम परिवर्तन अनुसूची का पालन करें।
  4. नीचे दिए गए चरणों के बाद एनके सेल परिपक्वता निष्पादित करें।
    1. 3 डी सिस्टम के पुराने माध्यम को हटा दें, और ट्रांसवेल के निचले डिब्बे में एनके -2 के 500 μL (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एनके सेल भेदभाव माध्यम + 4,500 IU / mL IL-15, 8,800 IU / mL IL-7, 26 IU / mL SCF, और 12 IU / mL ftl3L, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। 14 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि माध्यम ट्रांसवेल के निचले हिस्से को छू रहा है।
    2. 2 डी सिस्टम में कोशिकाओं पर एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन करें। एक कुएं से सभी 1.5 एमएल कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और इसे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। एक पिपेट के साथ अधिकांश सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और एनके -2 माध्यम (चरण 3.4.1) के 1.5 एमएल के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. हर दूसरे दिन एक मध्यम परिवर्तन करें। 3 डी सिस्टम की प्लेट को थोड़ा झुकाएं, और ट्रांसवेल के बाहर सभी पुराने माध्यम को हटा दें। ट्रांसवेल के बाहर एनके -2 माध्यम का 500 μL जोड़ें।
    4. 2 डी सिस्टम के लिए 12-वेल प्लेट के एक कुएं पर आधा मध्यम परिवर्तन करने के लिए, कोशिकाओं को 1-2 मिनट तक बैठने दें ताकि कोशिकाओं को नीचे तक डूबने की अनुमति मिल सके। सावधानीपूर्वक माध्यम के 750 μL को बाहर निकालें।
    5. सेल हानि को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर एकत्रित सुपरनैटेंट को घुमाएं। अधिकांश सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और पांच से छह बार पाइप करके एनके -2 माध्यम के 750 μL में पुन: निलंबित करें। ताजा माध्यम में पुन: निलंबित कोशिकाओं को मूल कुएं में जोड़ें।

4. परिपक्व कोशिकाओं की कटाई

  1. 2 डी प्रणाली में संवर्धित कोशिकाओं की कटाई करें।
    1. 38-45 दिनों के दौरान ऊपर और नीचे पाइप करके कोशिकाओं की कटाई करें। पीबीएस के 1 एमएल से दो बार धोएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. एक पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को हटा दें, और इसे पसंद के बफर में फिर से निलंबित करें (यानी, फ्लो साइटोमेट्री के लिए पीबीएस + 2% एफबीएस, सामग्री की तालिका देखें)।
  2. ऑर्गेनॉइड में एम्बेडेड कोशिकाओं की कटाई करें।
    1. 38-45 दिनों के दौरान ट्रांसवेल के बाहर से माध्यम को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। ट्रांसवेल के अंदर 200 μL PBS जोड़कर ऑर्गेनॉइड को दो बार धोएं और पांच से छह बार ऊपर और नीचे करें। निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 12-वेल प्लेट के एक कुएं में पीबीएस के 500 μL जोड़ें। ऑर्गेनॉइड को ट्रांसवेल से 12-वेल प्लेट के उस कुएं में स्थानांतरित करें।
    3. कैंची और बल की एक जोड़ी का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड को 20 बार काटें। शेष कोशिकाओं को बल और कैंची पर पीबीएस के साथ कुएं में फ्लश करें। जितना संभव हो उतना पीबीएस एकत्र करें, और इसे ऑर्गेनोइड संरचना को एस्पिरेटेड किए बिना चरण 4.2.1 में उपयोग किए जाने वाले 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. ऑर्गेनॉइड को एंजाइमेटिक रूप से पचाने के लिए ट्रांसवेल में पृथक्करण अभिकर्मक के 500 μL जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें)। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 7-10 मिनट के लिए एक वाणिज्यिक सेल डिटेचमेंट समाधान (सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें। 2% एफबीएस के साथ पीबीएस के 1 एमएल जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं, और एक और 15 एमएल ट्यूब में समाधान एकत्र करें। 1 एमएल पीबीएस के साथ कुएं को 2% एफबीएस के साथ दो बार धोएं।
      नोट: आकृति विज्ञान के आधार पर इनक्यूबेशन की लंबाई निर्धारित करें। उस बिंदु को प्राप्त करने का प्रयास करें जिस पर एकल कोशिकाएं 3 डी संरचना की झिल्ली से जारी होने लगती हैं।
    5. 2% एफबीएस के साथ 1 एमएल पीबीएस जोड़ें, और 8-10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। ऑर्गेनॉइड संरचनाओं सहित सभी समाधान एकत्र करें। उन्हें सेल स्ट्रेनर के साथ चरण 4.2.3 में उपयोग किए जाने वाले 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर दोनों ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। एक पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें। सेल पेलेट को पसंद के बफर (चरण 4.1.2) के साथ पुन: निलंबित करें।

Representative Results

यह अनुमान लगाया गया था कि वर्तमान इन विट्रो भेदभाव (आईवीडी) उत्पादों में मानव एनके कोशिकाओं के समान सतह मार्कर और एंटी-ट्यूमर क्षमताएं होंगी।

मानव एनके कोशिकाओं के परिभाषित मार्कर को यह परीक्षण करने के लिए एक्सेस किया गया था कि क्या 3 डी संस्कृति प्रणाली से भेदभाव उत्पादों ने कोशिकाओं को उत्पन्न किया जो फेनोटाइपिक रूप से मानव एनके कोशिकाओं से मिलते जुलते थे। अलग-अलग समय बिंदुओं (एन = 2) पर प्रेरित दो बैचों से 3 डी संस्कृति प्रणाली से अलग की गई कोशिकाओं का लगभग 15% सीडी 3-सीडी 56 + (चित्रा 3 ए) थे। सीडी 3 की अनुपस्थिति और विट्रो में टी कोशिकाओं को प्रेरित करने में कठिनाई के कारण परीक्षण पैनल में सीडी 3 को सीडी 45 (एक पैन-ल्यूकोसाइट मार्कर) के साथ बदल दिया गया था। 3 डी संरचना से अलग की गई कोशिकाओं में से लगभग 16% सीडी 45 + सीडी 56 + (चित्रा 3 बी, एन = 1) थे, जो पहले के परीक्षणों में देखे गए सीडी 3-सीडी 56 + कोशिकाओं के प्रतिशत के अनुरूप है। 2 डी कल्चर सिस्टम से काटी गई कोशिकाओं में सीडी 3-सीडी 56 + कोशिकाओं का प्रतिशत 30% से 6% तक था, अधिक सफल प्रेरण (चित्रा 3 सी, एन = 3) से कम सफल प्रेरण (चित्रा 3 डी, एन = 2)। 2 डी संस्कृति प्रणाली से काटे गए कोशिकाओं की कार्यक्षमता और फेनोटाइप को मान्य किया गया था। 2 डी प्रणाली से दिन 18 की संस्कृति के दौरान, लगभग 12% कोशिकाओं ने एक्टोपिक सीडी 56 और सीडी 107 ए दोनों को 50 एनजी / एमएल आईएल -18, 455 आईयू / एमएल आईएल -2, और 20 एनजी / एमएल एंटी-सीडी 244 एंटीबॉडी उत्तेजना (चित्रा 4 सी, एन = 1) के 2 घंटे के बाद व्यक्त किया। लगभग 28% काटी गई कोशिकाएं CD94 + CD159a + (चित्रा 4B, n = 1) थीं। सीडी 107 ए की अस्थानिक अभिव्यक्ति, कणिकाओं की झिल्ली पर एक प्रोटीन अस्तर, डीग्रेनुलेशन10 को इंगित करता है, जबकि सीडी 94 / एनकेजी 2 ए (सीडी 15 9 ए) हेटेरोडिमर एनके कोशिकाओं का एक और परिभाषित मार्कर है। यह आईवीडी उत्पादों के फेनोटाइपिक और कार्यक्षमता सत्यापन का एक उदाहरण प्रदान करता है।

आईवीडी उत्पादों की कार्यक्षमता का परीक्षण मानव एरिथ्रोल्यूकेमिया कोशिकाओं-के 562 कोशिकाओं के खिलाफ उनकी साइटोटॉक्सिसिटी द्वारा किया गया था। के 562 कोशिकाओं पर व्यापक लिगैंड प्रोफाइलिंग से उनके डाउनरेगुलेटेड प्रमुख हिस्टोकेमिस्ट्री कॉम्प्लेक्स आई (एमएचसी-आई) और तुलनात्मक रूप से मजबूत एनकेजी 2 डी लिगैंड अभिव्यक्ति (जैसे यूएलबीपी -1, यूएलबीपी -2/5/6, और यूएलबीपी -3)11 का पता चलता है; इस प्रकार, K562 कोशिकाएं एनके कोशिकाओं12 की लिटिक गतिविधि के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। आईवीडी एंडपॉइंट उत्पादों और एनके 92 मिमी कोशिकाओं दोनों को रात भर 50 एनजी / एमएल आईएल -18, 455 आईयू / एमएल आईएल -2, और 20 एनजी / एमएल एंटी-सीडी 244 एंटीबॉडी के साथ प्राइम किया गया था। जीएफपी + के 562 कोशिकाओं को 50 एनजी/एमएल (आईयू प्रदान नहीं किया गया) आईएल-18, 455 आईयू/एमएल आईएल-2 और 20 एनजी/एमएल एंटी-सीडी244 एंटीबॉडी की उपस्थिति में आईवीडी या एनके92एमआई कोशिकाओं से अलग-अलग प्रभावकारक-से-लक्ष्य अनुपात (ई: टी) पर या तो काटे गए कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन किया गया था। एनके सेल किलिंग गतिविधि का रीडआउट जीएफपी + उपसमुच्चय पर मृत सेल मार्कर की अभिव्यक्ति थी। के 562 कोशिकाओं को जीएफपी को संवैधानिक रूप से व्यक्त करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नियंत्रण वेक्टर ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था, और पारगमन की दक्षता लगभग 80% थी (पूरक चित्रा 1 ए)। जोड़े गए जीएफपी सिग्नल का प्रतिशत जीएफपी + के 562 कोशिकाओं की संख्या के समानुपाती था, जो ट्रांसड्यूस्ड के 562 कोशिकाओं (पूरक चित्रा 1 बी) से विशिष्ट जीएफपी अभिव्यक्ति का सुझाव देता है।

चित्रा 5 में दिखाए गए मरने वाले लक्ष्य कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना निम्नलिखित सूत्र13 के साथ की गई थी:

मरने वाली कोशिकाओं का प्रतिशत = (FITC + DAPI + सहसंस्कृति का % [उदाहरण के लिए, चित्रा 5A]) - (FITC + DAPI + ट्रांसड्यूस्ड K562 कोशिकाओं का %)

मूल्यांकन किए गए सभी तीन ई: टी अनुपातों (0.1: 1, 0.33: 1, 1: 1) में से, मरने वाले जीएफपी + कोशिकाओं के प्रतिशत को सकारात्मक रूप से ई: टी अनुपात के साथ सहसंबद्ध किया गया था जब आईवीडी उत्पादों (चित्रा 5 बी, एचईपीएससी-एनके) या एनके 92 एम कोशिकाओं (चित्रा 5 बी, एनके 9 2 मिमी) के साथ सहसंस्कृति की गई थी, जो ट्यूमर लक्ष्यों की विशिष्ट हत्या का संकेत देता है। हालांकि, आईवीडी उत्पादों की साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण की गई समय सीमा (चित्रा 5 सी) के भीतर तुलनात्मक रूप से मामूली थी।

अंत में, लिम्फोइड पूर्वज कोशिका पीढ़ी की तुलना 3 डी और 2 डी संस्कृतियों के बीच की गई थी। यह पाया गया कि 3 डी कल्चर स्थिति ने 2 डी कल्चर स्थिति (36,000 कोशिकाओं) की तुलना में अधिक पूर्वज कोशिकाओं (55,000 कोशिकाओं) को उत्पन्न किया (पूरक चित्रा 2)। इससे पता चलता है कि 3 डी संस्कृति में ऊतक वास्तुकला और सेलुलर घटकों के संदर्भ ने लिम्फोइड पूर्वज कोशिकाओं की पीढ़ी का समर्थन किया।

Figure 1
चित्र 1: योजनाबद्ध आरेख जो एनके कोशिकाओं को एचईपीएससी से अलग करने के लिए विभेदन रणनीति दिखाता है। (ए) यहां, 3 डी संस्कृति प्रणालियों की समयरेखा दिखाई गई है, जिसमें प्रत्येक चरण से संस्कृति की स्थिति और संक्षिप्त कीवर्ड का विवरण दिया गया है। एनके सेल प्रेरण के दौरान 3 डी सिस्टम का एयर-लिक्विड इंटरफेस बनाए रखा जाता है। (बी) यहां, 2 डी संस्कृति प्रणालियों की समयरेखा दिखाई गई है। 3 डी सिस्टम में संरचनाओं से दिन 7-10 से काटे गए जारी कोशिकाओं को एयर-लिक्विड इंटरफेस के बिना एक लेपित प्लेट पर बीज दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: विभेदन के विभिन्न चरणों में देखी गई कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। (A) EPSCM में बनाए रखने पर HEPSCs की आकृति विज्ञान। एचईपीएससी गुंबददार आकार की कॉलोनियों का निर्माण करते हैं। (बी) पूर्व-विभेदन के बाद एचईपीएससी की आकृति विज्ञान। गुंबददार आकार की कॉलोनियां चपटी हैं। एचईपीएससी को काटा जाता है और हैंगिंग ड्रॉप तकनीक के साथ ईबी का निर्माण किया जाता है। ईबी को मध्यम ए और फिर मध्यम बी में एकत्र और सुसंस्कृत किया जाता है। (सी) 10 वें दिन ईबी की आकृति विज्ञान। इस अवधि के दौरान, ईबी विस्तार और फुलाना शुरू कर देता है, जिससे झिल्लीदार संरचनाएं बनती हैं। (डी) सेल-रिलीजिंग ईबी की आकृति विज्ञान। ट्रांसवेल पर बीज बोने के बाद, ईबी बढ़ता है और लगातार आसपास गोल कोशिकाओं को छोड़ता है। जारी कोशिकाओं में से कुछ को लिम्फोइड भेदभाव कोटिंग सामग्री के साथ लेपित 12-वेल प्लेट पर एकत्र और सुसंस्कृत किया जाता है। सेल आबादी रूपात्मक रूप से विषम हैं और एक साथ एकत्रित होती हैं। (ई) आईवीडी के समापन बिंदु पर देखी गई कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। छोटे, गोलाकार निलंबन कोशिकाओं (काले तीर) को देखा जाता है। स्केल सलाखों: (ए, बी, ई) = 100 μm; (C, D) = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: समापन बिंदु पर एचईपीएससी-व्युत्पन्न उत्पादों के प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए बर्फ पर फ्लोरोस्कोप-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। एफएसीएस नमूना इंजेक्शन पोर्ट में लोड होने से पहले नमूने DAPI से दाग दिए जाते हैं। नकारात्मक गेटिंग स्थापित करने के लिए बिना दाग वाली कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। (ए) दो बैचों (एन = 2) से 3 डी संस्कृति प्रणाली से अलग कोशिकाओं में सीडी 3 और सीडी 56 अभिव्यक्ति पर प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट। (बी) 3 डी संस्कृति (एन = 1) से अलग कोशिकाओं में सीडी 45 और सीडी 56 अभिव्यक्ति पर प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट। (सी) एक सफल प्रेरण (एन = 3) से लेपित प्लेट से काटे गए कोशिकाओं में सीडी 3 और सीडी 56 अभिव्यक्ति पर प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट। (डी) प्रतिनिधि एफएसीएस लेपित प्लेट से सीडी 3 और सीडी 56 अभिव्यक्ति पर प्लॉट करता है जब प्रेरण उप-मानक (एन = 2) होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि एफएसीएस दिन 18 संस्कृति (एन = 1) के दौरान एचईपीएससी-व्युत्पन्न उत्पादों पर प्लॉट करता है। (ए) आईएल 2, आईएल -18 और एंटी-सीडी 244 एंटीबॉडी के साथ उत्तेजना के 2 घंटे के बाद सीडी 56 और सीडी 107 ए अभिव्यक्ति पर एफएसीएस प्लॉट। (बी) सीडी 159 ए और सीडी 94 अभिव्यक्ति पर एफएसीएस प्लॉट। एफएसीएस नमूना इंजेक्शन पोर्ट में लोड होने से पहले नमूने को डीएपीआई के साथ दाग दिया जाता है। नकारात्मक गेटिंग स्थापित करने के लिए बिना दाग वाली कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: आईवीडी समापन बिंदु उत्पाद या एनके 92 मिमी कोशिकाओं (एन = 1) के साथ जीएफपी + के 562 कोशिकाओं के सहसंस्कृति से विभिन्न ई: टी अनुपातों के खिलाफ मरने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत का प्लॉट। एफआईटीसी + डीएपीआई + कोशिकाओं की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन सेल विश्लेषक के साथ किया गया था, और डेटा विश्लेषण संगत सॉफ्टवेयर के साथ किया गया था। (ए) एक प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट 1 के ई: टी अनुपात के साथ आईवीडी उत्पादों और के 562 कोशिकाओं के सहसंस्कृति से एफआईटीसी + डीएपीआई + उपसमुच्चय की सिंचाई को दर्शाता है। (बी) जीएफपी + आईवीडी उत्पादों (बाएं) या एनके 92 मिमी कोशिकाओं (दाएं) के साथ 3 घंटे के लिए कोकल्चर प्रयोग से अलग-अलग भूखंड। दोनों मरने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत और ई: टी अनुपात के बीच एक सकारात्मक आनुपातिक संबंध को दर्शाते हैं। (ग) एक ही पैमाने पर आईवीडी उत्पादों और एनके 92 एमी कोशिकाओं के मारक वक्रों को दर्शाने वाला एक कथानक। एनके 92 मिमी कोशिकाओं की तुलना में आईवीडी उत्पादों ने हल्के साइटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: एचईपीएससी से एनके कोशिकाओं की कार्यात्मक परख। (ए) ट्रांसड्यूस्ड के 562 कोशिकाओं का एफएसीएस हिस्टोग्राम। एफआईटीसी + के 562 कोशिकाओं ने जीएफपी व्यक्त किया। (बी) तीन ई: टी अनुपात (एन = 1) पर जीएफपी + के 562 कोशिकाओं और समापन बिंदु आईवीडी उत्पादों के सहसंस्कृति से एफएसीएस हिस्टोग्राम। कोकल्चर में एफआईटीसी + कोशिकाओं का प्रतिशत अतिरिक्त ट्रांसड्यूस्ड के 562 कोशिकाओं की संख्या के अनुरूप था। गेटिंग को अपरिवर्तित K562 कोशिकाओं के साथ स्थापित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: 2 डी बनाम 3 डी संस्कृति में लिम्फोइड पूर्वज भेदभाव। वर्तमान ऑर्गेनॉइड-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग मानव विस्तारित संभावित स्टेम कोशिकाओं से लिम्फोइड पूर्वजों को प्रेरित करने के लिए किया गया था। दो शर्तें स्थापित की गईं: (1) लिम्फोइड पूर्वजों को ऑर्गेनोइड्स (3 डी) के भीतर संस्कृति में रखा गया था, और (2) लिम्फोइड पूर्वजों को अलग किया गया था और संस्कृति डिश (2 डी) पर रखा गया था। अतिरिक्त संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद, सेल संख्या 2 डी बनाम 3 डी संस्कृति की तुलना करने के लिए निर्धारित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एचईपीएससी से सीडी 45 + सीडी 56 + कोशिकाओं के सफल भेदभाव को सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। पूर्व-विभेदन (चरण 1.2) महत्वपूर्ण है क्योंकि ईपीएससी माध्यम में वंश प्रतिबद्धता1 के अवरोधक होते हैं। पूर्व-विभेदन के बाद, एचईपीएससी की गुंबद के आकार की कॉलोनियों को चपटा कर दिया जाता है (चित्रा 2 बी)। एचईपीएससी (चरण 1.3) से ईबी के गठन के दौरान वाई 27632, एक रो-काइनेज अवरोधक (आरओसीकेआई) को जोड़ना पृथक्करण के बाद एचईपीएससी के अस्तित्व के लिए अपरिहार्य है। एक अन्य महत्वपूर्ण विचार प्रत्येक ट्रांसवेल पर लगाए गए ईबी की संख्या है। चूंकि यह एक छोटे पैमाने पर प्रणाली है, इसलिए मीडिया के अतिउपभोग को रोकने के लिए प्रति ट्रांसवेल दो से तीन ईबी इष्टतम घनत्व है। 3 डी प्रणाली के लिए एनके सेल भेदभाव के पूरे पाठ्यक्रम के दौरान वायु-तरल इंटरफ़ेस बनाए रखा जाता है, जिसे स्ट्रोमल कोशिकाओं की ध्रुवीयता को बनाए रखने और एजीएम-व्युत्पन्न हेमटोपोइएटिक पूर्वजों14,15 के विस्तार का समर्थन करने के लिए माना जाता है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ट्रांसवेल पर ईबी का घनत्व सफल भेदभाव के लिए एक निर्धारण कारक है। इसके लिए महत्वपूर्ण संकेत ट्रांसवेल पर ईबी के आरोपण के 1 दिन बाद माध्यम का रंग है। यदि रंग जल्दी से पीला हो जाता है, तो यह या तो संदूषण या भीड़भाड़ को इंगित करता है। समस्या को हल करने के लिए, अतिरिक्त ईबी को मैन्युअल रूप से लेने और उन्हें दूसरे ट्रांसवेल में स्थानांतरित करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा आईवीडी उत्पादों में सीडी 3−/सीडी 45 + सीडी 56 + कोशिकाओं की शुद्धता है, जिसे शुद्ध एनके 92 एमी कोशिकाओं की तुलना में अवर साइटोटॉक्सिसिटी के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार माना जाता है। एक 3 डी संस्कृति प्रणाली को एक ईबी की पीढ़ी के माध्यम से हेमटोपोइएटिक पूर्वजों को प्रेरित करने के लिए नियोजित किया गया था जो तीन भ्रूण रोगाणु परतों जैसा दिखता है। यह रणनीति अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट में रक्त कोशिकाओं के विकास की नकल करती है, इस प्रकार भेदभाव 3 का समर्थन करने के लिए स्ट्रोमल कोशिकाओं की आवश्यकता को दूर करतीहै। हेमटोपोइएटिक पूर्वजों को शुद्ध करने के लिए एक छंटाई कदम के बिना, आईवीडी उत्पादों की शुद्धता कम होने की उम्मीद है। समापन बिंदु उत्पाद की शुद्धता को बढ़ाते हुए जटिल भेदभाव आला को बनाए रखने की एक रणनीति क्रमबद्ध सीडी 3-सीडी 56 + आईवीडी उत्पादों के लिए एक विस्तार विधि विकसित कर रही है। उदाहरण के लिए, क्रमबद्ध CD3-CD56+ IVD उत्पादों को कृत्रिम एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (AAPCs) पर संवर्धित किया जा सकता है, जैसे कि झिल्ली-बाध्य IL-21 के साथ इंजीनियर किए गए विकिरणित K562 कोशिकाएं। संस्कृति में आईएल -2 की आपूर्ति के साथ, यह विधि एनके सेल नंबर 3 में 1,000 गुना वृद्धि प्राप्त कर सकतीहै।

एक और सीमा सकारात्मक संदर्भ के रूप में वास्तविक मानव एनके कोशिकाओं तक सीमित पहुंच है। एनके 92एमआई कोकल्चर परख में नियोजित सकारात्मक संदर्भ है, लेकिन यह पर्याप्त सटीक नहीं है। एनके 92एमआई कोशिकाओं को एनके 92 कोशिकाओं से इंजीनियर किया जाता है, एक स्थायी सेल लाइन जो सक्रिय एनके सेल फेनोटाइप16 को व्यक्त करती है, ताकि संस्कृति आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए स्वायत्त रूप से आईएल -2 का उत्पादन किया जा सके। एनके 92 कोशिकाएं मानव प्राथमिक एनके कोशिकाओं की तुलना में विट्रो में के 562 कोशिकाओं के खिलाफ बेहतर हत्या गतिविधि का प्रदर्शन करतीहैं। समानांतर में परिधीय रक्त एनके कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिसिटी का विश्लेषण करके आईवीडी उत्पादों की ट्यूमर-हत्या क्षमता की एक निष्पक्ष तुलना प्राप्त की जा सकती है, लेकिन दुर्भाग्य से, रक्त बैंकों तक पहुंच की कमी है।

इस दो-सिस्टम संस्कृति प्रोटोकॉल का उद्देश्य एचईपीएससी से सीडी 3−/सीडी 45 + सीडी 56 + कोशिकाओं को उत्पन्न करना है। एफएसीएस के साथ सतह मार्करों और साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन नियमित रूप से भेदभाव आला को बाधित किए बिना 2 डी सिस्टम से कोशिकाओं पर किया जा सकता है। सीडी 3-सीडी 56 + कोशिकाओं के प्रतिशत में अंतर के बावजूद, 3 डी और 2 डी सिस्टम सीडी 56 अभिव्यक्ति (चित्रा 3) में समान भिन्नताओं के साथ सीडी 3-सीडी 56 + कोशिकाओं को प्राप्त कर सकते हैं, और 2 डी प्रणाली 3 डी संस्कृति स्थिति से लिम्फोइड पूर्वजों के अस्तित्व को दर्शाती है।

3 डी संस्कृति प्रणाली का उपयोग करने का महत्व यह है कि यह जटिल भेदभाव आला के भीतर स्थानिक संबंधों और सेल-सेल इंटरैक्शन पर शोध करने के लिए स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स या इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रोफाइलिंग परख के उपयोग की अनुमति देता है।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम डॉ हांडी काओ, सैंक्सिंग गाओ, डेविड जियांग, यिमिंग चाओ, रितिका जोगानी, ओवेन चान, स्टेफ़नी चेउंग और सेलिन चैन को उनकी तकनीकी सहायता और उपयोगी चर्चाओं के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को प्लेटफॉर्म टेक्नोलॉजी फंड द्वारा समर्थित किया गया था। चित्र 1 BioRender.com के साथ बनाया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free Wako Chemicals 017-22231 For resuspending cytokines. 
ACCUMAX STEMCELL Technologies  07921
Anti-human-CD159a-PE BD 375104 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD3-APC antibodies BD 555355 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) 
Anti-human-CD45-APC antibodies BD 555485 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS)
Anti-human-CD56-PE antibodies BD 555516 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS)
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies BD 335826 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD94-APC  BD 559876 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Thermo Scientific 11772644
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience Thermo Scientific 16-5838-85
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts STEMCELL Technologies 3470
Dapi Solution, 1 mg/mL BD 564907 It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) 
DMEM CPOS-Bioreagent core 11965092
DMEM/F12 Thermo Scientific 11320033
FcX, human Biolengend 422302
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America CPOS-Bioreagent core 10270106
FlowJo v10.8.0 BD
Gibco  PBS (10x) pH 7.4 CPOS-Bioreagent core 70011044 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red
K562 cells  ATCC  CCL-243
Knockout Serum Replacement Thermo Scientific 10828-028
MyeloCult H5100 medium  STEMCELL Technologies 5150
NK92mi cells  ATCC  CRL-2408 Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL.
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate Thermo Scientific 150628 flat bottom
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate Thermo Scientific 142475
Nunc EasYDish Dishes Thermo Scientific 150460
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector  CELL BIOLABS LTV-400 It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2.
Polybrene  EMD Millipore TR-1003-G
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein R&D Systems 308-FK-005 It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL.
Recombinant Human IL-15 Protein R&D Systems 247-ILB-005 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. 
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein R&D Systems 9124-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. 
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. 
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug PeproTech 200-03 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. 
Recombinant Human IL-7 Protein R&D Systems 207-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. 
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. 
STEMdiff Hematopoietic Kit STEMCELL Technologies 5310 Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B
StemSpan lymphoid differentiation coating material STEMCELL Technologies 9950 It is resuspended in PBS (100x)
StemSpan NK cell differentiation medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x)  into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan lymphoid expansion medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan NK Cell Generation Kit STEMCELL Technologies 9960 Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. 
The BD LSRFortessa cell analyzer BD
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific 25300054
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 working concentration: 10 µM

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References

  1. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nature Cell Biology. 21 (6), 687-699 (2019).
  2. Mackinlay, K. M. L., et al. An in vitro stem cell model of human epiblast and yolk sac interaction. eLife. 10, 63930 (2021).
  3. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical-scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2048, 107-119 (2019).
  4. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192 (2018).
  5. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
  6. Dhar, P., Wu, J. D. NKG2D and its ligands in cancer. Current Opinion in Immunology. 51, 55-61 (2018).
  7. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  8. Rungarunlert, S., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors. World Journal of Stem Cells. 1, 11-21 (2009).
  9. Counting cells using a hemocytometer. abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Tremblay-McLean, A., Coenraads, S., Kiani, Z., Dupuy, F. P., Bernard, N. F. Expression of ligands for activating natural killer cell receptors on cell lines commonly used to assess natural killer cell function. BMC Immunology. 20, 8 (2019).
  12. Inoue, T., Swain, A., Nakanishi, Y., Sugiyama, D. Multicolor analysis of cell surface marker of human leukemia cell lines using flow cytometry. Anticancer Research. 34 (8), 4539 (2014).
  13. Mhatre, S. Rapid flow cytometry based cytotoxicity assay for evaluation of NK cell function. Indian Journal of Experimental Biology. 52 (10), 983-988 (2014).
  14. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  15. Motazedian, A., et al. Multipotent RAG1+ progenitors emerge directly from haemogenic endothelium in human pluripotent stem cell-derived haematopoietic organoids. Nature Cell Biology. 22 (1), 60-73 (2020).
  16. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  17. Yan, Y., et al. Antileukemia activity of a natural killer cell line against human leukemias. Clinical Cancer Research. 4 (11), 2859-2868 (1998).

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 191
मानव विस्तारित संभावित स्टेम कोशिकाओं से प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं का उत्पादन
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Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S.,… More

Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S., Liu, P., Sugimura, R. Generation of Natural Killer Cells from Human Expanded Potential Stem Cells. J. Vis. Exp. (191), e64608, doi:10.3791/64608 (2023).

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